藍(lán)莓汁抗壞血酸體系非酶褐變反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

馬永強(qiáng)，魏 婧，王 鑫，李秀娟

藍(lán)莓汁抗壞血酸體系非酶褐變反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

馬永強(qiáng)，魏 婧，王 鑫，李秀娟

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

通過構(gòu)建藍(lán)莓汁抗壞血酸非酶褐變體系，測定藍(lán)莓汁在貯藏（4、25 ℃和37 ℃）過程中的相關(guān)指標(biāo)，并相應(yīng)分別用零級、一級和復(fù)合動(dòng)力學(xué)模型擬合。結(jié)果表明：褐變指數(shù)（A420nm）符合復(fù)合動(dòng)力學(xué)模型；貯藏過程中抗壞血酸不斷降解，符合一級動(dòng)力學(xué)模型；5-羥甲基糠醛含量的變化符合零級動(dòng)力學(xué)模型。根據(jù)Arrhenius方程進(jìn)行線性擬合，反映各指標(biāo)隨溫度變化情況，在各貯藏溫度下5-羥甲基糠醛的產(chǎn)生與褐變指數(shù)的變化呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R2≥0.949）。

藍(lán)莓汁；抗壞血酸；非酶褐變；貯藏；動(dòng)力學(xué)

藍(lán)莓（blueberry）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）常綠灌木，是原產(chǎn)于北美洲的一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的越橘類漿果，其果皮呈藍(lán)色或藍(lán)黑色故稱藍(lán)莓[1]。藍(lán)莓果實(shí)為漿果，果肉細(xì)膩，酸甜適度，既可鮮食，也可以加工成果汁飲料、果酒飲品等[2]。目前世界在制作果汁方面不同程度地存在四大技術(shù)難題：果汁褐變、后混濁和二次混濁、營養(yǎng)損耗和芳香物質(zhì)逸散[3]，其中以果汁褐變最為普遍。果汁褐變分為酶促褐變（enzymatic browning）和非酶促褐變（non-enzymatic browning）。而非酶促褐變主要有以下幾種機(jī)制：美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)、抗壞血酸氧化分解、多元酚氧化縮合反應(yīng)[4]。其中抗壞血酸的分解方式分為有氧性及厭氧性分解反應(yīng)。在厭氧性分解反應(yīng)方面，抗壞血酸分解的主要產(chǎn)物為糠醛（furfural）[5]，因此可用5-羥甲基糠醛含量來衡量果汁的褐變程度[6-7]。關(guān)于果汁非酶褐變動(dòng)力學(xué)，國內(nèi)外做了較多的研究。Selen Burburlu等[8]認(rèn)為濃縮蘋果汁在貯藏過程中的非酶褐變都符合零級動(dòng)力學(xué)，Kambo等[9]研究了抗壞血酸/果糖體系的褐變動(dòng)力學(xué)。而有關(guān)藍(lán)莓汁的抗壞血酸非酶褐變反應(yīng)以及動(dòng)力學(xué)研究均未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)莓為原料，主要對藍(lán)莓果汁貯藏過程中抗壞血酸褐變進(jìn)行研究，通過反應(yīng)物消耗、中間產(chǎn)物生成以及褐變指數(shù)建立動(dòng)力學(xué)模型，從而為控制褐變的工藝、提高藍(lán)莓果汁品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓 大興安嶺百盛藍(lán)莓科技開發(fā)有限公司。

抗壞血酸 天津博迪化工股份有限公司；2,6-二氯靛酚 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硫酸氫鈉、無水乙醇 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；乙酸鋅 天津市巴斯夫化工有限公司；草酸 哈爾濱市新達(dá)化工廠；D001強(qiáng)酸大孔苯乙烯系陽離子交換樹脂 上海維塔化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS 224S型分析天平 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；V-5000可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；ZD-2型自動(dòng)電位滴定儀 上海儀田精密儀器有限公司；UV1000單光束紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓汁抗壞血酸非酶褐變體系樣液的制備

