殼聚糖修飾脂質體的環(huán)境壓力和體外消化穩(wěn)定性

劉瑋琳，李 羚，魏富強，韓劍眾*

殼聚糖修飾脂質體的環(huán)境壓力和體外消化穩(wěn)定性

劉瑋琳，李 羚，魏富強，韓劍眾*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

以殼聚糖修飾的粗脂質體和納米脂質體為研究對象，通過加速氧化（加熱）、紫外照射-自由基誘導和模擬體外消化等處理后的脂質體平均粒徑、表面電荷、丙二醛含量等的變化，表征殼聚糖修飾的粗脂質體的穩(wěn)定性。結果表明，經過加熱、紫外照射和消化處理后，殼聚糖修飾脂質體的穩(wěn)定性明顯比未修飾的脂質體高，并且殼聚糖的質量濃度越高，脂質體抵抗環(huán)境壓力和體外消化穩(wěn)定性越強。

脂質體；殼聚糖；消化；穩(wěn)定性

http://www.spkx.net.cn

脂質體是由磷脂雙分子層形成的、內部包含水相的封閉囊泡，具有緩釋、細胞親和、組織相容和靶向性等優(yōu)點，已成功應用于生物、醫(yī)藥、化工、農業(yè)等領域[1]。近年來，脂質體在食品中的應用日益受到關注，主要用于包裹營養(yǎng)素、酶、食品添加劑和抗菌劑等[2-5]。然而，脂質體作為一種微粒分散體系，在貯藏過程中易氧化、絮凝，導致粒徑變大和藥物滲漏；而且，脂質體經口攝入后易被小腸中膽鹽、酶等乳化、水解，降低了包埋物的生物利用率[6]。目前通過物理化學作用在脂質體表面修飾蛋白、多糖或其他物質，用以增加脂質體雙層膜結構的穩(wěn)定性和提高芯材的可控性，已成為脂質體研究的新熱點。Zhou Wei等[7]制備了果膠修飾的VC脂質體并評價了其長期貯存的穩(wěn)定性和皮膚滲透性；Liu Weilin等[8]為了提高脂質膜的穩(wěn)定性和防止運載的功能成分中鏈脂肪酸的泄漏，采用層層自組裝靜電沉積技術制備了海藻酸鈉和殼聚糖雙層修飾的納米脂質體，表征了該新型脂質體的物化性質和消化動力學特性。

殼聚糖屬天然高分子多糖，表面帶正電荷，是一種陽離子聚合物，是自然界中繼纖維素后的第二豐富的聚合物[9]。目前，利用殼聚糖修飾脂質體的研究已有報道，如帥武平等[10]制備殼聚糖修飾的脂質體，考察了不同相對分子質量殼聚糖對脂質體性質的影響；Zhao Guodong等[11]研究了運載輔酶Q10和α-硫辛酸的殼聚糖修飾脂質體抗氧化性；Peng Hailong等[12]發(fā)現了N,N-十六烷基羧甲基/膽固醇脂質體可以用于生產含有紅景天或其他生物活性食物成分的功能性食品的潛在載體系統(tǒng)。然而，以往的研究主要關注于修飾脂質體對包埋物性質的提高，而專門研究殼聚糖修飾脂質體的穩(wěn)定性及體外消化特性較少，特別是從特殊人群如嬰兒等消化的角度來探討更是鮮見報道。

本實驗室前期研究發(fā)現，脂質體在模擬體外消化過程中其結構易受小腸中酶、膽鹽等影響，在胃部變化較小[13]。因此，本研究以牛奶脂肪球膜（milk fat globular membrane，MFGM）中提取的磷脂為原料，采用傳統(tǒng)的薄膜分散法制備粗脂質體，并用微孔濾膜處理得到納米脂質體，再用殼聚糖修飾脂質體表面，表征其外觀及物化性質；以平均粒徑、Zeta電位、丙二醛（malondiadehyde，MDA）為指標，通過加速氧化（加熱處理）和紫外照射-自由基誘導，同時從嬰兒這種特殊人群的角度建立體外模擬小腸環(huán)境（成人對照）進行脂質體的模擬消化，研究修飾與未修飾脂質體的結構穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試劑

2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛奶脂肪球膜中提取的磷脂（milk fat globular membrane，MFGM） 新西蘭恒天然公司；膽固醇（C7529）、吐溫-80（V900507）、VE（T3251）、殼聚糖（C8503）、尼羅紅（Nile red）72485、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）46950、胰酶（P1750）、膽鹽（B8631）等 美國Sigma公司；丙二醛檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

