全局調(diào)控因子Lrp的表達強化谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸

陳　誠，　李顏顏，　尹良鴻， 胡瑾瑜，　王小元*，3

（1.食品科學與技術國家重點實驗室 江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3.江南大學 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122）

全局調(diào)控因子Lrp的表達強化谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸

陳誠1，2，李顏顏2，尹良鴻2， 胡瑾瑜2，王小元*1，2，3

（1.食品科學與技術國家重點實驗室 江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3.江南大學 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122）

作者研究發(fā)現(xiàn)全局調(diào)控因子Lrp的表達能促進谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸，但對菌體生長有一定影響。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)：Lrp的表達能提高L-纈氨酸合成相關基因ilvA、ilvBN、ilvC、ilvD及轉運相關基因brnFE的轉錄水平，這也許是L-纈氨酸產(chǎn)量提高的原因。實驗還發(fā)現(xiàn)：表達含有點突變（Arg39Trp）的Lrp可以進一步提高谷氨酸棒狀桿菌L-纈氨酸的產(chǎn)量，而且對菌體生長的影響也減??；這種效果在lrp-brnF間隔區(qū)域存在突變的L-纈氨酸生產(chǎn)菌VWB-1中更加明顯。在VWB-1中共表達lrp1和brnFE基因，5 L罐發(fā)酵L-纈氨酸產(chǎn)量達到42.1 g/L，比對照提高了48.9%。

Lrp；調(diào)控；谷氨酸棒狀桿菌；L-纈氨酸

支鏈氨基酸L-纈氨酸（L-valine）在生命代謝中起重要作用，因此被廣泛應用于食品、飼料、化妝品和藥物等領域。谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）作為一種常見的氨基酸工業(yè)生產(chǎn)菌株，也被用于發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸［1］。近年來隨著谷氨酸棒狀桿菌全基因組測序的完成［2］，代謝工程已被用來改造優(yōu)化谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸代謝合成和調(diào)控［3-5］。

全局調(diào)控蛋白Lrp廣泛存在于多種原核微生物中［6］。大腸桿菌（Escherichia coli）Lrp能夠調(diào)控L-纈氨酸合成和轉運的相關基因［7］。谷氨酸棒狀桿菌Lrp可以結合在其編碼基因lrp及其相鄰的支鏈氨基酸轉運蛋白復合體BrnFE的編碼基因brnFE之間的間隔區(qū)域［8］，促進BrnFE表達［9］。在谷氨酸棒狀桿菌中過量表達Lrp和BrnFE可以提高支鏈氨基酸L-異亮氨酸產(chǎn)量［10］，但Lrp對谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸代謝合成及調(diào)控作用尚未見報道。

作者在谷氨酸棒桿菌野生型菌株ATCC13869和L-纈氨酸高產(chǎn)菌株VWB-1中過量表達Lrp，研究其對L-纈氨酸產(chǎn)量的影響及其對L-纈氨酸代謝合成和轉運相關基因的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)VWB-1中Lrp和lrp-brnFE基因間隔序列的突變可提高L-纈氨酸產(chǎn)量，并通過在VWB-1中共同表達lrp和brnFE基因，提高了L-纈氨酸發(fā)酵水平。

1　材料與方法

1.1菌株和培養(yǎng)基

本研究所用菌株和載體見表1。大腸桿菌E.coli JM109使用LB培養(yǎng)基 （酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉18 g/L）在 37℃培養(yǎng)。谷氨酸棒狀桿菌 C.glutamicum ATCC13869使用LBG培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基加入5 g/L葡萄糖）在30℃培養(yǎng)。菌株C.glutamicum VWB-1為作者所在實驗室篩選得到的L-纈氨酸高產(chǎn)菌株，使用LBGB培養(yǎng)基 （LBG培養(yǎng)基加入18.5 g/L腦心浸液）在30℃培養(yǎng)。C.glutamicum電轉恢復培養(yǎng)基使用LBHIS培養(yǎng)基（蛋白胨5 g/L，酵母提取物2.5 g/L，NaCl5 g/L，D-山梨醇91 g/L，腦心浸液18.5 g/L；固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉15 g/L）。必要時添加抗生素卡那霉素和氯霉素，質(zhì)量濃度為30μg/mL。pJYW-3是基于載體 pEC-XK-99E構建的 E.coli和C.glutamicum穿梭表達載體，pJYW-4是含tac啟動子的pJYW-3［11］。

