獼猴桃果膠純化及分子結(jié)構(gòu)信息解析

顧曉俊，金邦荃,*，陳曉楠，李 意，劉春泉（.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 0097；.南京師范大學分析測試中心，江蘇 南京 0097；.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 004）

獼猴桃果膠純化及分子結(jié)構(gòu)信息解析

顧曉俊1，金邦荃1,*，陳曉楠1，李 意2，劉春泉3
（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.南京師范大學分析測試中心，江蘇 南京 210097；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

獼猴桃果膠來源量大，純化后可用于食品制造。解讀和求證它的分子結(jié)構(gòu)信息，為其生物學功能提供理論依據(jù)。本研究將獼猴桃果膠經(jīng)DEAE-Cellulose 52陰離子交換柱純化，采用高效液相凝膠滲透色譜及高效液相離子色譜、紫外光譜和紅外光譜等現(xiàn)代技術(shù)，解析獼猴桃精制果膠組分、分子質(zhì)量、碳鏈一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)官能團。結(jié)果表明，獼猴桃果膠至少包括3 個組分，其中酸性果膠1（AP-A1）分子質(zhì)量524.31 kD，占84.8%，是獼猴桃果膠的主要成分；而中性果膠（AP-N）和酸性果膠2（AP-A2）分子質(zhì)量僅為281.89 kD和273.88 kD。結(jié)構(gòu)解析，AP-A1主要由D-半乳糖和D-木糖聚合而成，指紋區(qū)顯示其碳鏈是由吡喃糖以α-糖苷鍵連接，且特征區(qū)同時存在C＝O和對稱、非對稱—COO基團，屬于典型大分子果膠結(jié)構(gòu)；而AP-N和AP-A2組分中無C＝O結(jié)構(gòu)，且碳鏈中同時兼?zhèn)洇粱颚?糖苷鍵，屬于非典型果膠低聚多糖結(jié)構(gòu)。

純化；分子質(zhì)量；多糖組分；結(jié)構(gòu)域；獼猴桃果膠

顧曉俊, 金邦荃, 陳曉楠, 等. 獼猴桃果膠純化及分子結(jié)構(gòu)信息解析[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 47-51. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611009. http://www.spkx.net.cn

GU Xiaojun, JIN Bangquan, CHEN Xiaonan, et al. Purifi cation and structural elucidation of kiwifrut pectin[J]. Food Science, 2016, 37(11): 47-51. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611009. http://www.spkx.net.cn

隨著中國食品加工業(yè)的快速發(fā)展，大量果蔬殘渣廢棄，一是工業(yè)成本高，二是環(huán)境污染。為此，近年來許多科學家試圖采用各種方法，從果蔬廢棄物中制備出高附加值的工業(yè)或食品原輔料，以期提高食品加工業(yè)效益[1]。

多年研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃（Actinidia）加工廢棄的皮渣中含有豐富的可溶性膳食纖維-果膠（soluble dietary fi berpectin，SDF-P）[2-4]，具有理想的食品和營養(yǎng)工業(yè)利用價值[5]。它的吸附性和膠黏性不但能作為食品增稠劑和穩(wěn)定劑，應用于多種食品制造；而且可作為營養(yǎng)補充劑，改善腸道健康，吸附剩余能量、脂肪和糖等而具有減肥、降糖和降脂等功能[5-7]。

對獼猴桃SDF-P生物學功能的初步了解始于本課題組近5 a的研究，該SDF-P顯著增加小鼠腸蠕動和排便功能，有效改善其腸道健康[6-7]，但對它的功能與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系所知甚少。因此，本實驗希望從獼猴桃SDF-P分子結(jié)構(gòu)信息的角度，解讀其生物學功能的本質(zhì)，以期為研發(fā)新型功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃粗果膠細粉 南京師范大學金陵女子學院功能性食品實驗室自備。

DEAE-Cellulose 52 英國Whatman公司；咔唑（化學純） 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、三氟乙酸、甲醇（均為分析純） 上?；瘜W試劑有限公司；濃硫酸（分析純） 上海中試化工總公司；氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸（分析純） 南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CXG-1電腦恒溫層析柜、Model DBS-100電腦全自動部分收集器、HL-2恒流泵、TH-1000A梯度混合器上海青浦滬西儀器廠；BioTek ELX808酶標儀 上海東風電訊儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；FL-60冷凍干燥機 上海粉體機械有限公司；Nexus670紅外光譜儀 美國尼高力公司；HP1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；HGC-12A氮吹儀南京科捷分析儀器有限公司；UV-6100A紫外分光光度計上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠純化

