間接免疫熒光技術(shù)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)觀察實驗教學(xué)中的應(yīng)用

王宏剛, 陳成彬, 王春國, 陳　力, 宋文芹, 白艷玲, 張金紅, 劉　方

(南開大學(xué) 生物實驗教學(xué)中心, 天津　300071)

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間接免疫熒光技術(shù)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)觀察實驗教學(xué)中的應(yīng)用

王宏剛, 陳成彬, 王春國, 陳力, 宋文芹, 白艷玲, 張金紅, 劉方

(南開大學(xué) 生物實驗教學(xué)中心, 天津300071)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的觀察實驗一直是“細(xì)胞生物學(xué)實驗”的經(jīng)典教學(xué)內(nèi)容,該實驗的教學(xué)主要采用活體染色的方式來開展。為了提高實驗教學(xué)的效果,將間接免疫熒光技術(shù)應(yīng)用到該實驗的教學(xué)中。在實驗過程中,利用小鼠抗人鈣網(wǎng)蛋白的單克隆抗體和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的熒光二抗對廣泛存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣網(wǎng)蛋白進行標(biāo)記,通過熒光顯微鏡觀察Hela細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本形態(tài)和分布情況。將間接免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)觀察實驗的教學(xué)中,可以讓學(xué)生掌握科研中常用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記技術(shù),提高他們對科研工作的興趣,有助于培養(yǎng)他們的創(chuàng)新思維和科研綜合素質(zhì)。

間接免疫熒光； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； 實驗教學(xué)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種非常重要的細(xì)胞器,擔(dān)負(fù)著細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的重要作用[1]。目前,跟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的科學(xué)研究也非?；钴S[2-4]。對于生命科學(xué)及相關(guān)專業(yè)的本科生來說,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能也是非常重要的知識點。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的顯微觀察一直是“細(xì)胞生物學(xué)實驗”的經(jīng)典教學(xué)內(nèi)容,在傳統(tǒng)的實驗教學(xué)中,主要采用活體染色的方式進行[5]。隨著實驗教學(xué)研究的深入,這種教學(xué)方式逐漸暴露出內(nèi)容單一的缺點,不能適應(yīng)現(xiàn)代實驗教學(xué)的需要。目前,將科研中常用的實驗技術(shù)應(yīng)用到實驗教學(xué)是實驗教學(xué)改革的重要方向[6-9]。按照這一思路,我們采用科研中常用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記方法——間接免疫熒光法對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的觀察實驗進行改革,取得良好的教學(xué)效果,受到學(xué)生的歡迎。

1　實驗材料與試劑

1.1實驗材料

人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞系。

1.2主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、雙抗、胰蛋白酶、PBS緩沖液、2%BSA (PBS緩沖液配制)、4%多聚甲醛、TritonX-100、小鼠抗人鈣網(wǎng)蛋白的單克隆抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的熒光二抗、防熒光淬滅封片劑(含DAPI)。

2　實驗方法

(1) 實驗前一天選擇生長狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞制作細(xì)胞爬片。

(2) 在實驗當(dāng)天取出培養(yǎng)皿中的DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清、1%雙抗)。加入37 ℃預(yù)溫的PBS洗滌3次,每次5 min。吸去PBS,加入4%多聚甲醛溶液對細(xì)胞進行固定。

(3) 15 min后吸去多聚甲醛,加入用37 ℃預(yù)溫的0.1% TritonX-100處理5 min。

(4) 吸去TritonX-100,使用PBS洗滌3次,每次5 min。吸去PBS,用濾紙輕輕吸去片子上的液體,滴加20 μL 2%BSA封閉液,蓋上培養(yǎng)皿蓋,室溫下封閉15 min。

(5) 吸去封閉液,滴加20 μL 1∶200稀釋的小鼠抗人鈣網(wǎng)蛋白的單克隆抗體,蓋上一塊比細(xì)胞爬片略小的封口膜和培養(yǎng)皿蓋,37 ℃孵育20 min。

(6) 用PBS洗滌3次,每次5 min。用濾紙小心吸去片子上的液體,滴加20 μL 1∶500稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗,蓋上封口膜和培養(yǎng)皿蓋,37 ℃孵育20 min。

(7) PBS洗滌3次,每次5 min。孵育結(jié)束后用蒸餾水洗滌片刻,將蓋片風(fēng)干。

(8) 在干凈載玻片上滴加3 μL含有DAPI的防熒光淬滅劑,將長有細(xì)胞的蓋玻片從培養(yǎng)皿中取出,反扣于淬滅劑上。使用熒光顯微鏡觀察,并用冷CCD拍照。

3　實驗結(jié)果

通過熒光顯微鏡可以觀察到經(jīng)紫外線激發(fā)后,被DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光；經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后,被FITC標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣網(wǎng)蛋白發(fā)出綠色熒光。在正常狀態(tài)下,HeLa細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)充滿整個細(xì)胞,并在細(xì)胞核周圍密度較高(見圖1)。