表1　本研究所用菌株和載體Table 1　Strains and p lasm ids used in this study

1.2各種新載體和基因重組菌的構建

本研究所用引物序列及相關信息見表2。引物主要依據(jù)C.glutamicum ATCC13032基因組序列［2］設計，LF1突變相關引物LF1-F/LF1-R根據(jù)VWB-1測序結果設計。

表2　本研究所用引物Table 2　Primers used in this study

續(xù)表2

以C.glutamicum ATCC13869和VWB-1的基因組為模板擴增lrp和brnFE基因。VWB-1來源的lrp（記為 lrp1）基因編碼的 Lrp1蛋白相比于ATCC13869來源的Lrp有一個點突變Arg39Trp。以lrp-F和lrp-R為引物擴增基因lrp和lrp1，Bam HI和Eco RI酶切純化后連接pJYW-4，得到pJYW-4-lrp和pJYW-4-lrp1。以brnFE-F和brnFE-R為引物擴增基因brnFE、Bam HI和Eco RI，酶切純化后連接pJYW-4，得到pJYW-4-brnFE。以pJYW-4-brnFE為模板，以brnFE-tac-F和brnFE-R為引物擴增得到帶有tac啟動子和brnFE基因的片段，Eco RI酶切純化后連接pJYW-4-lrp和pJYW-4-lrp1，得到pJYW-4-lrp-brnFE和pJYW-4-lrp1-brnFE。

以載體pDXW-11［12］為模板，cat-F和cat-R為引物，擴增得到包含3個終止子和SD序列但不含啟動子的氯霉素抗性基因cat，BstZ17 I和Pst I酶切純化后連接pJYW-3，得到啟動子檢測載體pJYW-3-cat。采用相同方法將cat基因連接到pJYW-4、pJYW-4-lrp和pJYW-4-lrp1，分別得到pJYW-4-cat、pJYW-4-lrp-cat和pJYW-4-lrp1-cat。

以C.glutamicum ATCC13869和VWB-1基因組為模板，LF-1和LF-2為引物，擴增得到包含lrp-brnF間隔區(qū)域的片段，測序發(fā)現(xiàn)兩個來源的lrp-brnF間隔區(qū)域序列存在差異。分別以LF-F/LFR和 LF1-F/LF1-R為引物， 直接退火得到ATCC13869和VWB-1來源的lrp-brnF間隔片段，并引入Aat II和Bam HI粘性末端，記為LF和LF1。為檢測LF和LF1的啟動子活性，將LF和LF1連接pJYW-3-cat，得到pJYW-3-LF-cat和pJYW-3-LF1-cat。為研究lrp和lrp1對LF和LF1活性的影響，將構建的lrp和lrp1片段交錯連接pJYW-3-LF-cat和pJYW-3-LF1-cat，得到4個載體pJYW-3-LF-lrp-cat，pJYW-3-LF-lrp1-cat，pJYW-3-LF1-lrp-cat和pJYW-3-LF1-lrp1-cat。

構建的新載體均轉入E.coli JM109進行保存和擴增，見圖1。大腸桿菌感受態(tài)的制備和轉化參照文獻［13］。谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869感受態(tài)的制備和電轉參照文獻 ［14-15］；VWB-1電轉化方法為電擊2次并在46℃水浴6min。

1.3谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)基和發(fā)酵條件

1.3.1種子培養(yǎng)基30 g/L葡萄糖，5 g/L（NH4）2SO4，5 g/L尿素，1 g/L KH2PO4，0.04 g/L FeSO4，0.07 g/L MnSO4，0.1 g/L MgSO4，0.7 g/L甲硫氨酸，0.2 mg/L生物素，0.05 mg/L VB1，60 g/L大豆浸出汁。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)基120 g/L葡萄糖，40 g/L（NH4）2SO4，1 g/L KH2PO4，0.04 g/L FeSO4，0.07 g/LMnSO4，0.1 g/L MgSO4，0.7 g/L甲硫氨酸，0.3mg/L生物素，0.05mg/L VB1，10 g/L大豆浸出汁。

