NLRP3炎癥小體在失血性休克大鼠腎臟損傷中的作用

張　強　譚　超，2　李阿興　賀彥平▲.西安一四一醫(yī)院外一科，陜西西安70089；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，陜西西安70032

NLRP3炎癥小體在失血性休克大鼠腎臟損傷中的作用

張強1譚超1，2李阿興1賀彥平1▲
1.西安一四一醫(yī)院外一科，陜西西安710089；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，陜西西安710032

目的探討失血性休克大鼠早期腎臟組織內(nèi)NLRP3炎癥小體信號通路的表達及作用。方法將27只健康雄性SD大鼠按隨機分為假手術(shù)組（對照組）、失血性休克組（實驗組）、失血性休克優(yōu)降糖干預(yù)組（干預(yù)組）。大鼠失血性休克模型完成后24 h監(jiān)測血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平，并分別采用Western blot和rt-PCR方法檢測腎臟皮質(zhì)中NLRP3炎癥小體蛋白的表達和IL-1β、TNF-α的基因表達情況。結(jié)果①實驗組大鼠血清Scr、BUN含量顯著高于對照組（P＜0.01）；干預(yù)組大鼠血清Scr、BUN含量顯著低于實驗組（P＜0.01）。②實驗組大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)NLRP3蛋白表達量顯著高于對照組（P＜0.01）；與實驗組比較，干預(yù)組大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)NLRP3的蛋白含量明顯降低（P＜0.01）。③實驗組大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)IL-1β、TNF-α的mRNA表達量顯著高于對照組（P＜0.01）；干預(yù)組大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)IL-1β、TNF-α的mRNA表達量顯著低于實驗組（P＜0.01）。結(jié)論失血性休克大鼠早期腎功能受損，腎臟皮質(zhì)內(nèi)NLRP3炎癥小體活性增高，炎性反應(yīng)明顯，使用炎癥小體抑制劑優(yōu)降糖后，可顯著抑制NLRP3的活化，降低腎臟炎性反應(yīng)，改善腎功能。

失血性休克；腎臟；炎癥小體；NLRP3；炎癥

失血性休克是臨床常見的急重癥病癥之一，常常由創(chuàng)傷、手術(shù)、交通事故和地震等引起，如治療不當(dāng)或不合理，常常引起重要臟器功能與代謝障礙，而腎臟是最易受累的器官之一［1］。失血性休克后主要引起機體急性循環(huán)功能障礙，導(dǎo)致腎臟微循環(huán)灌注不足以及細(xì)胞功能代謝障礙，機體免疫功能受到抑制，腎臟受到各種因素刺激，很容易產(chǎn)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致腎損傷。休克后快速液體復(fù)蘇是常用的治療方法，但腎臟灌注急劇增加，缺血再灌注反而會進一步加重腎臟的損傷［2-4］。缺血再灌注損傷導(dǎo)致活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，進而進一步擴大炎癥反應(yīng)，加重腎臟損傷［5-7］。據(jù)統(tǒng)計，在ICU病房，大約30%的失血性休克患者伴有腎臟功能損傷，因此闡明失血性休克早期腎臟損傷的機制成為研究重點。研究表明在失血性休克肺損傷的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)血清中和肺組織中的IL-1β表達升高［8-10］，而NLRP3炎癥小體能夠促進IL-1β的活化，因此推測在失血性休克誘導(dǎo)的腎臟損傷早期NLRP3炎癥小體可能也參與介導(dǎo)了其發(fā)生發(fā)展過程。本研究采用經(jīng)典的失血性休克模型，對失血性休克早期腎臟功能及腎臟皮質(zhì)內(nèi)NLRP3炎癥小體的表達及腎皮質(zhì)炎癥水平進行研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物

采用雄性成年SD大鼠，8～9周，體重200～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（軍2012-0007）。在SPF級的實驗條件下，12 h晝夜循環(huán)，室溫25℃左右，為其提供充足的飲水以及進食。