721型可見分光光度計 上海光譜有限公司；RE52-98型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；D11971型超純水系統(tǒng)、高速冷凍離心機 美國Thermo公司；Nano-ZS粒度儀 英國Malvern公司；MD ImageXpress Micro高內涵圖像處理系統(tǒng) 美國分子儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖修飾脂質體的制備

1.3.1.1 粗脂質體的制備

參照Liu Weilin等[14]的方法，以MFGM中提取的磷脂為主要原料，采用薄膜分散法制備粗脂質體，步驟如下：將MFGM磷脂、膽固醇、吐溫-80和VE按質量比為6∶1∶1.8∶0.12混合溶解在一定量的無水乙醇中，用恒溫磁力攪拌器在40 ℃攪拌2 h使各成分溶解完全，然后采用旋轉蒸發(fā)儀抽真空除去乙醇形成脂質薄膜，緩緩加入0.05 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS），在低速旋轉條件（60 r/min）條件下充分洗膜約1 h，獲得脂質質量濃度約為8 mg/mL的粗脂質體，制備過程全程避光。

1.3.1.2 納米脂質體的制備

采用0.22 μm的微孔濾膜將粗脂質體過篩處理，分別得到了1、2、4、8、12 次過篩的脂質體溶液，通過平均粒徑的測定，選擇最佳過膜次數。

1.3.1.3 殼聚糖修飾脂質體的制備

分別將粗脂質體和納米脂質體緩慢滴入1 g/L和6 g/L的殼聚糖溶液中，體積比為1∶1，調節(jié)pH值為5.5，得到4 個樣品，分別為：1 g/L殼聚糖修飾納米脂質體a、6 g/L殼聚糖修飾納米脂質體b、1 g/L殼聚糖修飾粗脂質體c和6 g/L殼聚糖修飾粗脂質體d，另外以未修飾的粗脂質體e為對照。

殼聚糖溶液的制備：分別稱取0.05、0.3 g的殼聚糖粉末溶解在50 mL體積分數1%的乙酸溶液中，并用磁力攪拌器于常溫過夜攪拌使其溶解充分，分別用濾紙過濾，獲得澄清透明的1 g/L和6 g/L的殼聚糖溶液。

1.3.2 殼聚糖修飾脂質體的物化性質表征

1.3.2.1 物理性質

分別取樣品a、b、c、d、e稀釋3 倍，使用Malvern粒度分析儀測量平均粒徑、多分散度（polydispersity index，PDI）和Zeta電位。

1.3.2.2 形貌

外觀形貌：取a、b、c、d、e 5 個樣品各裝入潔凈干燥的試管中拍照。

微觀結構：用0.25 mg/mL的Nile red對脂質體染色，染色液與脂質體溶液體積比為1∶20；用2.8 mg/mL的FITC對殼聚糖染色，體積比為1∶25。用高內涵圖像處理系統(tǒng)中的共聚焦功能拍照，觀察脂質體的微觀圖像。

1.3.3 環(huán)境壓力穩(wěn)定性

1.3.3.1 加速氧化（熱處理）穩(wěn)定性

參照Klinkesorn等[15]的方法并做部分修改。取一定量的新鮮樣品a、b、c、d、e分別于70 ℃水浴中避光加熱2 h，同時取同體積的樣品不做加熱處理，于避光條件下保存2 h作為對照，測定加熱前后脂質體的平均粒徑和Zeta電位，另外使用MDA檢測試劑盒測定脂質體磷脂膜的氧化程度。

1.3.3.2 紫外（ultraviolet light，UV）照射穩(wěn)定性

參照Wang Jiayu等[16]的方法并做部分修改。將新制備的a、b、c、d、e樣品分別加入AAPH，采用UV照射30 min，同時以加入AAPH但不進行UV照射的脂質體作為對照，AAPH在體系中的濃度均為0.05 mol/L。測量樣品的平均粒徑和Zeta電位，另外使用MDA檢測試劑盒測定脂質體磷脂膜的氧化程度。

