類胡蘿卜素清除自由基的動力學(xué)及體外模擬消化對清除率的影響

劉曉庚，袁 磊，高 梅，胡秋輝，王立峰，劉 琴（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210023）

類胡蘿卜素清除自由基的動力學(xué)及體外模擬消化對清除率的影響

劉曉庚，袁 磊，高 梅，胡秋輝，王立峰，劉 琴
（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210023）

測定不同質(zhì)量濃度類胡蘿卜素在不同溫度條件下清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力；考察經(jīng)人工胃液、腸液及胃液-腸液3 種方法模擬消化后類胡蘿卜素清除DPPH自由基能力的變化情況。結(jié)果表明：反應(yīng)溫度（T）對類胡蘿卜素清除DPPH自由基的速率（k）影響顯著（P＜0.05），T升高，k增大，即k45℃＞k37℃＞k30℃，而對清除率（α）無顯著影響；類胡蘿卜素初始質(zhì)量濃度（ρ）對α影響顯著，ρ升高，α增大，而對k無顯著影響；類胡蘿卜素對DPPH自由基的清除作用符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型；T對半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）、k和半衰期（t1/2）影響顯著，T升高，EC50減小（EC50（45 ℃）＜EC50（37 ℃）＜EC50（30 ℃））、k增大（k45℃＞k37℃＞k30℃）、t1/2減?。╰1/2（45℃）＜t1/2（37℃）＜t1/2（30 ℃））；表觀活化能（Ea）和方程常數(shù)（K0）不受ρ的影響，Ea=17.039 kJ/mol、K0=7.38×106；體外模擬消化后的類胡蘿卜素對DPPH自由基的清除率減小，且底物濃度越大，清除率下降百分比越大，降幅越小；與油脂混合后的類胡蘿卜素經(jīng)體外模擬消化后對DPPH自由基的清除率低于不加油脂組，即脂溶性的類胡蘿卜素與油脂混合后更易被人體消化吸收，但因不同植物油的脂肪酸組成不同，對其消化吸收的影響存在差異。

類胡蘿卜素；動力學(xué)；表觀活化能；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基；模擬腸胃道消化

劉曉庚, 袁磊, 高梅, 等. 類胡蘿卜素清除自由基的動力學(xué)及體外模擬消化對清除率的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 65-73. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611012. http://www.spkx.net.cn

LIU Xiaogeng, YUAN Lei, GAO Mei, et al. Kinetics of free radical scavenging activity of carotenoids and effect of in vitro simulated gastrointestinal digestion on their radical scavenging capacity[J]. Food Science, 2016, 37(11): 65-73. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611012. http://www.spkx.net.cn

類胡蘿卜素作為天然抗氧化劑有預(yù)防心血管疾病、抗衰老、抗癌、保護(hù)視力等功效[1-4]，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。這也使得近年來我國富含類胡蘿卜素的胡蘿卜生產(chǎn)量節(jié)節(jié)攀升，種植面積、產(chǎn)量和出口量超過全球的40%，并居全球第一[5]。

目前類胡蘿卜素抗氧化動力學(xué)缺乏系統(tǒng)研究，而動力學(xué)研究對探明其抗氧化機(jī)理有直接作用。Jiménez-Escrig等[6]發(fā)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)類胡蘿卜素（如番茄紅素、β-胡蘿卜素）與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基反應(yīng)達(dá)到平衡的時間有差異。不同地區(qū)和季節(jié)溫度的差異及實驗原料的不同、固定反應(yīng)時間易對類胡蘿卜素的抗氧化能力造成誤判，因此在評估類胡蘿卜素抗氧化能力和機(jī)理時應(yīng)先進(jìn)行動力學(xué)研究。本研究以胡蘿卜粉中提取的類胡蘿卜素為受試對象，測定不同質(zhì)量濃度類胡蘿卜素在不同的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間條件下清除DPPH自由基的能力，從而確定相關(guān)動力學(xué)參數(shù)；采用人工胃液、腸液及胃液-腸液考察人工模擬消化后類胡蘿卜素清除DPPH自由基能力的變化情況，明確類胡蘿卜素在模擬體液環(huán)境中的真實抗氧化值，為開發(fā)該類功能性食品提供實驗依據(jù)，進(jìn)一步提高類胡蘿卜素的深加工附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將新鮮胡蘿卜洗凈、烘干粉碎后過80 目篩并置于－4 ℃保存。

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（編號7235-40-7）、DPPH、VE、胃蛋白酶（酶活力3 200～4 500 U/mg） 美國Sigma-Aldrich公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT） 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；胰蛋白酶（酶活力＞2 500 U/mg）、膽素 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福臨門一級大豆油、金龍魚精煉一級菜籽油均購自超市；水為自制超純水，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；UV-8000A紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器 金壇榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素的提取及含量的測定