1.2動物分組及大鼠失血性休克模型的建立

實驗前禁食12 h。將領(lǐng)取的動物按照隨機數(shù)表法分為假手術(shù)組（對照組）、失血性休克組（實驗組）、失血性休克優(yōu)降糖干預(yù)組（干預(yù)組），每組各9只。三組試驗用大鼠提前1 d于右側(cè)腹股溝部位脫毛備皮，采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）的麻醉方式麻醉動物，檢測大鼠角膜反射確定大鼠麻醉完好。失血性休克采用經(jīng)典模型［11］，大鼠仰臥放置于恒溫（37±1）℃的工作臺上，用碘酒進行消毒，經(jīng)右側(cè)腹股溝部切口，鈍性分離皮下組織，暴露股動脈、股靜脈和股神經(jīng)，分離出股動脈和股靜脈，用導(dǎo)管PE-50分別對股動脈和股靜脈進行插管，此導(dǎo)管經(jīng)傳感器直接與數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)連接（AD Instruments，Colorado Springs，CO，USA）。

對照組在完成上述手術(shù)后不做相關(guān)失血處理，觀察1.5 h后，結(jié)扎股動脈和股靜脈，拔出導(dǎo)管，縫合切口。

實驗組大鼠在完成上述手術(shù)和檢測后，進行失血處理：通過股靜脈放血，股動脈讀取平均動脈血壓（MAP），從股靜脈放血，放血量為全身的60%左右，10min內(nèi)MAP降到40mmHg，并將血壓控制在35～40mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），維持1.5 h，然后進行復(fù)蘇：股靜脈輸液（林格液），液體量為失血量的3倍，時間約為30min。然后結(jié)扎股動脈和股靜脈，拔出導(dǎo)管，縫合切口，放回動物房正常飼養(yǎng)。

干預(yù)組大鼠在實驗組大鼠失血的基礎(chǔ)上，在補液過程中同時腹腔注射優(yōu)降糖［格列苯脲（SigmaAldrich，MO，USA］30 mg/kg。

1.3腎靜脈血和腎臟皮質(zhì)的提取

三組試驗大鼠正常飼養(yǎng)24 h后采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg），經(jīng)側(cè)腹部（距離腹正中線2 cm）切口，暴露雙側(cè)腎蒂，分離出腎靜脈，取腎靜脈血，后快速取下雙側(cè)腎臟皮質(zhì)，凍存于-80℃冰箱。靜脈血提取后離心，取上層血清，-80℃冰箱凍存。

1.4血清血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）的檢測

取靜脈血后，3000 r/min，4℃環(huán)境下離心10min，分離血清。去各組凍存血清，采用干化學(xué)法測定血清中的血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN），操作按照血肌酐和血尿素氮試劑盒說明書進行。

1.5蛋白質(zhì)免疫印跡（W estern blot）測定炎癥小體NLRP3蛋白水平

取凍存腎臟組織50mg，加組織細(xì)胞裂解液500μL勻漿，提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)，1%BSA室溫封閉1 h。4℃過夜孵育NLRP3（1∶400）抗兔一抗。洗膜后37℃孵育HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶3000）1 h。再次洗膜后化學(xué)發(fā)光、顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)行灰度掃描分析，結(jié)果以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度比值表示。

1.6RT-PCR測定腎臟皮質(zhì)IL-1β、TNF-α的mRNA表達

取各組凍存標(biāo)本，采用實時熒光定量PCR法檢測各組腎臟皮質(zhì)IL-1β、TNF-α的mRNA表達。大鼠IL-1β、TNF-α、GAPDH基因引物序列如表1。

表1　大鼠IL-1β、TNF-α、GAPDH基因引物序列

按照SYBR Green熒光定量試劑盒說明書進行PCR，反轉(zhuǎn)錄體系20μL：SYBR 10μL、上下游引物各1μL、cDNA 1μL、蒸餾水8μL。反應(yīng)條件：初始變性95℃30 s；PCR反應(yīng)變性95℃維持15 s；退火60℃維持30 s；重復(fù)40個循環(huán)。結(jié)果處理采用2-ΔΔCt相對量的方法。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

使用統(tǒng)計作圖軟件GraphPad Prism6進行分析及作圖，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血肌酐和血尿素氮含量變化

