阿爾茨海默病患者血清中microRNAs表達譜的研究

曾慶宏，劉　霞，周　芳，聶紅霞，于善花，姜建東，王傳淇，彭艷艷，張浩江，莊愛霞

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阿爾茨海默病患者血清中microRNAs表達譜的研究

曾慶宏1，劉霞2，周芳1，聶紅霞1，于善花1，姜建東1，王傳淇1，彭艷艷1，張浩江1，莊愛霞1

目的探討阿爾茨海默病(AD)患者血清中microRNAs與阿爾茨海默病之間的關(guān)系，尋求一種可能作為輔助診斷AD的早期生物標(biāo)志物。方法研究對象分為AD組和對照組，分別取其血清并提取microRNAs，利用microRNA基因芯片檢測出表達差異的microRNAs，并用實時熒光定量PCR(QT-PCR)的方法進行驗證。 結(jié)果基因芯片篩選出43個與AD相關(guān)的差異表達microRNAs(P<0.05),其中microRNA-107及microRNA-222的表達水平在AD患者中均顯著低于對照組(P<0.01)，與QT-PCR驗證結(jié)果一致。結(jié)論MicroRNA-107及microRNA-222可能通過多種途徑影響AD的發(fā)生發(fā)展，有望成為一種輔助診斷AD的早期生物標(biāo)志物。

阿爾茨海默??；microRNAs；microRNA-107；microRNA-222

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為認(rèn)知、語言、記憶等功能障礙[1，2]，日常生活能力進行性減退，并可伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙，是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因。近年來一些新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用，促進了蛋白組學(xué)的研究，基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MSS)[3],高效液相色譜與電感藕合等離子質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)[4]，液相色譜-紫外光譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLCUV-MS)[5，6],鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)[7]等對蛋白的分離、定性和定量的檢測，可能有助于新的AD生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，但仍缺乏特異性和敏感性均高的單一的診斷方法。

microRNA是真核生物中一類長度約為22個核苷酸的參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的單鏈非編碼小分子RNA，主要功能是通過抑制靶mRNA翻譯或促使其降解的方式對基因表達起調(diào)控作用[8]，參與細(xì)胞周期調(diào)控及個體發(fā)育過程[9]。在神經(jīng)系統(tǒng)中microRNA調(diào)節(jié)不同發(fā)育階段及不同部位的病生理條件下神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，并對人類的認(rèn)知和記憶能力的形成起重要作用[10，11]。大量研究表明，血清中存在著穩(wěn)定的microRNAs表達[12，13]。本研究利用μParaflo微流體芯片技術(shù)檢測了AD患者與健康體檢者血清中的microRNAs，并用QT-PCR方法進行驗證，發(fā)現(xiàn)了與AD密切相關(guān)的microRNAs，有望成為AD的生物學(xué)診斷和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。

1　材料與方法

1.1研究對象(1)AD組：選取2013年6月-2015年6月在我院住院及門診就診首次診斷AD的患者30例；(2)設(shè)年齡相匹配的對照組：為正常健康體檢者30例，具有正常功能活動能力，無器質(zhì)性腦病，神經(jīng)系統(tǒng)檢查無異常，MMSE評分在28分以上。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有腦血管疾病者；(2)有顱腦外傷者；(3)有中毒性、代謝性等腦病者；(4)診斷前進行藥物治療者；(5) 有血液系統(tǒng)疾病者；(6)血管性及其他原因所致癡呆；(7)未知情同意者。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)阿爾茨海默病診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2011年美國國家衰老研究所(National Institute of Aging,NIA)和阿爾茨海默病學(xué)會(Alzheimer’s Association,AA)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)(NIA-AA診斷標(biāo)準(zhǔn))。簡易智能精神狀態(tài)量表(MMSE)評分標(biāo)準(zhǔn)：文盲組≤17分，小學(xué)組≤20分，中學(xué)組≤22分，大學(xué)組≤24分。