藍(lán)莓果→解凍→打漿→加一定量三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）滅酶→離心→用D001陽離子交換樹脂處理上清液（用以去除氨基酸）→即得樣液

所得樣液分別于4、25 ℃和37 ℃條件下貯藏，定期測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 褐變指數(shù)的測定

果汁的褐變度用420 nm波長處的吸光度（A420nm）表示。取適量待測果汁樣品，于9 000 r/min離心20 min，取上清液，測定A420nm值，以水為空白[10-11]。

1.3.3 VC含量測定

采用電位法測定[12-13]。

1.3.3.1 試劑配制

2,6-二氯靛酚溶液：稱取2,6-二氯靛酚鈉鹽50 mg，溶于50 mL熱水中，冷卻后定容至250 mL，過濾后置于棕色瓶中；標(biāo)準(zhǔn)VC液：精確稱取抗壞血酸50 mg，用5 g/100 mL草酸溶解，小心移至250 mL容量瓶中，并加草酸稀釋至刻度，最終質(zhì)量濃度為200 μg/mL。

1.3.3.2 標(biāo)定

精確吸取200 μg/mL的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL于小錐形瓶中，加5 mL 1 g/100 mL草酸溶液，用2,6-二氯靛酚溶液滴定至淡紅色于15 s不褪色為止，即為終點(diǎn)。由此計(jì)算2,6-二氯靛酚溶液滴定度T。

式中：T為1.0 mL 2,6-二氯靛酚相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)/mg；ρ為VC標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V1為吸取VC標(biāo)準(zhǔn)液體積/mL；V2為滴定消耗2,6-二氯靛酚的體積/mL。

1.3.3.3 測定并計(jì)算含量

稱取樣液5.0～10.0 g，加入5 g/100 mL草酸溶液定容至50 mL，過濾，得待測液。吸取5～20 mL待測液于燒杯中，將燒杯放在電磁攪拌器上，杯內(nèi)放入小磁棒，記錄儀與電極的插頭相連接，并將電極插入燒杯內(nèi)，打開記錄儀和攪拌器，然后用2,6-二氯靛酚溶液進(jìn)行滴入，觀察記錄儀上電位的變化。隨著2,6-二氯靛酚的滴入，電位會(huì)逐漸上升，當(dāng)達(dá)到終點(diǎn)時(shí)，電位突然升高，然后很快下降，最高值即為終點(diǎn)，此時(shí)記錄滴定2,6-二氯靛酚溶液消耗毫升數(shù)。

式中：V1為滴定樣品所用2,6-二氯靛酚液的體積/mL；V2為滴定時(shí)吸取樣液體積/mL；V為樣品提取液總體積/mL；T為1 mL 2,6-二氯靛酚相當(dāng)于抗壞血酸毫克數(shù)/mg；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）含量測定

1.3.4.1 溶液的配制

澄清劑Ⅰ，稱取15 g亞鐵氰化鉀溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶。澄清劑Ⅱ，稱取30 g乙酸鋅溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶。

1.3.4.2 樣品測定

取藍(lán)莓汁樣品5 g，用25 mL蒸餾水稀釋溶解后，移入50 mL容量瓶，加入0.5 mL澄清劑Ⅰ、搖勻；再加入0.5 mL澄清劑Ⅱ，搖勻，用蒸餾水定容至刻度。于9 000 r/min離心10 min，吸取上層清夜各5 mL于2 個(gè)10 mL比色管中。在一個(gè)比色管中加入5 mL 0.20 g/100 mL NaHSO3溶液，混勻，為參比液；另一個(gè)比色管中5 mL蒸餾水，混勻，為待測液。用石英比色皿于284 nm和336 nm波長處測定待測樣液的吸光度[14]。

式中：X為藍(lán)莓汁樣品中5-HMF的含量/（mg/100 g）；m為樣品質(zhì)量/g；14.97為換算系數(shù)。

1.3.5 動(dòng)力學(xué)模型分析

對貯藏過程中藍(lán)莓汁的褐變指數(shù)、抗壞血酸、5-HMF的變化用零級、一級和復(fù)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合分析。