采用DEAE-Cellulose 52陰離子交換柱對獼猴桃粗果膠進行純化，用NaCl溶液進行梯度洗脫，自動收集器收集洗脫液，并以咔唑比色法跟蹤檢測。將洗脫峰膜透析除鹽，冷凍干燥后獲精制果膠[8-9]。

柱層析條件：層析柱（1.6 cm×40 cm，50 μm）；柱溫25 ℃；上樣質(zhì)量濃度5 mg/mL，上樣量4 mL； 0～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫；洗脫速率1 mL/min；4～6 min/管收集洗脫液。

1.3.2 果膠紫外（ultraviolet，UV）光譜鑒定

以D-半乳糖醛酸（D-galacturonic acid，D-GA）標準品為參照，經(jīng)200～600 nm全程紫外掃描，檢測1 mg/mL獼猴桃SDF-P中D-GA含量[10-11]。

1.3.3 果膠分子質(zhì)量

以不同分子質(zhì)量葡聚糖為標準品，利用高效液相凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測定果膠分子質(zhì)量[12-13]。HPGPC條件：TSK-gel G-4000PWxl凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）；RID示差檢測器；漂移管溫度35 ℃；流動相：雙蒸水；流速：0.6 mL/min；相對濕度：55%。

標準曲線：配制1 000、500、40 kD和10 kD的標準葡聚糖溶液，質(zhì)量濃度為2 mg/mL。分別取2 mL過0.45 μm膜，離心后吸取10 μL上清液進樣。以各分子質(zhì)量葡聚糖出峰時間為橫坐標（X），并以分子質(zhì)量對數(shù)為縱坐標（Y），建立標準曲線回歸方程：Y=－0.255 7X＋5.115 5（R2=0.992 7）。

參照標準曲線比對獼猴桃純果膠出峰時間和峰面積，計算出獼猴桃果膠分子質(zhì)量。

1.3.4 果膠組分

采用離子示差高效液相離子色譜法（high performance liquid ion chromatography，HPLC-ion）進行獼猴桃果膠組分鑒別，并以2 mg/mL D-葡萄糖、2 mg/mL L-鼠李糖、2 mg/mL D-半乳糖和6 mg/mL D-木糖單糖為標準品進行比對[14-15]。

取4 mg果膠于安培瓶中，加入2 mL 2 mol/L的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）封管，100 ℃水浴8 h，冷卻至室溫，利用氮吹儀吹干，再加入1 mL甲醇吹干（重復3 次），最終加入2 mL蒸餾水稀釋，經(jīng)0.45 μm膜過濾后進樣檢測。HPLC-ion條件：色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；RID檢測器；柱溫：50 ℃；流動相：乙腈-雙蒸水（80∶20，V/V）；流速：1 mL/min。

1.3.5 果膠分子高級結(jié)構(gòu)

采用壓片法，1 g果膠與100 g溴化鉀粉末混合并研磨，抽氣5～10 min，于壓片機壓制3 mm厚度片狀，后在400～4 000 cm－1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，獲得果膠分子結(jié)構(gòu)[16-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠的分離純化與鑒定

2.1.1 分離純化結(jié)果

由圖1可知，經(jīng)DEAE-Cellulose 52柱層析分離純化，得到3 個尖銳洗脫峰，且三者峰型較為對稱。將第1洗脫峰命名為獼猴桃中性果膠（Actinidia pectin-neutral，AP-N，15～18 管），再將NaCl洗脫的第2、3洗脫峰分別命名為獼猴桃酸性果膠1（Actinidia pectin-acid 1，AP-A1，48～56 管）和酸性果膠2（Actinidia pectinacid 2，AP-A2，68～72 管）。經(jīng)透析、冷凍干燥后，AP-N、AP-A1和AP-A2的得率分別為5.3%、84.8%和9.9%，表明AP-A1是獼猴桃純果膠主成分。