1.3方法

1.3.1資料收集記錄所有研究對象的性別、年齡、既往史(高血壓、糖尿病、冠心病等)、吸煙史、飲酒史以及纖維蛋白原、高半胱氨酸、C-反應(yīng)蛋白、血脂等指標(biāo)。

1.3.2樣本采集AD組治療前采取靜脈血5 ml，對照組靜脈血來自體檢中心體檢者，所有靜脈血提取血清后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3總RNA提取取100～200 μl低溫冷藏的每例血清樣本，置于冰上融化，且充分混勻。加入3倍體積的Trizol LS到樣本中，在震蕩器上充分混勻，室溫放置5～15 min進行變性處理。按等體積加入氯仿，振蕩器上充分混勻，室溫放置15 min，在4 ℃條件下，14000 r/min離心15 min抽提RNA。

1.3.4芯片檢測抽取每例AD組患者的2 μg總RNA，充分混勻后抽提RNA。使用Poly(A)聚合酶在總RNA 3’端加上Poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標(biāo)記與這個Poly(A)尾巴連接(ligation)用于后續(xù)的熒光標(biāo)記。雜交反應(yīng)利用微循環(huán)泵的循環(huán)作用在μParaflo微流體芯片上過夜進行。在微流體芯片上，每條檢測探針都是由一個化學(xué)修飾核苷酸編碼段或是與其他RNA和一個由聚乙二醇組成的間隔段組成。檢測探針均使用PGR(PhotoGenerated Rea-gent)化學(xué)法進行原位合成。雜交解鏈溫度是通過化學(xué)修飾檢測探針進行平衡。RNA與探針雜交后，與標(biāo)記特異結(jié)合的Cy3和Cy5染料在微流體芯片上循環(huán)流動進行染色。利用激光掃描儀采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件進行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過濾(Locally-Weighted Regression)進行信號歸一化。計算兩種檢測信號的比值(log2轉(zhuǎn)換)和t-test的P值。值<0.05的數(shù)據(jù)為差異性表達數(shù)據(jù)。

1.3.5逆轉(zhuǎn)錄用Taqman microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和microRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物進行microRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作按照ABI的流程，進行部分調(diào)整，總反應(yīng)體系15 μl。

1.3.6QT-PCR檢測根據(jù)芯片結(jié)果分別設(shè)計引物序列，以U6 snRNA作為內(nèi)參，應(yīng)用QT-PCR把兩組患者的表達異常的microRNA進行定量分析，然后進行相互比較。用2-ΔΔCt計算microRNA的表達量,每例樣本重復(fù)檢測3次。

2　結(jié)　果

2.1一般資料結(jié)果AD組30例，男11例，女19例，平均年齡(63.3±11.5)歲；對照組30例，男13例，女17例，平均年齡(62.1±10.6)歲。兩組在性別、年齡及常見危險因素方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性(見表1)。

2.2基因芯片檢測結(jié)果AD組檢測出信號表達大于500的差異microRNAs43條(P<0.05)，對差異表達microRNAs的信號比值進行聚類，可分為上調(diào)組和下調(diào)組，其中與對照組相比上調(diào)33條，下調(diào)10條(見圖1)。

2.3MicroRNA-107QT-PCR結(jié)果選取芯片檢測結(jié)果中差異表達有統(tǒng)計學(xué)意義的microRNA-107，進行QT-PCR驗證。AD組患者血清中microRNA-107較對照組下調(diào)(P<0.01)，與芯片結(jié)果一致(見表2、圖2、圖3)。

2.4MicroRNA-222QT-PCR結(jié)果選取芯片檢測結(jié)果中差異表達有統(tǒng)計學(xué)意義的microRNA-222，進行實時熒光定量PCR 驗證。AD組患者血清中microRNA-222明顯下調(diào)(P<0.01)，與芯片結(jié)果一致(見表3、圖4、圖5)。