參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行類胡蘿卜素的提取，以紫外光譜法進(jìn)行類胡蘿卜素含量的測定。

1.3.2 類胡蘿卜素清除DPPH自由基能力的測定

參照文獻(xiàn)[8]方法并作如下調(diào)整：稱取DPPH 0.019 7 g，用無水乙醇溶解并定容至50.00 mL作儲備液。取DPPH儲備液10.00 mL稀釋為100 μmol/L DPPH自由基工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

用無水乙醇配制1.3.1節(jié)提取到的類胡蘿卜素樣品，使溶液中β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度分別為70.68、141.36、212.04、282.72 μg/mL。將3.00 mL 100 μmol/L DPPH自由基工作液與1.00 mL樣液混勻，分別在30、37、45 ℃反應(yīng)不同時間后于517 nm波長處測定吸光度。以DPPH自由基清除率（α）和半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）評估類胡蘿卜素樣品清除自由基的能力，其中EC50是指將原始DPPH自由基清除50%所需的類胡蘿卜素質(zhì)量濃度。按下式計算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為加入類胡蘿卜素后反應(yīng)體系的吸光度；Aj為未加DPPH自由基工作液反應(yīng)體系的吸光度；Ac為未加類胡蘿卜素樣液反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.3 體外模擬消化對類胡蘿卜素抗氧化特性的影響

人工體外模擬消化實驗方法參照文獻(xiàn)[9]，并作如下修改。

1.3.3.1 人工胃液模擬消化對類胡蘿卜素抗氧化特性的影響

配制1.00 mg/mL β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0.50、1.00、1.50、2.00 mL β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于試管中，加1.00 mL吐溫-40，35 ℃旋干溶液后依次加生理鹽水（NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%，下同）、人體電解質(zhì)（含0.33% NaCl、0.11% KCl、0.15% CaCl2、0.07% MgCl2和0.05% KH2PO4，下同）和40 mg/mL胃蛋白酶溶液（用0.1 mol/L HCl溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用）各5 mL，用生理鹽水定容至終體積為25.00 mL，再用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，密封避光，于37 ℃水浴中100 r/min振蕩不同時間（10、20、30、40、50、60、70 min），后取樣進(jìn)行DPPH自由基清除實驗。

1.3.3.2 人工腸液模擬消化對類胡蘿卜素抗氧化特性的影響

分別取0.50、1.00、1.50、2.00 mL的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于旋蒸瓶中，加1.00 mL吐溫-40，35 ℃旋干溶液后依次加5.00 mL生理鹽水、5.00 mL人體電解質(zhì)和8.00 mL胰蛋白酶液（以0.1 mol/L NaHCO3溶解，使胰蛋白和膽素質(zhì)量濃度分別為2、12 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用），用生理鹽水定容至25.00 mL，再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，密封避光，于37 ℃水浴中100 r/min振蕩不同時間（20、40、60、80、100、120 min）后進(jìn)行DPPH自由基清除實驗。

1.3.3.3 人工胃液-腸液二步法模擬消化對類胡蘿卜素抗氧化特性的影響

取兩份0.50、1.00、1.50、2.00 mL β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于試管中，分別與不同大豆油、菜籽油混合，加1.00 mL吐溫-40，35 ℃旋干溶液后依次加5.00 mL生理鹽水、5.00 mL人體電解質(zhì)和5.00 mL胃蛋白酶液，用生理鹽水定容至25.00 mL，再用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0，密封避光，于37 ℃水浴中100 r/min振蕩70 min。用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.3，加8.00 mL胰蛋白酶液，再用1 mol/L NaOH逐滴調(diào)節(jié)pH值至7.0，密封避光，于37 ℃水浴中100 r/min水浴振蕩120 min后進(jìn)行DPPH自由基清除實驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

運用SPSS 18.0軟件，采用t檢驗法進(jìn)行差異顯著性分析；運用Origin 8.5軟件作圖。所有實驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的類胡蘿卜素含量

按1.3.1節(jié)方法，測得β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝130.96x－2.299 9（R2＝0.990 4），其中y表示β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度/（μg/mL），x表示吸光度，準(zhǔn)確性高，說明該方法可用來定量檢測樣品中的類胡蘿卜素含量。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得試樣中類胡蘿卜素質(zhì)量濃度為7 068 μg/mL。

2.2 類胡蘿卜素抗氧化動力學(xué)研究

2.2.1 反應(yīng)溫度及類胡蘿卜素質(zhì)量濃度對類胡蘿卜素抗氧化動力學(xué)的影響

圖1A～D分別表示類胡蘿卜素質(zhì)量濃度為282.72、212.04、141.36、70.68 μg/mL時，反應(yīng)溫度（45、37、30 ℃）對類胡蘿卜素清除DPPH自由基動力學(xué)曲線的影響。