式中：C為任意時(shí)間指標(biāo)測定值；C0為該指標(biāo)的起始值；t為時(shí)間/min；k0為零級動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)；k1為一級動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)。

溫度對各指標(biāo)的影響符合Arrhenius等式：

式中：k為平衡常數(shù)；k0為指數(shù)系數(shù)；Ea為活化能/（kJ/mol）；R為氣體常數(shù)，8.314 kJ/（mol·K）；T為絕對溫度/K。

對Arrhenius等式兩邊同時(shí)取對數(shù)可得：

取353、363、373 K時(shí)模型的反應(yīng)常數(shù)k值，以－lnk為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)，則斜率為Ea/R，可計(jì)算出Ea值。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐變指數(shù)的變化

圖1 貯藏過程中藍(lán)莓汁褐變指數(shù)（A42200 nnmm）的變化Fig.1 Changes in browning index (A420nm) in blueberry juice during storage

由圖1可知，在不同貯藏溫度下，藍(lán)莓汁的褐變指數(shù)A420nm有明顯變化。4 ℃條件下貯藏50 d后的藍(lán)莓汁A420nm由0.253增加至0.345，僅為起始值的1.36 倍；25 ℃條件下貯藏50 d后的藍(lán)莓汁A420nm由0.253增加至0.544，為起始值的2.1 倍；37 ℃條件下貯藏50 d后的藍(lán)莓汁A420nm由0.253增加至0.595，為起始值的2.53 倍。這說明，貯藏溫度越高，抗壞血酸非酶褐變越嚴(yán)重。將藍(lán)莓汁褐變指數(shù)與貯藏時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模型擬合，其變化規(guī)律更加符合聯(lián)合動(dòng)力學(xué)模型（表1），在3 個(gè)溫度梯度貯藏下，相關(guān)系數(shù)R2＞0.95，同時(shí)根據(jù)Arrhenius方程對－lnk-1/T進(jìn)行線性擬合，如圖2所示，得出擬合方程為y＝3 985x－10.011（R2＝0.974 8），進(jìn)而計(jì)算出藍(lán)莓汁抗壞血酸非酶褐變（以褐變指數(shù)計(jì)）的活化能為33.13 kJ/mol，小于劉靜[14]研究紅棗濃縮汁（活化能為60.40 kJ/mol）在貯藏過程中的活化能，但與Selen Burdurlu等[8]研究蘋果濃縮汁（活化能為33.7 kJ/mol）相似，通常認(rèn)為反應(yīng)活化能在40～400 kJ/mol范圍內(nèi)，而小于40 kJ/mol時(shí)則認(rèn)為反應(yīng)速率非常大[15]。這說明藍(lán)莓汁在貯藏過程中抗壞血酸非酶褐變反應(yīng)活性高，很容易發(fā)生。

表1 藍(lán)莓汁褐變指數(shù)變化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for browning index change of blueberry juice

圖2 褐變指數(shù)--llnnk對11//T線性擬合曲線Fig.2 Linear fitting curve for -lnk of BI versus 1/T

2.2 抗壞血酸含量的變化

圖3 貯藏過程中藍(lán)莓汁抗壞血酸含量的變化Fig.3 Changes in ascorbic acid content of blueberry juice during storage

VC是果汁的主要營養(yǎng)成分之一，因其兼具酸性和還原性，故極易氧化分解?？箟难嵫趸? 種途徑：有氧分解和無氧分解。由圖3可知，在貯藏過程中，4、25、37 ℃條件下VC含量在開始的5 d內(nèi)下降較快，后來則緩慢減低，這是由于果汁中含有溶氧或貯藏瓶的頂隙中含氧，這主要遵循有氧降解途徑[16]，當(dāng)氧氣消耗到一定程度，且VC降解主要遵循無氧降解，該結(jié)果符合果汁中抗壞血酸的有氧降解反應(yīng)速率高于無氧降解[17]。