以洗脫管數(shù)為橫坐標，NaCl濃度為縱坐標，得到NaCl梯度洗脫曲線，見圖1。經(jīng)計算，AP-A1組分的最佳洗脫濃度為0.2 mol/L NaCl，AP-A2組分的最佳洗脫濃度約為0.3 mol/L NaCl。

DEAE-Cellulose 52是常用的陰離子交換劑，其離子交換基團排列疏散且呈弱堿性，對大分子物質(zhì)吸附較弱，可用中性鹽溶液將大分子糖洗脫下來，便于收集[14,18]。本研究采用0～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫果膠；再經(jīng)截留分子質(zhì)量為5 000～14 000 D的透析袋透析，除去精制果膠中剩余鹽分，使果膠純度更高。純化后果膠凍干粉，以備其分子質(zhì)量和高級結(jié)構(gòu)研究。

圖1 獼猴桃果膠DEAE-Cellulose 52洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of kiwifruit pectin on DEAE-Cellulose 52 column

2.1.2 獼猴桃精制果膠純度的紫外鑒定

圖2 2 D-GA（a）與3 種獼猴桃果膠組分（b）的紫外掃描光譜Fig. 2 UV spectra of D-GA (a) and 3 components (b) from kiwifruit pectin

由圖2可知，經(jīng)UV全程掃描，獼猴桃精制果膠的AP-N、AP-A1和AP-A2組分與D-GA的UV光譜十分相似，未見到有蛋白質(zhì)、核酸和多肽等特征峰出現(xiàn)，表明所獲得的精制果膠不含蛋白質(zhì)、核酸和多肽等雜質(zhì)，純度高。UV是近年研究和鑒定大分子有機化合物的重要手段，可根據(jù)不同物質(zhì)的UV特征光譜區(qū)域來加以區(qū)分和鑒別。眾所周知，果膠或植物多糖在紫外光區(qū)無特征吸收波長，而蛋白質(zhì)、核酸和多肽的特征波長處于紫外光區(qū)，分別于280、260 nm和215 nm[8,10,19]。采用UV光譜掃描，初步推斷出本研究制備的獼猴桃精制果膠的純化度高。

2.2 果膠組分與分子質(zhì)量分析

2.2.1 獼猴桃精制果膠分子質(zhì)量

圖3 獼猴桃果膠AP-N（a）、AP-A1（b）、AP-A2（c）3 個組分的HPGPC色譜Fig. 3 HPGPC chromatograms of 3 components from kiwifruit pectin

由HPGPC解析出獼猴桃精制果膠5 個組分并得到它們的分子質(zhì)量。如圖3所示，主成分為AP-A1，僅在9.37 min呈現(xiàn)一尖銳單峰，其分子質(zhì)量524.31 kD，推測為一種酸性果膠多糖。AP-N在10.42 min和16.69 min出現(xiàn)第2個組分，分別命名為AP-NⅠ和AP-NⅡ，前者分子質(zhì)量281.89 kD，推測為中性果膠多糖；后者分子質(zhì)量7.06 kD，且小于10 kD，推測為小分子質(zhì)量多糖。AP-A2分別在10.47 min和16.67 min呈現(xiàn)2 個峰，前者分子質(zhì)量273.88 kD，推測為分子質(zhì)量小于AP-A1的酸性果膠多糖；而后者分子質(zhì)量7.13 kD，推測為小分子質(zhì)量多糖。比較AP-N 和AP-A2的分子質(zhì)量及出峰時間，盡管AP-NⅠ和AP-A2Ⅰ十分接近，但洗脫條件和洗脫峰位置不同；而AP-NⅡ和AP-A2Ⅱ在分子質(zhì)量和出峰時間十分接近，均可能是純化過程中剝離的近似小分子多糖。

不同植物源獲得的果膠分子質(zhì)量有很大差異，多為大分子多聚糖，分子質(zhì)量在50～300 kD之間[20-21]。人們分別研究了胡蘿卜果膠和馬鈴薯果膠的分子質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜果膠分子質(zhì)量高達1 750.63 kD；而馬鈴薯果膠分子質(zhì)量僅為41.16 kD，是一種低聚果膠[11]。本研究中的獼猴桃果膠3 個組分多糖分子質(zhì)量介于上述胡蘿卜和馬鈴薯果膠之間，由273.88 kD和281.89 kD低聚多糖和524.31 kD高聚多糖組成，并含有少量低聚糖。