圖1 溫度對類胡蘿卜素清除DPPH自由基動力學(xué)的影響Fig. 1 Effect of temperature on the kinetics of DPPH free radical scavenging

圖2A～C分別表示反應(yīng)溫度為45、37、30 ℃時，不同質(zhì)量濃度（282.72、212.04、141.36、70.68 μg/mL）的類胡蘿卜素清除DPPH自由基的動力學(xué)曲線。

圖2 類胡蘿卜素質(zhì)量濃度對清除DPPH自由基動力學(xué)的影響Fig. 2 Effect of initial concentration of carotenoids on the kinetics of DPPH free radical scavenging

綜合分析圖1、2結(jié)果，類胡蘿卜素清除DPPH自由基動力學(xué)的反應(yīng)模式均表現(xiàn)為質(zhì)量濃度及反應(yīng)溫度的雙重依賴關(guān)系（表1）：隨反應(yīng)時間的延長，類胡蘿卜素清除DPPH自由基動力學(xué)曲線均呈先快后慢、逐漸趨緩、最終趨于平衡的趨勢；反應(yīng)溫度對類胡蘿卜素清除DPPH自由基的速率（k）影響顯著（P＜0.05），對清除率（α）無顯著影響；類胡蘿卜素質(zhì)量濃度對k無顯著影響，對α影響顯著。類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力隨反應(yīng)時間的延長而增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到平衡時間時，α趨于某一固定值；類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力隨類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)類胡蘿卜素質(zhì)量濃度增加到某一值時，α也趨于某一固定值；理論上的最大清除率為100%。

表1 類胡蘿卜素清除DPPH自由基動力學(xué)的劑量及反應(yīng)時間雙重依賴結(jié)果Table 1 Kinetic results of DPPH radical scavenging depending on both dose and reaction time

表2為不同反應(yīng)溫度條件下類胡蘿卜素清除DPPH自由基的回歸方程及EC50，即反應(yīng)溫度對EC50影響顯著；回歸方程的精確度高，R2均大于0.98；45 ℃條件下EC50最小，為15.650 μg/mL；其次為37 ℃條件下的EC50為91.275 μg/mL；30 ℃條件下EC50最大，為165.045 μg/mL。

表2 類胡蘿卜素清除DPPH自由基的回歸方程及EC50Table 2 Regression equation and EC50 of DPPH radical scavenging

此外，不同結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素EC50也存在差異，如李海毅[10]報道葉黃素對DPPH自由基的EC50為0.408 μg/mL；袁永成[11]報道番茄紅素對DPPH自由基的EC50為52.62 μg/mL；Jiménez-Escrig等[6]評價6 種類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力，發(fā)現(xiàn)6 種結(jié)構(gòu)相似的類胡蘿卜素的t（EC50）從12～29 min不等。原因可能為不同結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素的活性存在差異；反應(yīng)時間的不同導(dǎo)致對其抗氧化活性的評價造成了誤判。因此，若在不了解抗氧化劑與DPPH自由基反應(yīng)的動力學(xué)機(jī)制的情況下，就簡單將反應(yīng)控制在某一時間內(nèi)，并在相同條件下與其他抗氧化劑的EC50值進(jìn)行比較，可能會造成誤判。

2.2.2 類胡蘿卜素與BHT、VE的清除自由基能力比較分別配制不同質(zhì)量濃度的類胡蘿卜素、BHT和VE溶液，比較3 種抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力，并參照2.2.1節(jié)結(jié)果將反應(yīng)時間固定為30 min。

圖3 類胡蘿卜素與BHT及VE清除DPPH自由基能力比較Fig. 3 Comparison of DPPH radical scavenging activity among carotenoids, BHT and VE

如圖3所示，類胡蘿卜素、BHT和VE這3 種物質(zhì)對DPPH自由基的清除率大小由強(qiáng)到弱為：VE＞類胡蘿卜素＞BHT。當(dāng)質(zhì)量濃度小于80 μg/mL時，類胡蘿卜素對DPPH自由基的清除率顯著低于VE對DPPH自由基的清除率，而當(dāng)質(zhì)量濃度大于80 μg/mL時，類胡蘿卜素對DPPH自由基的清除率與VE對DPPH自由基清除率的差異不顯著，且顯著高于BHT對DPPH自由基的清除率，可見類胡蘿卜素具有良好的DPPH自由基清除能力。

由于類胡蘿卜素的一條較長的共軛不飽和雙鍵鏈形成一個由所有C原子共享的π鍵系統(tǒng)，而π電子系統(tǒng)從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的能量差相對較小，因此類胡蘿卜素具有明顯的同時作為電子供體和受體的特性，這使其具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，易與自由基反應(yīng)形成無害產(chǎn)物或通過破壞自由基鏈反應(yīng)將自由基清除[12]。