1.3.3搖瓶發(fā)酵將凍存于甘油管的菌種接種于LBHIS平板，30℃活化48 h。將一環(huán)培養(yǎng)物接種于裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶，18 h后轉接至裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶，初始OD562控制為1.0，30℃、200 r/min發(fā)酵96 h。發(fā)酵過程另加20 g/L CaCO3控制pH，30 mg/L卡那霉素保持載體。

圖1　本研究所構建的載體Fig.1　Plasm ids constructed in this study

1.3.45 L罐發(fā)酵同樣條件培養(yǎng)200mL種子，接入裝有2 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐 （Biostat B，Germany）。發(fā)酵過程中pH通過補加NH4OH自動控制為7.2，溫度保持30℃，通過調(diào)節(jié)攪拌轉速（0 h，200 r/min；12～96 h，提高到600 r/min）和通氣量（1.5 vvm）控制溶氧在30%，發(fā)酵液葡萄糖質(zhì)量濃度低于60 g/L時流加葡萄糖溶液。每隔12小時取樣，發(fā)酵96 h。

1.4各種參數(shù)分析方法

1.4.1發(fā)酵過程參數(shù)分析L-纈氨酸和其他氨基酸含量通過高效液相色譜（AgilentTechnologies 1200 series，USA）測定［16］；發(fā)酵液葡萄糖含量采用文獻［17］方法測定；OD562采用紫外分光光度計（UV-1800，日本島津公司）測定；細胞干重采用公式

DCW（g/L）=0.649 5×OD562-2.792 5計算［10］。

1.4.2實時定量熒光PCR分析相關基因轉錄水平差異通過實時定量熒光 PCR分析儀（Applied Biosystems，San Mateo，CA，USA）定量檢測。總RNA的提取、純化、反轉錄和PCR采用文獻［18］的方法，所用引物見表2。不同谷氨酸棒狀桿菌菌體收集時間根據(jù)各自發(fā)酵過程中達到對數(shù)中后期的時間確定［10］，選擇 16srRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)處理采用Nolden方法［19］。

1.4.3氯霉素抗性基因cat活性分析96孔板測定氯霉素的最小抑菌濃度（MIC）測定參照Pendlenton方法［20］。在較低氯霉素濃度時為獲得較精確的結果，濃度采用等差梯度稀釋代替等比梯度稀釋。氯霉素抗性基因cat編碼的氯霉素乙酰轉移酶（Cat）活性采用Shaw方法［21］測定，菌體收集方法改為直接超聲破碎，然后4℃、12 000 r/min離心10 min（Allegra C-15R，Beckman Coulter，USA），1單位Cat酶活（U）定義為1μmol/min。

2　結果與討論

2.1Lrp的表達對谷氨酸棒狀桿菌生長和發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的影響

為了研究Lrp對谷氨酸棒桿菌中L-纈氨酸代謝合成和轉運的調(diào)控作用，載體pJYW-4、pJYW-4-lrp和pJYW-4-lrp1和pJYW-4-brnFE被構建并分別轉入野生型菌株ATCC13869和L-纈氨酸高產(chǎn)菌株VWB-1。搖瓶發(fā)酵結果見圖2。在ATCC13869中，對照菌株ATCC13869/pJYW-4幾乎不產(chǎn)L-纈氨酸（0.2 g/L），而L-纈氨酸在ATCC13869/pJYW-4-lrp和ATCC13869/pJYW-4-lrp1中的產(chǎn)量則分別提高了16.0和17.5倍（3.2、3.5 g/L）。VWB-1作為篩選得到的L-纈氨酸高產(chǎn)菌株，VWB-1/pJYW-4中L-纈氨酸產(chǎn)量為28.1 g/L，而在VWB-1/pJYW-4-lrp和VWB-1/pJYW-4-lrp1L-纈氨酸則分別提高了5.3%和22.0%，達到29.6 g/L和34.3 g/L，見圖2。這些數(shù)據(jù)表明Lrp的表達能明顯提高谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸產(chǎn)量，且Lrp1對產(chǎn)量提升更多。