實驗組大鼠血肌酐、血尿素氮含量顯著高于對照組（P＜0.01），干預(yù)組大鼠血肌酐、血尿素氮含量與實驗組相比顯著降低（P＜0.01）。實驗結(jié)果提示：缺血性休克對腎臟造成了損傷，而使用炎癥小體抑制劑優(yōu)降糖可以改善失血性休克后腎功能的降低。見表2、圖1。

表2　三組大鼠腎臟功能檢測結(jié)果比較（±s）

表2　三組大鼠腎臟功能檢測結(jié)果比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與實驗組比較，#P＜0.01；BUN：血尿素氮；Scr：血肌酐

組別動物只數(shù)BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）對照組實驗組干預(yù)組9 9 9 5.23±0.54 22.89±1.23*10.19±0.89#30.76±3.88 98.56±13.54*51.08±1.83#

圖1　三組大鼠腎臟功能檢測結(jié)果

2.2失血性休克大鼠雙側(cè)腎皮質(zhì)NLRP3的蛋白表達情況

失血性休克模型24 h后，取材腎臟皮質(zhì)。采用Western blot方法對各組腎臟皮質(zhì)的NLRP3的蛋白水平進行檢測。結(jié)果表明，實驗組腎皮質(zhì)中NLRP3蛋白相對含量（0.43±0.12）顯著高于對照組（0.09±0.04），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），干預(yù)組腎臟皮質(zhì)的NLRP3蛋白含量（0.19±0.02）明顯低于實驗組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果提示炎癥小體NLRP3可能參與了失血性休克造成的腎臟損傷，同時優(yōu)降糖處理可以抑制失血性休克后炎癥小體的活化。見圖2。

圖2　三組大鼠失血性休克后24 h腎臟中NLRP3的蛋白表達

2.3失血性休克大鼠雙側(cè)腎皮質(zhì)中IL-1β、TNF-α的mRNA表達

實驗組大鼠腎皮質(zhì)中IL-1β、TNF-α的mRNA表達量分別為（2.75±0.23）、（2.01±0.34），顯著高于對照組的（1.00±0.09）、（1.00±0.10），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），干預(yù)組大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)IL-1β、TNF-α的mRNA表達量［（1.57±0.09）、（1.21±0.07）］明顯低于實驗組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。說明NLRP3炎癥小體可能是通過促進IL-1β的活化，促進炎性反應(yīng)的發(fā)生，而參與失血性休克后腎損傷的。抑制NLRP3炎癥小體活化對大鼠失血性休克后腎功能保護作用可能是通過降低腎皮質(zhì)的炎癥水平所介導(dǎo)的。

3　討論

失血性休克是一種病情兇險、并發(fā)癥多、易導(dǎo)致多器官功能衰竭的急性危重病癥，其中腎臟是休克時最易受損害的器官之一，常發(fā)生急性腎損傷，甚至是腎功能衰竭。失血性休克后引起腎損傷的原因多種多樣，但失血性休克早期因組織的缺血缺氧和炎性反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的大量活化，是引起失血性休克早期腎損傷的重要原因［12］。NLRP3炎癥小體是一種由多種蛋白構(gòu)成的復(fù)合體，它能使半胱天冬肽酶-1（caspase-1）活化，促進IL-1β由其前體向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變。研究表明其還能夠調(diào)節(jié)caspase-1依賴的細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞在炎癥和應(yīng)激的病理條件下死亡［13］。在心肌組織，之前的研究表明，缺血再灌注損傷后，心肌組織的炎癥小體NLRP3信號通路大量活化［14］。在肺組織，炎癥小體NLRP3參與了失血性休克后的全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS）［8］。多種因素可以激活NLRP3炎癥小體，如內(nèi)源性危險信號，包括線粒體損傷［15］、溶酶體損傷、ATP等，以及病原相關(guān)分子模式［16-17］。與此同時，多種損傷如缺血再灌注損傷、膿毒癥損傷誘導(dǎo)的腎損傷模型中，均發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在其中發(fā)揮重要作用［18-19］。因此筆者根據(jù)之前的研究進行推測炎癥小體NLRP3信號通路有可能參與了失血性休克早期的腎臟損傷。本研究采用經(jīng)典的失血性休克模型，對休克后24 h的大鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)休克組大鼠血肌酐和血尿素氮的水平較對照組明顯升高，表明失血性休克對腎臟的功能造成了損傷，而使用優(yōu)降糖進行干預(yù)，則對失血性休克后腎損傷有保護作用。同時失血性休克組大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)的NLRP3蛋白表達較對照組顯著升高，使用優(yōu)降糖進行干預(yù)的失血性休克大鼠的腎臟皮質(zhì)內(nèi)NLRP3的蛋白表達明顯較未干預(yù)組降低，證明NLRP3可能參與了失血性休克早期腎損傷的過程。而利用優(yōu)降糖進行干預(yù)，能夠顯著降低NLRP3炎癥小體的活化，說明抑制NLRP3炎癥小體的活化對失血性休克后腎損傷有保護作用。