2.3 類胡蘿卜素抗氧化動力學(xué)參數(shù)分析

將實驗測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行不同反應(yīng)級數(shù)的模型擬合與分析，以282.72 μg/mL類胡蘿卜素為例，分別以（1－α）-t、ln（1－α）-t、1/（1－α）-t作圖。由圖4可知，在45、37、30 ℃條件下，（1－α）-t擬合曲線的R2分別為0.950 1、0.997 2和0.999 7；ln（1－α）-t擬合曲線的R2分別為0.753 9、0.869 0和0.925 2；1/（1－α）-t擬合曲線的R2分別為0.958 1、0.922 5和0.908 6，即ln（1－α）-t曲線圖的R2最高，擬合度最好。用相同方法考察其余3 組質(zhì)量濃度的類胡蘿卜素，均得到一致的結(jié)果?？梢?，類胡蘿卜素清除DPPH自由基的反應(yīng)動力學(xué)模型屬一級反應(yīng)動力學(xué)模型[13-14]。

圖4 類胡蘿卜素抗氧化動力學(xué)擬合曲線Fig. 4 Kinetic curves of (1-a)-t, ln(1-a)-t and 1/(1-a)-t

根據(jù)圖4求得反應(yīng)速率常數(shù)k，依據(jù)Arrhenius公式（k=K0×exp（－Ea/RT），式中：Ea為表觀活化能/（kJ/mol）；K0為方程常數(shù)；k為速率常數(shù)；R為氣體常數(shù)，8.314 dm3·kPa/（K·mol）；T為絕對溫度/K），以lnk對1/T繪制曲線，得到Ea及K0，并由k計算得半衰期t1/2（此處的半衰期是指清除一半DPPH自由基所需的時間），結(jié)果見表3。k隨反應(yīng)溫度的升高和類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的增大而增大，這說明升溫利于反應(yīng)的進(jìn)行；不同類胡蘿卜素質(zhì)量濃度下Ea和K0雖存在差異，但差異不顯著，故Ea和K0不受類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的影響。反應(yīng)溫度對k影響顯著，即升溫可提高反應(yīng)速率，有利于反應(yīng)的進(jìn)行，t1/2也越小。但并非T越高k就越大，較高的反應(yīng)溫度會破壞類胡蘿卜素的活性結(jié)構(gòu)，從而使k大大降低；反應(yīng)溫度的升高促使EC50降低。

表3 類胡蘿卜素抗氧化動力學(xué)參數(shù)Table 3 Parameters for antioxidant kinetics of carotenoids

2.4 體外模擬消化對類胡蘿卜素抗氧化特性的影響

體外模擬消化模型可預(yù)測食物成分的釋放、食物結(jié)構(gòu)變化等，具有經(jīng)濟(jì)簡便、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點，近年來在食品營養(yǎng)吸收、藥物代謝、食品攝入安全評價等方面越來越受重視[15]。目前對類胡蘿卜素抗氧化性的研究多停留在檢測其化學(xué)抗氧化活性方面，但化學(xué)分析法往往忽略了抗氧化劑在機(jī)體中的攝入狀況、生物利用率及生理代謝等生物指標(biāo)而不能準(zhǔn)確反映抗氧化劑真實的體內(nèi)抗氧化能力。研究消化后類胡蘿卜素的抗氧化特性可為其發(fā)揮功能的機(jī)理研究提供參考依據(jù)。由于脂溶性的類胡蘿卜素難進(jìn)入水相中，而DPPH自由基清除實驗是在水溶性的乙醇體系中反應(yīng)，因此借鑒前人研究成果[16]，選擇吐溫-40乳化類胡蘿卜素。

2.4.1 人工胃液模擬消化類胡蘿卜素

圖5 體外人工胃液模擬消化對類胡蘿卜素清除DPPH自由基的影響Fig. 5 Effect of in vitro artifi cial gastric juice digestion on the DPPH free radical scavenging activity of carotenoids

圖5A～D分別表示質(zhì)量濃度為20、40、60、80 μg/mL的類胡蘿卜素經(jīng)人工胃液模擬消化后清除DPPH自由基的效果。經(jīng)體外胃液模擬消化后，類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力均有所降低，模擬消化時間為60、70 min的類胡蘿卜素DPPH自由基清除率與對照組（0 min）相比差異顯著；類胡蘿卜素的初始質(zhì)量濃度越高，經(jīng)胃液模擬消化后其清除DPPH自由基能力下降的百分點越大，而降幅則越小：20 μg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率從16.18%降至13.48%，降幅16.69%（圖5A）；40 μg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率從37.65%降至34.05%，降幅9.56%（圖5B）；60 μg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率從52.26%降至47.92%，降幅8.31%（圖5C）；80 μg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率從69.88%降至64.45%，降幅7.77%（圖5D）。