1.3.4 體外小腸消化穩(wěn)定性

1.3.4.1 模擬小腸溶液（simulated intestinal fluid，SIF）的制備

參照Dupont等[17]的方法，配制體外模擬嬰兒和成人的小腸消化液，pH值為7.4，配方如表1所示。

表1 模擬小腸液配方Table 1 Formulations of simulated intestinal fluid

1.3.4.2 消化反應

將a、b、c、d分別與嬰兒和成人SIF溶液混合，體積比為1∶1.5，另取脂質體e分別與嬰兒、成人SIF溶液混合，體積比為1∶3，使得5 種樣品中脂質體均占1/4的體積分數。調節(jié)混合液的pH值為7.4，在37 ℃水浴恒溫搖床（95 r/min）中混勻預熱。胰酶先用相應的SIF溶液溶解，反應開始計時為加入酶的瞬間。當脂質體消化1、5、60、120 min時，分別取樣于95 ℃的恒溫水浴鍋中加熱2 min使酶失活，用于測平均粒徑和Zeta電位。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖修飾脂質體環(huán)境壓力穩(wěn)定性質表征

表2 脂質體的平均粒徑、PDI和Zeta電位TTaabbllee 22 AAvveerraaggee ddiiaammeetteerr,, PPDDII aanndd ZZeettaa ppootteennttiiaall ooff lliippoossoommeess

如表2所示，1 g/L殼聚糖修飾納米脂質體a、6 g/L殼聚糖修飾納米脂質體b、1 g/L殼聚糖修飾粗脂質體c、6 g/L殼聚糖修飾粗脂質體d、未修飾的粗脂質體e這5 種脂質體的平均粒徑和Zeta電位各有不同，說明了脂質體粒徑大小與殼聚糖及其質量濃度有直接關系。未修飾的脂質體平均粒徑最小，呈負電性；隨著修飾在表面的殼聚糖質量濃度增大，粒徑隨之變大，Zeta電位為正值且有所升高。殼聚糖的質量濃度提高可以使脂質體的修飾層厚度增加，導致其粒徑的變大。同時，脂質體本身帶負電，而殼聚糖表面帶正電荷，故正電荷隨著殼聚糖的量增加而有所增大。而PDI值整體較大，說明以薄膜分散法制備的脂質體粒徑分布較不均勻，而當殼聚糖修飾后粒徑分布更加不均勻。張激等[18]也認為薄膜分散法制備得到的脂質體為大多囊脂質體，其所表現出的多分散度較大。

圖1 脂質體的外觀形貌和微觀結構Fig.1 Appearance and ultrastructure of liposomes

由圖1A可知，修飾脂質體和未修飾脂質體的外觀并無明顯的差別，主要可能是脂質體與殼聚糖溶液本身的顏色并無太大差異，肉眼無法觀察到區(qū)別。另外，用高內涵共聚焦功能觀察脂質體的微觀結構（圖1B～1G）。修飾脂質體分內外兩層，外層呈現外層包裹狀的為FITC標記的殼聚糖，內層中空囊泡狀的為Nile red標記的脂質體；而未修飾脂質體只呈現囊泡結構，殼聚糖只為點狀結構。圖1B和1C分別為1 g/L殼聚糖修飾納米脂質體與6 g/L殼聚糖修飾納米脂質體，兩者粒徑差距不大（符合粒徑測量結果）。圖1D和1E分別為1 g/L殼聚糖修飾粗脂質體和6 g/L殼聚糖修飾粗脂質體，由于被修飾的是粗脂質體，因此兩個樣品外觀明顯比1 g/L與6 g/L殼聚糖修飾納米脂質體樣品顆粒大，與粒度儀測量結果吻合。從未修飾脂質體，可以明顯觀察到脂質體小球內部中空結構；從修飾與未修飾的粗脂質體也可以明顯觀察到脂質體的中空結構。而由于納米脂質體粒徑太小、顯微鏡放大倍數有限，較難清晰觀察到脂質體的囊泡結構。單純的殼聚糖（圖1G），并未加脂質體，視野中只有呈現點狀顆粒結構，用于和其他圖作對比。

2.2 環(huán)境壓力穩(wěn)定性研究

圖2 加熱前后脂質體的平均粒徑（A）和Zeta電位（B）變化Fig.2 Changes in average diameter (A) and Zeta potential (B) of liposomes before and after heat treatment