圖2 谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869和VWB-1搖瓶發(fā)酵Fig.2　Flask fermentation of C.glutamicum ATCC13869 and VWB-1

2.2Lrp的表達對谷氨酸棒狀桿菌L-纈氨酸合成和轉運相關基因的轉錄水平的影響

為了研究Lrp對谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸代謝合成和轉運的影響，對各種谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸合成和轉運相關基因 ilvA、ilvBN、ilvC、ilvD、ilvE、brnFE和lrp進行了實時定量熒光PCR分析。如圖3所示，在ATCC13869中表達Lrp和Lrp1時，ilvA、ilvBN、ilvC、ilvD、lrp和brnFE轉錄水平上調(diào)，而ilvE略微下調(diào)，Lrp和Lrp1影響程度差別不大；而在VWB-1中表達Lrp和Lrp1時，大多數(shù)基因轉錄水平變化趨勢和在ATCC13869中一致。這表明Lrp能提高谷氨酸棒狀桿菌L-纈氨酸合成和轉運相關基因的轉錄水平，這可能就是L-纈氨酸的產(chǎn)量提升的主要原因。值得注意的是，在VWB-1中Lrp能使lrp自身轉錄顯著上調(diào)（17.0倍），而突變Lrp1僅僅使lrp自身轉錄略有上調(diào)（2.9倍）；而在ATCC13869中并沒有這種差異現(xiàn)象。這表明Lrp在谷氨酸棒狀桿菌中還能提高自身編碼基因lrp轉錄水平，而突變Lrp1在VWB-1中減弱了對自身編碼基因lrp1的調(diào)控作用。為了揭示這種差異的來源，將來自于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869和VWB-1的Lrp以及l(fā)rp-brnFE間隔區(qū)域進行了測序，發(fā)現(xiàn)Lrp和Lrp1存在一個點突變Arg39Trp，而lrp-brnFE間隔區(qū)域序列也存在突變，見圖4。在谷氨酸棒狀桿菌中，Lrp可以結合在間隔區(qū)域（加粗標注位置），促進BrnFE表達［8］。在大腸桿菌中，Lrp（與谷氨酸棒狀桿菌Lrp同源性僅36%）N端為活性區(qū)域，C端區(qū)域與DNA結合。可以調(diào)控的基因包括lrp自身的轉錄［7］。Lrp1的突變靠近C端，lrp-brnFE間隔區(qū)域在靠近lrp端Lrp結合位點存在點突變，都可能影響與Lrp蛋白的結合及調(diào)控。

推測lrp在VWB-1中自身轉錄水平顯著提高與Lrp和LF的相互作用有關。Lrp1的突變抑制與近lrp端DNA結合，從而抑制lrp轉錄。而LF1的突變促進Lrp蛋白與DNA的結合，從而促進lrp和brnFE的轉錄；但沒有發(fā)現(xiàn)這兩個突變對brnFE的轉錄的影響。因此在VWB-1中表達Lrp時，正常Lrp蛋白和突變LF1共同作用下，lrp轉錄水平顯著提高。而在VWB-1中表達Lrp1時，Lrp1和LF1共同作用使lrp1的轉錄水平提高幅度有限；結合發(fā)酵結果分析，Lrp1和LF1共同作用在增加L-纈氨酸產(chǎn)量的同時弱化了生長抑制。

圖3　谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸合成和轉錄相關基因的實時熒光定量PCR分析Fig.3　RT-PCR analysis of genes involved in L-valine synthesisand gene transcription of Corynebacterium glutam icum