2.4.2 人工腸液模擬消化類胡蘿卜素

圖6A～D分別表示質(zhì)量濃度為20、40、60、80 μg/mL的類胡蘿卜素經(jīng)人工腸液模擬消化后清除DPPH自由基的效果。經(jīng)體外腸液模擬消化后，類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力均有所降低，模擬消化時間為120 min的類胡蘿卜素DPPH自由基清除率與對照組（0 min）相比差異顯著；類胡蘿卜素的初始質(zhì)量濃度越高，經(jīng)腸液模擬消化后其清除DPPH自由基能力下降的百分點越大，而降幅則越?。?0 μg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率從18.70%降至14.99%，降幅19.84%（圖6A）；40 μg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率從39.76%降至35.41%，降幅10.94%（圖6B）；60 μg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率從53.83%降至48.75%，降幅9.44%（圖6C）；80 μg/mL類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率從73.87%降至67.51%，降幅8.61%（圖6D）。

圖6 體外人工腸液模擬消化對類胡蘿卜素清除DPPH自由基的影響Fig. 6 Effect of in vitro artifi cial intestinal juice digestion on the DPPH free radical scavenging activity of carotenoids

2.4.3 人工胃液-腸液二步法模擬消化類胡蘿卜素

圖7 體外人工胃液-腸液模擬消化對類胡蘿卜素清除DPPH自由基的影響Fig. 7 Effect of in vitro gastrointestinal digestion on the DPPH free radical scavenging activity of carotenoids

圖7是質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80 μg/mL的類胡蘿卜素與不同種類植物油混合后經(jīng)人工胃液-腸液模擬消化后清除DPPH自由基的效果。20 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)模擬消化后，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)分別為：大豆油組（7.49%）＜菜籽油組（9.02%）＜對照組（不加植物油）（11.39%），與對照組相比，大豆油組和菜籽油組的DPPH自由基清除率分別下降30.64%和20.81%；40 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)模擬消化后，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)分別為：大豆油組（25.17%）＜菜籽油組（27.59%）＜對照組（29.89%），與對照組相比，大豆油組和菜籽油組DPPH自由基清除率分別下降15.79%和7.69%；60 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)模擬消化后，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)分別為：大豆油組（38.23%）＜菜籽油組（40.54%）＜對照組（43.17%），與對照組相比，大豆油組和菜籽油組DPPH自由基清除率分別下降11.44%和6.09%；80 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)模擬消化后，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)分別為大豆油組（53.37%）＜菜籽油組（56.06%）＜對照組（58.81%），與對照組相比，大豆油組和菜籽油組的DPPH自由基清除率分別下降9.25%和4.68%。故得出結(jié)論，類胡蘿卜素經(jīng)體外人工模擬消化后，DPPH自由基清除能力由弱到強(qiáng)的順序為：大豆油組＜菜籽油組＜對照組，與對照組相比，DPPH自由基清除率下降幅度則是大豆油組＞菜籽油組；且大豆油組與對照組具有明顯差異，而菜籽油組與其他兩組的差異不明顯。

與植物油混合后的類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力低于對照組（不加植物油），說明油脂的加入利于類胡蘿卜素的消化吸收，這與“脂類的存在對促進(jìn)類胡蘿卜素的生物利用率具有重要意義”[17]的結(jié)論相符。Prince等[18]也發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素與脂肪同時食用可促進(jìn)人體對類胡蘿卜素的消化吸收，原因是胡蘿卜素脂溶性的特點使之與脂肪同服能促進(jìn)吸收，機(jī)理可能是脂肪的攝入促進(jìn)了膽汁的釋放，進(jìn)而使類胡蘿卜素在腸道內(nèi)形成膠束，促進(jìn)其吸收[19]。不同質(zhì)量濃度類胡蘿卜素中添加不同種類的植物油（大豆油和菜籽油），經(jīng)模擬消化后DPPH自由基清除率為大豆油組＜菜籽油組，即類胡蘿卜素生物利用率為大豆油組＞菜籽油組。Nidhi等[17]也發(fā)現(xiàn)不同植物油對類胡蘿卜素生物利用率影響不同，各種油脂中類胡蘿卜素的生物利用率從大到小依次為橄欖油＞玉米油＞大豆油＞葵花籽油＞花生油＞米糠油＞棕櫚油，推測原因為不同油脂的飽和度及脂肪酸組成對類胡蘿卜素消化率具有影響。大豆油中主要脂肪酸為亞油酸（含量50.84%），其次是油酸（含量20.68%），飽和脂肪酸含量14.92%，不飽和脂肪酸含量80.70%；菜籽油中的主要脂肪酸為油酸（含量51.07%），其次是亞油酸（含量18.03%），飽和脂肪酸含量6.66%，不飽和脂肪酸含量89.24%[20]，即大豆油中以亞油酸為主，菜籽油中以油酸為主，且大豆油中的飽和脂肪酸含量高于菜籽油。故推測造成此現(xiàn)象的原因有：1）飽和脂肪酸含量較高的植物油更能促進(jìn)類胡蘿卜素的吸收。類胡蘿卜素與飽和脂肪酸形成的膠束大小小于與不飽和脂肪酸形成的膠束大小，進(jìn)而利于人體的消化吸收。Gleize等[21]也發(fā)現(xiàn)，飽和度高的椰子油比飽和度低的菜籽油更利于類胡蘿卜素的吸收。2）植物油中亞油酸對類胡蘿卜素消化吸收的影響大于油酸，即多不飽和脂肪酸會增加類胡蘿卜素在食糜中的氧化程度。Clark等[22]也發(fā)現(xiàn)，油脂中的高不飽和脂肪酸會促進(jìn)番茄紅素自身的氧化程度。3）目前關(guān)于促進(jìn)類胡蘿卜素生物利用率的最佳油脂含量仍不確定，但很可能與類胡蘿卜素及油脂的種類有關(guān)[23]。此外，經(jīng)體外人工模擬消化后類胡蘿卜素對DPPH自由基的清除率降幅不是很大，說明類胡蘿卜素被人體消化吸收的量較少，即類胡蘿卜素不易被人體吸收，這與類胡蘿卜素在人體內(nèi)的吸收率較低（3%～34%）的報道相吻合[24]。