由抗壞血酸的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表2）可知，在25、37 ℃條件下，反應(yīng)速率相對明顯加快，這與Klinczak等[18]研究橙汁中抗壞血酸受溫度和貯藏時(shí)間其含量變化的結(jié)果是一致的。同時(shí)可以表明藍(lán)莓果汁在貯藏過程中VC的變化符合一級動(dòng)力學(xué)模型，它能更好地?cái)M合VC變化趨勢。根據(jù)Arrhenius方程對－lnk-1/T進(jìn)行線性擬合（圖4），得出擬合方程為y＝1 866.9x－2.054 6（R2＝0.968 2）。并計(jì)算得出Ea為15.5 kJ/mol，活化能反映了VC降解速率k隨溫度變化的程度，即溫度越高，藍(lán)莓汁中VC降解速率越快。

表2 藍(lán)莓汁抗壞血酸含量（C/C0）變化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters for ascorbic acid content（C/C0）change of blueberry juice

圖4 藍(lán)莓汁中抗壞血酸－llnnk對11//T的線性擬合曲線Fig.4 Linear fitting curve for -lnk of ascorbic acid content of blueberry juice against 1/T

2.3 5-HMF含量的變化

圖5 貯藏過程中藍(lán)莓汁5-HMF含量的變化Fig.5 Changes in 5-HMF content of blueberry juice during storage

5-HMF是美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)和抗壞血酸降解的重要中間產(chǎn)物，它是衡量果汁褐變的重要指標(biāo)[19-20]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的抗壞血酸非酶體系所測得的5-HMF主要是由VC厭氧降解產(chǎn)生的。如圖5所示，在整個(gè)貯藏過程中，4 ℃條件下5-HMF產(chǎn)生很少，這說明低溫不易生成5-HMF。25 ℃和37 ℃條件下5-HMF的形成在前10 d有明顯增長，這是由于VC前期有氧快速分解所導(dǎo)致的，同時(shí)藍(lán)莓汁在后期貯藏中大致經(jīng)歷了兩個(gè)時(shí)期：遲滯期和增長期，可以看出在4 ℃條件下貯藏15～30 d、25 ℃條件下貯藏10～20 d以及37 ℃條件下貯藏15～20 d增長緩慢，其后5-HMF含量逐漸增加進(jìn)入增長期。當(dāng)貯藏50 d時(shí)，4、25 ℃和37 ℃條件下產(chǎn)生的5-HMF含量分別為初始值的2.5、5.5 倍和6.3 倍，這說明溫度越高，5-HMF生成速率越快。

表3 藍(lán)莓汁5-HMF含量（C/C0）變化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters for 5-HMF content（C/C0）change of blueberry juice

根據(jù)藍(lán)莓汁5-HMF（C/C0）變化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表3）可知，零級動(dòng)力學(xué)模型更適于5-HMF在貯藏過程中的變化，這一結(jié)果與菠蘿汁在貯藏過程中5-HMF含量變化符合一級動(dòng)力學(xué)模型的結(jié)果不一致[21]，與Trevor等[22]報(bào)道蘋果汁5-HMF的變化符合零級動(dòng)力學(xué)模型一致。這些差異可能是由于不同果汁構(gòu)建不同體系而引起的。圖6則反映的是藍(lán)莓汁貯藏過程中5-HMF變化速率的對數(shù)值與溫度之間的關(guān)系，其擬合方程為y＝3 496.8x－9.058 5（R2＝0.969 5）。計(jì)算可得活化能Ea＝29.07 kJ/mol，遠(yuǎn)比Resnik等[23]發(fā)現(xiàn)蘋果汁貯藏中非酶褐變的活化能低。因此，溫度越高，越容易發(fā)生抗壞血酸非酶褐變反應(yīng)。