2.3谷氨酸棒狀桿菌Lrp1編碼基因及其上游序列LF1的突變對Lrp自身轉錄的影響

為驗證以上關于Lrp和LF相互作用的推測，作者構建一系列帶有l(wèi)rp-brnF間隔序列LF和LF1的啟動子檢測載體。氯霉素乙酰轉移酶Cat被選作報告基因。這些載體被轉入E.coli JM109，并采用96孔板法測定氯霉素的最小抑菌濃度MIC（圖5a）。帶有tac啟動子的JM109/pJYW-4-cat、JM109/pJYW-4-lrp-cat和JM109/pJYW-4-lrp1-cat的氯霉素MIC分別為60、30、30mg/L。在cat之前串聯(lián)lrp或lrp1表達都引起Cat表達量下降，且Lrp和Lrp1影響效果相同，排除Lrp1的突變對pJYW-4自身tac啟動子的影響。對照JM109/pJYW-4和JM109/pJYW-3-cat氯霉素MIC僅為0.5 mg/L；而JM109/pJYW-3-LF-cat和JM109/pJYW-3-LF1-cat氯霉素MIC分別提高到8mg/L和10mg/L，表明在cat之前連接的LF和LF1具有微弱的啟動子活性。

為模擬谷氨酸棒狀桿菌基因組中LF與lrp的位置組合，在LF（LF1）與cat之間連接lrp（lrp1）。得到的JM109/pJYW-3-LF-lrp-cat和JM109/pJYW-3-LF1-lrp-cat氯霉素MIC分別提升到12 mg/L和18mg/L，而JM109/pJYW-3-LF-lrp1-cat和JM109/ pJYW-3-LF1-lrp1-cat MIC分別下降到6 mg/L和8 mg/L。這表明LF和LF1即使受到調(diào)控也不具備較強的啟動子活性。正常Lrp的表達能促進LF和LF1后Cat的表達從而提高MIC，突變Lrp1反而起抑制作用。與LF相比，在受到Lrp或Lrp1調(diào)控時LF1更能促進Cat的表達。

含有各種pJYW-3系列載體的E.coli JM109菌的Cat酶活測定結果（圖5b）與MIC測定結果基本吻合。JM109/pJYW-3-cat的Cat酶活很低，JM109/ pJYW-3-LF-cat和JM109/pJYW-3-LF1-cat有較低的酶活。LF與lrp串聯(lián)后，LF1使酶活上升而lrp1使酶活下降。JM109/pJYW-3-LF1-lrp-cat酶活最高。

圖5　大腸桿菌JM 109氯霉素最小抑菌濃度和Cat酶活Fig.5　M IC of chloram phenicol and activity of Cat in E.coli JM 109

2.4共同表達 lrp1-brnFE對谷氨酸棒狀桿菌VWB-1發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的影響

為了進一步促進VWB-1發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸，將轉運蛋白BrnFE與Lrp1共同表達，構建了重組菌VWB-1/pJYW-4-lrp1-brnFE。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量較對照菌VWB-1/pJYW-4提高了35.6%，達到38.1g/L。這表明共同表達lrp1和brnFE可以提高谷氨酸棒狀桿菌VWB-1 L-纈氨酸產(chǎn)量。進一步對VWB-1/ pJYW-4-lrp1-brnFE進行5 L罐發(fā)酵，見圖6。發(fā)酵96 h，L-纈氨酸產(chǎn)量提高了48.9%，達到42.1 g/L，產(chǎn)率0.439 g/（L·h），比產(chǎn)量0.905 g/（L·g干細胞），糖酸轉化率0.243 g/g葡萄糖。發(fā)酵終了時葡萄糖質(zhì)量濃度已經(jīng)很低，但菌體量和L-纈氨酸質(zhì)量濃度還有上升趨勢。再補加葡萄糖并延長發(fā)酵時間L-纈氨酸產(chǎn)量可能還會提高，但發(fā)酵周期過長對產(chǎn)率有不利影響。通過培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵策略優(yōu)化或者一些代謝改造減弱或消除Lrp1的生長抑制，產(chǎn)量可能會進一步提高。

圖6　VWB-1/pJYW-4-lrp1-brnFE 5 L罐發(fā)酵Fig.6　Fed-batch fermentation of VWB-1/pJYW-4-lrp1-brnFE

3　結語

研究發(fā)現(xiàn)全局調(diào)控因子Lrp能提高谷氨酸棒狀桿菌L-纈氨酸合成及轉運相關的基因轉錄水平，從而提升發(fā)酵L-纈氨酸產(chǎn)量，但對菌體生長有抑制作用。VWB-1中Lrp1和LF1突變共同作用影響Lrp1與lrp-brnF間隔DNA結合，一方面促進L-纈氨酸相關基因表達，另一方面弱化生長抑制，因此產(chǎn)量提升效果最顯著。在VWB-1中共同表達Lrp1和BrnFE可進一步提高其L-纈氨酸產(chǎn)量。

［1］Park JH，Sang Y L.Fermentative production ofbranched chain amino acids：a focusonmetabolic engineering［J］.ApplM icrobiol Biotechnol，2009，85：491-506.