圖8 不同體外模擬消化方法對類胡蘿卜素清除DPPH自由基能力的影響Fig. 8 Comparative effects of different in vitro digestion models on theDPPH free radical scavenging activity of carotenoids

圖8 是質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)人工胃液、腸液和胃液-腸液3 種方法模擬消化后清除DPPH自由基的效果。20 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)模擬消化后，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)分別為胃液-腸液模擬組（11.39%）＜胃液模擬組（13.48%）＜腸液模擬組（14.99%）；40 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)模擬消化后，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)分別為胃液-腸液模擬組（29.89%）＜胃液模擬組（34.05%）＜腸液模擬組（35.41%）；60 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)模擬消化后，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)分別為胃液-腸液模擬組（43.17%）＜胃液模擬組（47.92%）＜腸液模擬組（48.75%）；80 μg/mL類胡蘿卜素經(jīng)模擬消化后，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)分別為胃液-腸液模擬組（58.81%）＜胃液模擬組（64.45%）＜腸液模擬組（67.51%）。故得出結(jié)論，類胡蘿卜素經(jīng)人工胃液、腸液和胃液-腸液3 種方法模擬消化后，DPPH自由基清除能力由弱到強(qiáng)的順序為：胃液-腸液模擬組＜胃液模擬組＜腸液模擬組；且胃液-腸液模擬組與其他兩組具有明顯差異。經(jīng)人工胃液、腸液和胃液-腸液3 種方法模擬消化后的類胡蘿卜素對DPPH自由基清除能力減弱。這說明類胡蘿卜素在胃中的消化程度大于在小腸中，可能是由于胃中強(qiáng)酸環(huán)境導(dǎo)致類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定所致；Courraud等[25]也發(fā)現(xiàn)胃液的酸性環(huán)境對類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)的影響極大。經(jīng)胃液-腸液二步法消化后類胡蘿卜素的消化率高于單一步驟的原因可能是在胃液中轉(zhuǎn)化的部分前體物質(zhì)繼續(xù)在腸液中被消化成不具有抗氧化活性的成分。

3 結(jié) 論

類胡蘿卜素對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，當(dāng)類胡蘿卜素質(zhì)量濃度高于80 μg/mL時，其清除DPPH自由基能力與VE相當(dāng)，且高于BHT清除DPPH自由基的能力；反應(yīng)時間對清除速率常數(shù)k影響顯著且表現(xiàn)為：k45℃＞k37℃＞k30℃，但對DPPH自由基清除率（α）影響不顯著；類胡蘿卜素質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率影響顯著且表現(xiàn)為：α（282.72 μg/mL）＞α（212.04 μg/mL）＞α（141.36 μg/mL）＞α（70.68 μg/mL），即在一定范圍內(nèi)類胡蘿卜素質(zhì)量濃度越高，其DPPH自由基清除能力越強(qiáng)，而對k影響不顯著，而當(dāng)類胡蘿卜素質(zhì)量濃度增大到某個臨界值時，DPPH自由基清除率保持穩(wěn)定。由此可見，類胡蘿卜素作為抗氧化劑在30 min內(nèi)可達(dá)到較好的抗氧化效果。