表1　 兩組一般資料對比

表2　兩組microRNA-107定量結(jié)果

ΔCt表示同一個樣品目標(biāo)基因和內(nèi)參基因平均Ct值的差值;ΔΔCt表示特定目標(biāo)基因的待檢樣品和校準(zhǔn)樣品ΔCt的差值

表3　兩組microRNA-222定量結(jié)果

圖1　AD組與對照組差異microRNA聚類圖

圖2　microRNA-107擴增曲線及溶解曲線圖

圖3　以M為校準(zhǔn)U6為內(nèi)參microRNA-107基因表達水平

圖4　microRNA-222擴增曲線及溶解曲線

圖5　以M為校準(zhǔn)U6為內(nèi)參microRNA-222基因表達水平

3　討　論

近年來的研究表明，microRNAs與腫瘤、心血管疾病、糖尿病、人類遺傳性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。存在于腦部的microRNAs大約有20%～40%對腦的生長發(fā)育發(fā)揮著重要調(diào)控作用，甚至直接參與了哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞分化以及突觸的形成。還有些microRNAs在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要的作用[14]。Hebert等在AD的轉(zhuǎn)基因小鼠模型里檢測到對AD的影響microRNAs[15]。已有多項研究表明，microRNAs在細(xì)胞實驗中能調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的表達[16，17]及影響Aβ沉積[18]。某些microRNAs促進了Aβ產(chǎn)生，Aβ又可改變microRNAs表達，成為microRNAs網(wǎng)絡(luò)失衡的始發(fā)因子[19]，microRNAs與Aβ之間存在一種極其復(fù)雜的聯(lián)系，在體內(nèi)相互促進相互影響，從而影響著AD的發(fā)生發(fā)展。MicroRNA-125b被證明可引起tau蛋白高度磷酸化，其機制在于靶向抑制磷酸酶DUSP6(dual-specificity phosphatases 6)和PPPlCA而促進tau蛋白磷酸化，研究同時發(fā)現(xiàn)miR-125b可損害小鼠聯(lián)合型學(xué)習(xí)[20]?？梢?，microRNAs從多種機制上參與了AD的發(fā)生。

目前有關(guān)microRNAs在AD患者中的研究少見報道，本研究通過生物芯片技術(shù)檢測了AD患者與正常健康體檢者血清中microRNAs的表達，結(jié)果表明有多種microRNAs表達差異有顯著性。AD組檢測出信號表達大于500的差異microRNAs43條，很多具有差異的microRNA在以往均少見相關(guān)研究報道，特別是差異較大的microRNA-4267、microRNA-30c-1-3p、microRNA-3197、microRNA-6820-5p、microRNA-6865-5p、microRNA-1910-3p等，這些microRNAs在AD發(fā)生發(fā)展中所起的作用還需要進一步的研究。

根據(jù)芯片結(jié)果，選取表達差異的microRNA-107采用QT-PCR進行驗證，證實與芯片結(jié)果一致。本研究QT-PCR結(jié)果表明AD組患者血清中microRNA-107較對照組下調(diào)(P<0.01)。 microRNA-107隸屬于microRNA-107/103家族，與AD的發(fā)生相關(guān)[21]，Nelson發(fā)現(xiàn)AD和輕度認(rèn)知功能障礙的患者中microRNA-107表達水平下降[22]，與本研究結(jié)果一致。microRNA-107可能通過以下相關(guān)機制影響AD的發(fā)生發(fā)展。首先，Wang等[23]對不同階段AD患者腦組織中的RNA進行分析，發(fā)現(xiàn)AD進程中miRNAl07的表達出現(xiàn)不同程度減少，而淀粉蛋白前β位分解酶1(BACEl)表達增加，從而出現(xiàn)相應(yīng)的病理改變，該研究認(rèn)為miRNA107可通過與靶基因BACEl的3’端UTR區(qū)結(jié)合調(diào)控BACEl的表達，繼而增加APP水解后Aβ生成與沉積導(dǎo)致AD的發(fā)生，并可能通過調(diào)節(jié)BACE1參與加速該病的進展；其次，microRNA-107也可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞周期阻滯[24]，并重新進入細(xì)胞周期，重新進入細(xì)胞周期是AD發(fā)病的早期事件甚至發(fā)生在Aβ和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)形成之前[25]，導(dǎo)致AD的發(fā)生。當(dāng)然，microRNA-107影響AD的機制還需要進一步的研究。