圖6 藍(lán)莓汁中5-HMF－llnnk對11//T的線性擬合曲線Fig.6 Linear fitting curve of -lnk against 1/T for 5-HMF content of blueberry juice

2.4 5-HMF含量與褐變指數(shù)（A420nm）的關(guān)系

5-HMF和褐變指數(shù)是兩項(xiàng)重要品質(zhì)指標(biāo)，同時(shí)5-HMF含量可反映果蔬加工和貯藏過程中的褐變程度[24]。由表4可見，在貯藏過程中，藍(lán)莓汁中的5-HMF含量（y，mg/100 g）和褐變指數(shù)（x）的變化呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均在0.9以上，這說明根據(jù)5-HMF含量的變化可預(yù)測在其對應(yīng)溫度下褐變程度，也可看出隨著5-HMF的積累，對藍(lán)莓汁的抗壞血酸非酶褐變有著顯著的影響。

表4 藍(lán)莓汁貯藏過程中5-HMF含量與褐變指數(shù)的相關(guān)性Table 4 Correlation between 5-HMF and BI during storage

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建藍(lán)莓汁抗壞血酸非酶褐變體系，測定褐變指數(shù)、VC和5-HMF含量，之后通過不同溫度下其含量與時(shí)間的關(guān)系，建立動(dòng)力學(xué)模型并計(jì)算其反應(yīng)速率，其中抗壞血酸降解反應(yīng)符合一級動(dòng)力學(xué)模型，褐變指數(shù)（A420nm）符合復(fù)合動(dòng)力學(xué)模型，5-HMF含量的變化符合零級動(dòng)力學(xué)模型，并分別根據(jù)Arrhenius方程k＝k0exp（－Ea/RT）進(jìn)行線性擬合，得出擬合方程并計(jì)算出相應(yīng)活化能Ea，來反映各個(gè)指標(biāo)反應(yīng)速率隨溫度的變化情況。計(jì)算得到的各指標(biāo)活化能相對較小，這就表明貯藏溫度越高，藍(lán)莓汁發(fā)生抗壞血酸非酶褐變的反應(yīng)活性越高，且容易發(fā)生。與此同時(shí)，對5-HMF和褐變指數(shù)（A420nm）這兩項(xiàng)重要品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行回歸分析，二者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。貯藏溫度越高，抗壞血酸非酶褐變速率越快，因此從某種程度上抑制5-HMF的生成來提高藍(lán)莓汁在貯藏過程中的品質(zhì)有著重要的意義。

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Kinetics of Non-Enzymatic Browning Reaction from Ascorbic Acid Model System of Blueberry Juice

MA Yongqiang, WEI Jing, WANG Xin, LI Xiujuan
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

By building a non-enzymatic browning system containing ascorbic acid from blueberry juice, the relevant indicators of blueberry juice during storage (4, 25 and 37 ℃) were determined and tentatively fitted to zero-order, first-order and composite kinetic models. Browning index (BI; absorbance at 420 nm) complied with a composite kinetic model. The ascorbic acid was constantly degraded during storage, which could be described by a first-order kinetic model, while the 5-HMF content variation followed a composite kinetic model. Linear fitting was conducted using the Arrhenius equation to describe each indicator as a function of storage temperature. The generation of 5-HMF and BI showed good linear relationship (R20.949) at three different storage temperatures.

blueberry juice; ascorbic acid; non-enzymatic browning; storage; kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201601020

TS255.3

A

1002-6630（2016）01-0109-05

馬永強(qiáng), 魏婧, 王鑫, 等. 藍(lán)莓汁抗壞血酸體系非酶褐變反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 109-113. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601020. http://www.spkx.net.cn

MA Yongqiang, WEI Jing, WANG Xin, et al. Kinetics of non-enzymatic browning reaction from ascorbic acid model system of blueberry juice[J]. Food Science, 2016, 37(1): 109-113. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601020. http://www.spkx.net.cn

2015-06-05

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2013G0200）

馬永強(qiáng)（1963—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：qyma163@126.com