在體溫附近的溫度范圍內(nèi)，類胡蘿卜素清除DPPH自由基的回歸方程分別為：45 ℃：y=8.181x－393.4，EC50為15.650 μg/mL；37 ℃：y=7.922 1x－304.83，EC50為91.275 μg/mL；30 ℃：y=7.899 7x－229.94，EC50為165.045 μg/mL。EC50的變化趨勢與所求的反應(yīng)速率一致。類胡蘿卜素清除DPPH自由基的反應(yīng)符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，具有一級反應(yīng)動力學(xué)的特征，其表觀活化能Ea和方程常數(shù)K0受類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的影響甚微。

經(jīng)模擬消化后的類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力降低，且初始質(zhì)量濃度越高，類胡蘿卜素DPPH自由基清除能力下降越明顯，而降幅越小；加油脂組與不加油脂的對照組相比，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)的順序為：大豆油組＜菜籽油組＜對照組，且大豆油組與對照組呈顯著性差異，而菜籽油組與其他兩組的差異不顯著；人工胃液-腸液二步法與人工胃液、人工腸液一步法相比，DPPH自由基清除率由弱到強(qiáng)的順序為：胃液-腸液模擬組＜胃液模擬組＜腸液模擬組，且胃液-腸液模擬組分別與胃液模擬組、腸液模擬組呈顯著性差異。

雖然類胡蘿卜素人工模擬消化的數(shù)據(jù)與從人體內(nèi)得到的數(shù)據(jù)相近，但人工模擬消化僅是靜態(tài)的、有限因素的模擬，而人體消化是一個受酶濃度、環(huán)境因素、人體體質(zhì)等眾多因素影響的動態(tài)的、極復(fù)雜的過程，因此有許多研究者進(jìn)行了模擬消化體系的改進(jìn)[26-27]，這也是今后值得進(jìn)一步完善的工作。另外，對實驗方法、類胡蘿卜素消化代謝產(chǎn)物及其機(jī)理的探索，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)研究模擬類胡蘿卜素在體內(nèi)攝入和分泌過程等均有待進(jìn)一步探明。

[1] DWYER J H, NAVAB M, DWYER K M, et al. Oxygenated carotenoid lutein and progression of early atherosclerosis: the Los Angeles atherosclerosis study[J]. Circulation, 2001, 103(24): 2922-2927. DOI:10.1161/01.CIR.103.24.2922.

[2] BENDICH A. Carotenoids and the immune response[J]. Journal of Nutrition, 1989, 119(1): 112-115.

[3] ZIEGLER R G. A review of epidemiologic evidence that carotenoids reduce the risk of cancer[J]. Journal of Nutrition, 1989, 119(1): 116-122.

[4] OLIVER J, PALOU A. Hromatographic determination of carotenoids in foods[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 881(1/2): 543-555. DOI:10.1016/S0021-9673(00)00329-0.

[5] Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) statistical yearbook 2014: Europe and Central Asia food and agriculture[EB/OL]. [2014-10-03]. http://www.fao.org/3/a-i3621e.pdf.

[6] JIMéNEZ-ESCRIG A, JIMéNEZ-JIMéNEZ I, SáNCHEZMORENO C, et al. Evaluation of free radical scavenging of dietary carotenoids by the stable radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80(11): 1686-1690. DOI:10.1002/1097-0010(20000901)80:11<1686::AIDJSFA694>3.0.CO;2-Y.

[7] 惠伯棣. 類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2005: 1-20.

[8] MüLLER L, FR?HLICH K, B?HM V. Comparative antioxidant activities of carotenoids measured by ferric reducing antioxidant power (FRAP), ABTS bleaching assay (αTEAC), DPPH assay and peroxyl radical scavenging assay[J]. Food Chemistry, 2011, 129(1): 139-148. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.04.045.

[9] LEMMENS L, van BUGGENHOUT S, van LOEY A M, et al. Particle size reduction leading to cell wall rupture is more important for the β-carotene bioaccessibility of raw compared to thermally processed carrots[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(24): 12769-12776. DOI:10.1021/jf102554h.

[10] 李海毅. 葉黃素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及抗氧化活性評價[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2012: 7-9.

[11] 袁永成. 番茄皮渣中番茄紅素的提取、穩(wěn)定性及其抗氧化性研究[D].無錫: 江南大學(xué), 2011: 14-15.

[12] KARNAUKHOV V N. Caroteniods: recent progress, problems and prospects[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 1990, 95(1): 1-20. DOI:10.1016/0305-0491(90)90241-K.

[13] 張玉軍. 物理化學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 28-30.

[14] TUBARO F, RAPUZZI P, URSIN F. Kinetic analysis of antioxidant capacity of wine[J]. Biofactors, 1999, 9(1): 37-47.