QT-PCR結(jié)果表明AD組患者血清中microRNA-222明顯下調(diào)(P<0.01)，與芯片結(jié)果一致。眾所周知，P27kipl是一種細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子，參與AD的發(fā)生、發(fā)展。Wang等觀察AD模型小鼠并與年齡匹配的對照組相比發(fā)現(xiàn)，AD模型小鼠microRNA-222表達下調(diào)，與p27kip1蛋白水平升高相關(guān)，從而指出microRNA-222正是通過影響AD的細(xì)胞周期失調(diào)及p27kip1的表達而參與發(fā)病[26]。Zhang等[27]通過原位雜交與免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)microRNA-222高表達的樣本中有81%出現(xiàn)了PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)的表達水平降低(P<0.001)，與此同時在microRNA-222下調(diào)的樣本中有79%檢測出了PUMA的高水平表達。PUMA是2001年由Yu等人發(fā)現(xiàn)的一個新bcl-2家族成員，其中PUMA-α和PUMA-β因含有BH3結(jié)構(gòu)域而受到了廣泛的研究，該結(jié)構(gòu)域是PUMA蛋白與bcl-2家族其它成員相互作用，發(fā)揮促進神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用的關(guān)鍵因素，調(diào)控bcl-2基因的表達可參與AD的發(fā)病。已有的研究也表明，PUMA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡包括了p53依賴性凋亡通路和p53非依賴性凋亡通路，兩條通路最終都通過誘導(dǎo)線粒體膜電位改變，引起細(xì)胞色素C等凋亡信號因子的釋放，進而激活caspase-3和caspase-9最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，caspase-3和caspase-9水平增加增強表達,從而導(dǎo)致AD的發(fā)生。Ok等的研究證實，caspase介導(dǎo)的APP切割產(chǎn)物與Aβ共定位于AD老年斑中，caspase在調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性Aβ的生成及在AD神經(jīng)元最終的凋亡中有著極其重要的作用。microRNA-222參與AD的發(fā)病也與其在海馬區(qū)域中的含量相比于其他區(qū)域特異性要高有關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，血清中microRNA-107、microRNA-222可能間接反映腦組織內(nèi)的microRNA-107、microRNA-222表達變化，但AD患者血清中表達水平下降的原因和機制尚需進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示microRNA-107、microRNA-222在AD患者中的表達量顯著降低，可能作為AD的一種潛在的生物標(biāo)志物，并且可能成為治療靶點，但microRNA-107、microRNA-222表達水平與AD的診斷是否具有特異性，尚需進一步擴大樣本量進行驗證。

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Study on microRNAs expression in serum of patients with Alzheimer’s disease

ZENGQinghong,LIUXia,ZHOUFang,etal.

(DepartmentofNeurology,TheSecondPeople’sHospitalofLianyungang,Lianyungang22206,China)

ObjectiveTo explore the relationship between microRNAs and Alzheimer’s disease in serum of patients with Alzheimer’s disease,in order to find an early biomarker for diagnosis of AD.MethodsThe study subjects were divided into AD group and control group.MicroRNAs was extracted from serum.The expression of microRNAs was detected by microRNA gene chip,and the method was verified by fluorescence quantitative PCR.Results43 AD related genes were selected to screen the differentially expressed microRNAs gene (P<0.05),and the expression level of microRNA-107 and microRNA-222 was significantly lower in AD patients than in control group (P<0.01),and the results were consistent with gene chipQT-PCR.ConclusionMicroRNA-107 and microRNA-222 may influence the occurrence and development of AD in many ways,which is expected to be an early biomarker for the diagnosis of AD.

Alzheimer’s disease；microRNAs；microRNA-107;microRNA-222

1003-2754(2016)02-0123-05

2015-12-15；

2016-01-29

連云港市科技局課題基金(SH1224)

(1.連云港市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 連云港 222006；2.連云港市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港 222006)

莊愛霞,E-mail：aixiazhuang1965@sina.com

R749.1

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