使用Malvern粒徑電位儀測量加熱前后（加速氧化穩(wěn)定性）的殼聚糖修飾脂質體的平均粒徑和Zeta電位。如圖2結果為：a：1 g/L殼聚糖修飾納質體加熱前后粒徑分別為（318.5±4.9） nm和（205.5±2.9） nm，電位分別為（29.4±1.5） mV和（25.8±1.5） mV；b：6 g/L殼聚糖修飾納米脂質體加熱前后粒徑分別為（512.0±11.8） nm和（625.0±22.8） nm，電位分別為（38.4±3.1） mV和（32.0±2.0） mV；c：1 g/L殼聚糖修飾粗脂質體加熱前后粒徑分別為（567.7±36.6） nm和（286.4±7.4） nm，電位分別為（34.1±2.3） mV和（32.9±3.6） mV；d：6 g/L殼聚糖修飾粗脂質體加熱前后粒徑分別為（909.2±24.5） nm和（606.1±29.3） nm，電位分別為（37.0±1.8） mV和（39.4±1.4） mV；e：粗脂質體原液加熱前后粒徑分別為（208.6±4.3） nm和（253.9±12.1） nm，電位分別為（－17.0±1.2） mV和（－18.0±0.7） mV。粗脂質體e在加熱前后，脂質體的Zeta電位整體呈現負電位性，是由于MFGM磷脂制備的脂質體本身在中性環(huán)境帶負電荷；而殼聚糖在pH 5.5時帶正電荷，修飾于脂質體表面后整體電荷呈正值。經熱處理后5 種脂質體樣品電位各有不同程度改變，Thompson等[19]亦發(fā)現脂質體經加熱處理會引起顆粒聚集和粒徑、電位的變化。這可以說明加熱對脂質體結構造成破壞，使殼聚糖和磷脂壁發(fā)生一定程度的降解，導致平均粒徑以及Zeta電位的改變。

圖3 脂質體經AAPH誘導-紫外照射前后的平均粒徑（A）和Zeta電位（B）變化Fig.3 Changes in average diameter (A) and Zeta potentials (B) of liposomes before and after combined treatment with AAPH-induced oxidation and UV irradiation

另外，采用Malvern粒徑電位儀測量AAPH誘導-紫外照射前后的殼聚糖修飾脂質體的平均粒徑和Zeta電位，同時以AAPH誘導氧化但不作紫外處理的脂質體為對照，結果見圖3。a：1 g/L殼聚糖修飾納米脂質體的粒徑分別為（281.0±2.7） nm和（288.4±2.8） nm，電位分別為（17.4±1.4）mV和（18.3±1.4） mV；b：6 g/L殼聚糖修飾納米脂質體的粒徑分別為（269.2±7.4） nm和（276.9±4.6） nm，電位分別為（21.5±1.5） mV和（28.3±3.3） mV；c：1 g/L殼聚糖修飾粗脂質體的粒徑分別為（439.3±19.9） nm和（474.1±20.5） nm，電位分別為（22.9±0.2） mV和（20.9±1.6） mV；d：6 g/L殼聚糖修飾粗脂質體的粒徑分別為（426.7±32.4） nm和（460.5±22.2） nm，電位分別為（23.5±2.0） mV和（24.3±1.2） mV；e：粗脂質體原液的粒徑分別為（384.7±2.9） nm和（268.8±8.5） nm，電位分別為（－3.7±0.5） mV和（－3.4±0.1） mV。經紫外照射后，a、b、c、d脂質體的平均粒徑整體上略微有所增大，但增幅不明顯；而e（粗脂質體）的粒徑卻大幅度減小，表明未修飾的脂質體經AAPH誘導-紫外照射后，脂質膜結構所有變化，穩(wěn)定性較差。賀然等[20]在研究對脂質體穩(wěn)定性影響時提到，AAPH是一種自由基引發(fā)劑，在水溶液中可以自發(fā)產生羥自由基，從而引發(fā)磷脂的氧化，而紫外線可以直接作用于磷脂的脂肪酸側鏈，產生自由基，引發(fā)磷脂氧化反應。Nieto等[21]也有類似報道，指出經AAPH誘導氧化，脂質體的氧化速率明顯加快。這是利用AAPH作為誘導氧化劑加速實驗進程的依據。另外，與加熱前后電位變化趨勢類似，脂質體的Zeta電位在紫外照射后整體呈上升趨勢；a、b、c、d樣品皆為正電位，e樣品為負。

圖4 加熱（A）和AAPH誘導-紫外照射（B）前后的MDA含量變化Fig.4 Changes in malondialdehyde (MDA) of before and after heating (A) and combined treatment with AAPH induced-oxidation and UV irradiation (B)