[15] BLANQUET S, ZEIJDNER E, BEYSSACE E, et al. A dynamic artificial gastrointestinal system for studying the behavior of orally administered drug dosage forms under various physiological conditions[J]. Pharmaceutical Research, 2004, 21(4): 585-591. DOI:10.1023/B:PHAM.0000022404.70478.4b.

[16] 顏秀花, 王正武, 劉漢文. O/W型微乳液對β-胡蘿卜素增溶作用[J].食品科技, 2010, 35(2): 40-43.

[17] NIDHI B, BASKARAN V. Infl uence of vegetable oils on micellization of lutein in a simulated digestion model[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2011, 88(3): 367-372. DOI:10.1007/s11746-010-1677-8.

[18] PRINCE M R, FRISOLI J K. β-Carotene accumulation in serum and in skin[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 1993, 57(2): 175-181.

[19] HERDEN E, DIAZ V, SVAMBERG U. Estimation of carotenoids accessibility from carrots determined by an in vitro digestion methodl[J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2002, 56(5): 425-430. DOI:10.1038/sj/ejcn/1601329.

[20] 陳月曉, 馬玉霞, 陸穎, 等. 常見食用植物油中特征性脂肪酸的檢測及鑒別[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2012, 24(4): 301-305.

[21] GLEIZE B, TOUMIAIRE F, DEPEZAY L, et al. Effect of type of TAG fatty acids on lutein and zeaxanthin bioavailability[J]. British Journal of Nutrition, 2013, 110(1): 1-10. DOI:10.1017/ S0007114512004813.

[22] CLARK R M, YAO L, SHE L, et al. A comparison of lycopene and astaxanthin absorption from corn oil and olive oil emulsions[J]. Lipids, 2000, 35(7): 803-806. DOI:10.1007/s11745-000-0589-8.

[23] BOHN T. Bioavailability of non-provitamin a carotenoids[J]. Current Nutrition and Food Science, 2008, 4(4): 240-258. DOI:10.2174/157340108786263685.

[24] CASTENMILLER J J, WEST C E. Bioavailability and bioconversion of carotenoids[J]. Annual Review of Nutrition, 1998, 18(1): 19-38. DOI:10.1146/annurev.nutr.18.1.19.

[25] COURRAUD J, BERGER J, CRISTOL J P, et al. Stability and bioaccessibility of different forms of carotenoids and vitamin A during in vitro digestion[J]. Food Chemistry, 2013, 136(2): 871-877. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.08.076.

[26] ERIC B, ANOUK K, LUCIEN H, et al. Dietary and host-related factors infl uencing carotenoid bioaccessibility from spinach (Spinacia oleracea)[J]. Food Chemistry, 2011, 125(4): 1328-1334. DOI:10.1016/ j.foodchem.2010.09.110.

[27] ERDMAN J W, FAHEY G C, WHITE C B. Effects of purifi ed dietary fiber sources on β-carotene utilization by the chick[J]. Journal of Nutrition, 1986, 116(12): 2415-2423.

Kinetics of Free Radical Scavenging Activity of Carotenoids and Effect of in Vitro Simulated Gastrointestinal Digestion on Their Radical Scavenging Capacity

LIU Xiaogeng, YUAN Lei, GAO Mei, HU Qiuhui, WANG Lifeng, LIU Qin
(Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

The 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity of carotenoids at different concentrations was determined as a function of temperature and changes in this activity after in vitro simulated digestion in artifi cial gastric juice, artifi cial intestinal juice and artifi cial gastrointestinal juice were investigated. The radical scavenging rate constant k was significantly negatively correlated with reaction temperature (P < 0.05), that is, k45℃> k37℃> k30℃. The radical scavenging capacity α was not signifi cantly infl uenced by reaction temperature, but it was signifi cantly positively correlated with initial carotenoids concentration, which did not signifi cantly affect k value. The scavenging reaction was fi tted to a first-order reaction kinetics. EC50, k and half-life t1/2were significantly influenced by reaction temperature and higher temperature resulted in reduced EC50and t1/2, and increased k. The apparent activation energy Eaand the constant K0were not infl uenced by the initial concentration of carotenoids, which were 17.039 kJ/mol and 7.38 × 106, respectively. The radical scavenging capacity of carotenoids was decreased after in vitro gastrointestinal digestion. Moreover, the radical scavenging capacity of carotenoids mixed with oil was lower than that with no oil added, suggesting that fat-soluble carotenoids are more easily digested in oil. The digestion and absorption of carotenoids were signifi cantly infl uenced by different types of oil containing different fatty acid compositions.

carotenoids; kinetics; apparent activation energy; 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical; in vitro gastrointestinal digestion

10.7506/spkx1002-6630-201611012

TS201.1

A

2015-06-22

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（2014-2016）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD37B08）；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工技術(shù)重點實驗室項目（LYPK201301）

劉曉庚（1962—），男，教授，碩士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：lxg_6288@163.com