2.2.2 AP-A1組分鑒定

將獼猴桃果膠主成分AP-A1 TFA水解，進行HPLC-ion組分鑒定，并以4 種單糖作為標準品，進行AP-A1組分解析。由圖4、5可知，AP-A1水解后有2 個組分，出峰時間分別在7.24 min和10.43 min。與4 種標準單糖出峰時間比對，其AP-A1Ⅰ對應的是D-木糖，AP-A1Ⅱ?qū)氖荄-半乳糖。根據(jù)半峰寬計算，得到D-木糖和D-半乳糖相對含量，分別是2.69 mg/mL和8.23 mg/mL，二者比值為1∶3.1，推算出D-木糖占AP-A1總量的1/4，而D-半乳糖占AP-A1總量的3/4，表明AP-A1是由D-半乳糖與D-木糖共同形成的雜多糖聚合物。

圖4 4 種單糖標準品的HPLC-ion色譜Fig. 4 HPLC-ion chromatograms of standard monosaccharides

圖5 AP-A1的HPLC-ion色譜Fig. 5 HPLC-ion chromatogram of AP-A1

2.3 獼猴桃精制果膠高級結(jié)構(gòu)解析

采用Nexus 670紅外光譜儀對果膠的AP-N、AP-A1和AP-A2組分進行紅外掃描，獲得紅外光譜分析，從3 種果膠組分的官能團特征和二級結(jié)構(gòu)特征[22]分別進行解析。

2.3.1 特征頻率區(qū)

圖6 AP-N（a）、AP-A1（b）和AP-A2（c）的紅外光譜分析Fig. 6 IR spectra of AP-N (a), AP-A1(b) and AP-A2 (c)

由圖6可知，AP-N、AP-A1和AP-A2在4 000～1 300 cm－1特征頻率區(qū)的3 430～3 452 cm－1呈現(xiàn)下降的O—H強烈伸縮振動曲線，在2 921～2 939 cm－1處表現(xiàn)出C—H中等強度的伸縮振動。

由圖6b可知，AP-A1果膠主成分包含1 751 cm－1伸縮振動，是由C＝O共振所產(chǎn)生，該雙鍵基團為乙?；蛉┗?；且在1 616 cm－1出現(xiàn)羧基（—COO－）的非對稱共振和1 423 cm－1和1 369 cm－1的—COO－對稱共振，三者共同構(gòu)成了果膠中糖醛酸的特征結(jié)構(gòu)。由此指認AP-A1主成分是果膠，且由于為NaCl中性鹽所洗脫，故歸屬于酸性果膠。

由圖6a、c可知，AP-N和AP-A2紅外圖譜中沒有C＝O伸縮共振，但具備1 643 cm－1和1 635 cm－1的—COO－非對稱共振，并具備1 432 cm－1和1 415 cm－1的—COO－對稱共振，故推測該2 種組分為非典型果膠結(jié)構(gòu)。

2.3.2 指紋區(qū)

紅外光譜指紋區(qū)位于1 300～400 cm－1范圍，主要解讀果膠或多糖糖苷鍵的分子構(gòu)象[23]。

AP-N分別在1 265 cm－1和1 074 cm－1區(qū)域表達C—O或C—H或C—C伸縮共振，由C—C提示為該物質(zhì)中存在大分子糖C骨架，而C—H和C—O可能是糖的側(cè)鏈所產(chǎn)生的振動；906 cm－1和873 cm－1表示為β-糖苷鍵，而821 cm－1和784 cm－1為α-糖苷鍵（圖6a）。

AP-A1僅在1 245 cm－1呈現(xiàn)一個C—O或C—H或C—C伸縮共振，被解讀為C骨架結(jié)構(gòu)和C—O鍵及C—H鍵的共振。1 110、1 064 cm－1和1 020 cm－1處產(chǎn)生3 處吸收峰，被解讀為吡喃糖苷（pyranose）。當吡喃糖中C1與C5的羥基（—OH）或醛基（—C＝O）縮合形成六元環(huán)，即六碳糖，是葡萄糖、甘露糖、半乳糖等己糖的前體[24]。HPLC-ion和紫外鑒定中都曾指出，AP-A1主要是由D-半乳糖縮合組成。當吡喃糖中C1與C4形成五元環(huán)，可形成木糖、核糖、阿拉伯糖等戊糖[25]。前文2.2節(jié)曾指出AP-A1含有D-木糖成分。因此，紅外圖譜中的吡喃糖苷為進一步解讀出AP-A1果膠是由D-半乳糖和D-木糖縮合而成的大分子聚合物。進一步由AP-A1分子中的α-糖苷鍵，產(chǎn)生827 cm－1伸縮共振，表明AP-A1僅具備α-糖苷鍵（圖6b）。