在失血性休克早期，單核/巨噬細(xì)胞等炎癥效應(yīng)細(xì)胞迅速被激活，可促進多種前炎癥細(xì)胞因子的釋放，觸發(fā)一系列的級聯(lián)信號反應(yīng)，進一步釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致多個臟器的損害［20］。NLRP3是一種重要的炎癥因子的啟動子，可活化多種細(xì)胞因子前體使其激活，釋放更多的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，使組織損傷加重，抑制NLRP3的活化可以改善失血性休克后的炎癥。為了探究優(yōu)降糖對失血性休克后腎功能的保護作用機制，我們進一步檢測了失血性休克后腎皮質(zhì)的炎癥水平。

本研究結(jié)果表明，失血性休克后腎皮質(zhì)NLRP3的表達顯著升高，優(yōu)降糖可明顯降低NLRP3的信號通路活化，并逆轉(zhuǎn)腎功能，NLRP3信號通路參與了失血性休克腎損傷的過程，抑制NLRP3信號通路可改善腎臟損傷。因此，本研究為臨床上治療失血性休克早期腎臟損傷提供了新的思路和實驗依據(jù)。

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Effect of NLRP3 inflamm asome in kidney injury of rats after hemorrhagic shock

ZHANG Qiang1TAN Chao1，2LIAxing1HE Yanping1
1.First Department of Surgery，Xi＇an 141st Hospital，Shaanxi Province，Xi＇an 710089，China；2.Department of Urology，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Shaanxi Province，Xi＇an 710032，China

Ob jective To study the expression and effect of NLRP3 inflammasome in hemorrhagic shock rats kidney. Methods 27 ratswere randomly divided into three groups：sham group（control group），hemorrhagic shock group（experiment group），glybenclamide treatment group（intervention group）.Experimental rats were made into hemorrhagic shock model.Serum creatinine（Scr）and blood urea nitrogen（BUN）weremeasured after successfulmodeling 24 h.The protein expression of NLRP3 were examined byWestern blot and themRNA expression of IL-1βand TNF-αwere examined by RT-PCR in the cortex of kidney.Resu lts①The value of Scr and BUN in serum of experiment group were higher than those of control（P＜0.01）.The value of Scr and BUN in serum of intervention group were lower than those of experiment group（P＜0.01）.②The protein expression of NLRP3 in the cortex of kidney of experiment group were significantly higher than that of control group（P＜0.01）.The protein expression of NLRP3 in the cortex of kidney of intervention group were lower than those ofexperiment group（P＜0.01）③ThemRNA expression of IL-1βand TNF-α in the kidney cortex of experiment group were significantly higher than those of control group（P＜0.01）；the IL-1β and TNF-αmRNA expression in the kidney cortex of intervention group was significantly lower than those of experiment group（P＜0.01）.Conclusion Rats with hemorrhagic shock have renal damage，with NLRP3 inflammasome activites and increases inflammatory reaction in the kidney cortex.The use of NLRP3 inflammasome inhibitor glibenclamide，significantly inhibites the activation NLRP3，reduces kidney inflammation，improves kidney features.

Hemorrhagic shock；Kidney；Inflammasome；NLRP3；Inflammation

R459.7

A

1673-7210（2016）06（c）-0029-04

賀彥平（1965.9-），男，主任醫(yī)師；研究方向：腔鏡泌尿外科學(xué)。

（2016-03-25本文編輯：蘇暢）