圖1　Hela細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布(100×)

4　討論

4.1教學(xué)注意事項

(1) 在實驗材料的選擇上,建議選擇生長較快、對培養(yǎng)條件要求較低、貼壁生長的細(xì)胞系,以降低實驗材料準(zhǔn)備的難度,提高實驗的教學(xué)效率。

(2) 需要注意細(xì)胞的生長狀態(tài),狀態(tài)不好的細(xì)胞,其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布、結(jié)構(gòu)等特點均會發(fā)生改變,會對實驗結(jié)果造成較大的影響。

4.2教學(xué)組織

(1) 本實驗中,抗體的稀釋倍數(shù)、用量和孵育時間可以根據(jù)課程的學(xué)時數(shù)進行調(diào)整,以求獲得最佳的實驗結(jié)果。

(2) 熒光顯微鏡的數(shù)量及學(xué)生使用熒光顯微鏡的熟練度都會對實驗造成較大的影響,如班級人數(shù)過多,可考慮分組進行實驗,每個組在進行抗體孵育時采用不同的時間,錯開使用熒光顯微鏡的時間。

4.3教學(xué)拓展

通過本實驗的學(xué)習(xí),學(xué)生可以掌握使用間接免疫熒光法標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本方法。在此技術(shù)上,可以拓展開設(shè)其他探究性的實驗內(nèi)容。例如,可以通過對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)記來觀察細(xì)胞周期中不同時期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),可讓學(xué)生掌握細(xì)胞周期中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化情況。還可以選擇一些藥物對細(xì)胞進行處理,然后觀察藥物對細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響。

5　結(jié)語

細(xì)胞核與細(xì)胞器的相關(guān)知識一直是“細(xì)胞生物學(xué)實驗”的經(jīng)典教學(xué)內(nèi)容,在“細(xì)胞生物學(xué)實驗”的教學(xué)體系中占有重要的地位[5,10-11]。隨著教學(xué)改革的推進,傳統(tǒng)的實驗設(shè)計模式已經(jīng)逐漸不能適用現(xiàn)代實驗教學(xué)的需求。如何對這些經(jīng)典的實驗內(nèi)容進行改造,使其重新煥發(fā)活力已經(jīng)成為實驗教學(xué)改革的重要課題。本文以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)觀察實驗為突破口,將科研中常用的實驗技術(shù)引入這些經(jīng)典內(nèi)容的教學(xué)過程,希望能夠借此培養(yǎng)學(xué)生對科學(xué)研究的興趣,提高學(xué)生的創(chuàng)新思維和綜合科研素質(zhì),為他們未來的發(fā)展奠定堅實的基礎(chǔ)[12-13]。

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Application of indirect immune fluorescent technology in experimental teaching of Endoplasmic Reticulum Observation

Wang Honggang, ChenChengbin, Wang Chunguo, Chen Li, Song Wenqin,Bai Yanling, Zhang Jinhong, Liu Fang

(Biological Experimental Teaching Center, Nankai University, Tianjin300071, China)

The experiment ofEndoplasmic Reticulum Observation is always the classical teaching content of Cell Biology experiment, which is carried out byusing vital staining. In order to improve the effect of the experimental teaching, the indirect immunefluorescent technology is applied to the teaching for Endoplasmic Reticulum Observation. In the experiment, by using the antibody monoclonal anti-calreticulin from mouse and FITC-labeledgoat anti-mouse fluorescent secondary antibody, the calreticulin which widely exists in the endoplasmic reticulum is labeled, and the basic shape and distribution of the endoplasmic reticulumin Hela cell are well observed by the fluorescent microscope. Applying the indirect immunefluorescent technology to the teaching of Endoplasmic Reticulum Observation can help our students to learn the technique of endoplasmic reticulum marking which is often used in research, stir up their interest in research work and train their innovative thinking and comprehensive quality of scientific research.

indirect immunefluorescence; endoplasmic reticulum; experimental teaching

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.042

2016-04-01

國家基礎(chǔ)學(xué)科人才培養(yǎng)基金“條件建設(shè)項目”(J1310003)；南開大學(xué)2014年本科一般教學(xué)改革項目“將現(xiàn)代實驗技術(shù)引入本科實驗教學(xué),構(gòu)建‘公能’特色實驗教學(xué)內(nèi)容體系”

王宏剛(1982—),男,山西繁峙,碩士,實驗師,從事“細(xì)胞生物學(xué)實驗”“遺傳學(xué)實驗”教學(xué)

陳成彬(1972—)男,河北冀州,博士,副教授,研究方向為分子細(xì)胞遺傳學(xué),主要從事“細(xì)胞生物學(xué)”“遺傳學(xué)”“細(xì)胞生物學(xué)實驗”教學(xué).E-mail：chencb@nankai.edu.cn

G642.423

A

1002-4956(2016)10-0168-03