AP-A2在1 143 cm－1呈現(xiàn)與AP-A1相似的伸縮共振，故提示AP-A2中具備基本的大分子糖的C骨架。在881 cm－1有β-糖苷鍵伸縮共振，而無α-糖苷鍵伸縮振動（圖6c）。

3 結(jié) 論

經(jīng)純化，分別得到5.3% AP-N、84.8% AP-A1和9.9% AP-A2這3 種果膠組分，其中AP-A1為主要成分；3 種果膠組分分子質(zhì)量分別是281.89、524.31 kD和273.88 kD，其中AP-N和AP-A2還分別包含7.06 kD和7.13 kD低分子糖類。

色譜和光譜解析，AP-A1在特征區(qū)同時存在C＝O和對稱、非對稱—COO基團，而且在指紋區(qū)以吡喃糖和α-糖苷鍵的形式存在，故被解讀為由D-半乳糖和D-木糖聚合而成的果膠大分子，歸屬于典型果膠結(jié)構(gòu)特征。而AP-N與AP-A2碳鏈同時兼?zhèn)洇?或β-糖苷鍵，且在特征頻率區(qū)缺乏C＝O官能團，推測二者屬于非典型果膠低聚多糖。

綜上所述，獼猴桃中的主成分AP-A1屬經(jīng)典果膠結(jié)構(gòu)，可用作食品工業(yè)中穩(wěn)定劑和增稠劑的新資源；而AP-N與AP-A2為非典型結(jié)構(gòu)果膠，可作為膳食纖維補充劑的功能食品新資源。

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Purifi cation and Structural Elucidation of Kiwifrut Pectin

GU Xiaojun1, JIN Bangquan1,*, CHEN Xiaonan1, LI Yi2, LIU Chunquan3
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. Analysis and Testing Center, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 3. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

Kiwifruits are a rich source of pectin, and purified kiwifruit pectin can be used a food ingredient. In this research, structural characteristics of the pectin molecule were interpreted and confirmed aiming to offer a theoretical basis for the study of its biofunctions. After kiwifruit pectin was purifi ed by DEAE-Cellulose 52 anion exchange column chromatography, its components, molecular weight, primary structure and domains were identified by high performance gel permeation chromatography (HPGPC), high performance liquid chromatography (HPLC), ultraviolet spectroscopy and infrared spectroscopy. The results showed that kiwifruit pectin contained at least three components, neutral pectin (AP-N), acidic pectin 1 (AP-A1) and 2 (AP-A2). AP-A1 was the major component with a molecular weight of 524.31 kD, accounting for 84.8%. Based on structural analysis, AP-A1 was a polymer of D-galactose and D-xylose. Its carbon chain was composed of pyranose with α-glycosidic linkage in the fi ngerprint area. In the characteristic region, there were C=O groups, symmetric and asymmetric -COO groups. Because of these special structure and domains, AP-A1 was assigned to typical macromolecular pectin. AP-N and AP-A2 were the minor components with molecular weights of 281.89 and 273.88 kD, respectively. Their carbon chains were linked by α or β-glycosidic bond without C=O groups. For these reasons, the structures of AP-N and AP-A2 were assigned to atypical pectin polysaccharide.

purifi cation; molecular weight; polysaccharide components; structural domain; kiwifruit pectin

10.7506/spkx1002-6630-201611009

TS207.3

A

2015-07-13

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503142-5）；2011年江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項目（CX（11）2067-1）

顧曉?。?990—），女，碩士研究生，研究方向為功能食品及新資源。E-mail：983731671@qq.com

*通信作者：金邦荃（1956—），女，教授，博士，研究方向為功能食品。E-mail：jinbangquan@njnu.edu.cn