除平均粒徑與表面電位外，還測量了脂質體在加熱和紫外照射前后MDA含量變化，結果如圖4所示。MDA是非酶系統(tǒng)產生的自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸引發(fā)脂質過氧化作用而產生的脂質過氧化物[22]，其大小可以指示脂質體膜被氧化的程度。從整體上看，脂質體經加熱或紫外處理后MDA值均有所上升。其中，經加熱處理的e（未修飾的粗脂質體）相比于其他樣品，MDA含量大幅提高，說明該脂質體磷脂被氧化的程度較高，穩(wěn)定性較差；低質量濃度的殼聚糖修飾的脂質體較高質量濃度殼聚糖修飾的MDA含量變化大，表明殼聚糖質量濃度高，形成的外保護膜層較厚，對脂質體的磷脂膜保護較明顯。該實驗進一步說明，殼聚糖修飾脂質體可在一定程度上提高其穩(wěn)定性。

2.3 體外小腸消化穩(wěn)定性

圖5 脂質體在模擬嬰兒（A和B）和成人（C和D）小腸液中不同消化時間的平均粒徑和Zeta電位變化Fig.5 Changes in average diameter and Zeta potential of liposomes during simulated infant (A and B) and adult (C and D) SIF digestion

由圖5可知，脂質體在嬰兒小腸環(huán)境中的粒徑比成人中小，Zeta電位都有不同程度的降低，嬰兒的降低幅度比成人小。這說明嬰兒腸道對脂質體的影響小于成人，這是由于成人腸液中含有更高濃度的膽鹽和胰酶。脂質體本身是一種脂質，胰酶中主要為胰蛋白酶、胰淀粉酶與胰脂肪酶，其中的胰脂肪酶是使脂質體結構改變的關鍵。脂肪酶即三?；视王；饷?，可催化底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯，導致腸液環(huán)境對脂質體有較大的破壞性[23]。而殼聚糖為多糖，在外層對脂質體有一定的保護作用，降低了胰酶與脂質的接觸機會，從而減輕了脂質體的破壞程度[24]。Zou Liqiang等[25]研究了殼聚糖修飾納米脂質體在模擬消化環(huán)境中的穩(wěn)定性變化，發(fā)現在胃腸道環(huán)境下的顆粒大小沒有明顯變化，但與模擬腸液混合后立即形成沉淀物，也證明了腸液對脂質體穩(wěn)定性的影響更大。

3 結 論

本研究通過顯微鏡觀察得知脂質體和修飾脂質體已成功制備；殼聚糖修飾與未修飾脂質體經加熱（加速氧化）、AAPH誘導-紫外照射和模擬小腸液體外消化處理結果表明：當脂質體受外界環(huán)境影響時，殼聚糖修飾的脂質體明顯比未修飾的脂質體穩(wěn)定；高質量濃度殼聚糖修飾的脂質體比低濃度殼聚糖修飾的脂質體具有更高的穩(wěn)定性；相比在嬰兒小腸液的消化，脂質體在成人小腸液消化過程中結構變化更為明顯。

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Environmental Stress and in Vitro Digestion Stability of Chitosan-Coated Liposomes

LIU Weilin, LI Ling, WEI Fuqiang, HAN Jianzhong*
(School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China)

Chitosan-modified crude liposomes and nano liposomes were studied for changes in average diameter, surface charge and malondialdehyde content after treatment with accelerated oxidation (heating), UV radiation combined with free radical inducement and in vitro simulated digestion. The results showed that, after each treatment, the stability of the chitosan-coated liposomes was significantly higher than bare liposomes. The higher the concentration of chitosan, the stronger the stability of coated liposomes under environment stress and digestion.

liposomes; chitosan; digestion; stability

10.7506/spkx1002-6630-201601002

TS201.4

A

1002-6630（2016）01-0006-06

劉瑋琳, 李羚, 魏富強, 等. 殼聚糖修飾脂質體的環(huán)境壓力和體外消化穩(wěn)定性[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 6-11.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601002. http://www.spkx.net.cn

LIU Weilin, LI Ling, WEI Fuqiang, et al. Environmental stress and in vitro digestion stability of chitosan-coated liposomes[J]. Food Science, 2016, 37(1): 6-11. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601002.

2015-03-01

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401482）；浙江省教育廳科研項目（Y201432148）；

浙江省食品科學與工程重中之重一級學科開放基金項目（JYTSP20142011）；

浙江工商大學研究生科研創(chuàng)新基金項目（3100XJ1514117）

劉瑋琳（1984—），女，講師，博士，研究方向為營養(yǎng)物及其運載體系的生物利用。E-mail：lwl512@zjgsu.edu.cn

*通信作者：韓劍眾（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品質量安全控制。E-mail：Hanjz@zjgsu.edu.cn