［2］Kalinowski J，Bathe B，BartelsD，etal.The complete Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genome sequenceand its impact on the production of L-aspartate-derived amino acidsand vitamins［J］.JBiotechnol，2003，104：5-25.

［3］Radmacher E，Vaitsikova A，Burger U，etal.Linking centralmetabolism w ith increased pathway flux：L-valine accumulation by Corynebacterium glutamicum［J］.Appl Environ M icrobiol，2002，68：2246-2250.

［4］LeyvalD，Delaunay S，Goergen JL，etal.Characterisation of the enzyme activities involved in the valine biosynthetic pathway in a valine producing strain of Corynebacterium glutamicum［J］.J Biotechnol，2003，104：241-252.

［5］王小元.谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)纈氨酸的代謝工程研究進展［J］.食品與生物技術學報，2012，31（3）：225-231. WANG Xiaoyuan.Metabolic engineering in C.glutamicum to increase L-valineproduction［J］.J Food Sci Biotech，2012，31（3）：225-231.（in Chinese）

［6］Lintner RE，M ishra PK，Srivastava P，etal.Limited functional conservation ofaglobal regulator among related bacterialgenera：Lrp in Escherichia，Proteus and Vibrio［J］.BMC M icrobiol，2008，8：60.

［7］Joseph M C，Rowena G M.The leucine-responsive regulatory protein，a global regulator ofmetabolism in Escherichia coli［J］. M icrobiol Reviews，1994，58：466-490.

［8］Lange C，MustafiN，F(xiàn)runzke J，etal.Lrp of Corynebacterium glutamicum controls expression of the brnFE operon encoding the exportsystem for L-methionineand branched-chain amino acids［J］.J Biotechnol，2012，158：231-241.

［9］KennerknechtN，Sahm H，Yen M，etal.Exportof L-Isoleucine from Corynebacterium glutamicum：a two-gene-encodedmember ofa new translocator family［J］.J Bacteriol，2002，184：3947-3956.

［10］Yin L，Shi F，Hu X，et al.Increasing L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum by overexpressing global regulatorLrp and two-componentexportsystem BrnFE［J］.J ApplM icrobiol，2013，114：1369-1377.

［11］Hu J，LiY，Zhang H，etal.Construction of a novelexpression system foruse in Corynebacterium glutamicum［J］.Plasm id，2014，75：18-26.

［12］Xu D，Tan Y，Li Y，et al.Construction of a novel promoter-probe vector and its application for screening strong promoter for Brevibacterium flavum metabolic engineering［J］.W orld JM icrobiol Biotechnol，2011，27：961-968.

［13］Sambrook J，RussellDW.Molecular cloning：a laboratorymanual［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996.

［14］Van der Rest M E，Lange C，Molenaar D.A heat shock follow ing electroporation induces highly efficient transformation of Corynebacterium glutamicum w ith xenogeneic plasmid DNA［J］.ApplM icrobiol Biotechnol，1999，5：541-545.

［15］Xu D，Tan Y，Huan X，et al.Construction of a novel shuttle vector for use in Brevibacterium flavum，an industrial amino acid producer［J］.JM icrobiolM ethods，2010，80：86-92.

［16］Koros A，Varga Z S，Molnar P.Simultaneous analysis of am ino acids and am ines as their ophthalaldehyde-ethanethiol-9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives in cheese by high-performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，2008，1203：146-152.

［17］M illerG L.Use of dinitrosalicylic acid reagent fordeterm ination of reducing sugars［J］.Anal Chem，1959，31：426-428.

［18］Livak K J，Schmittgen TD.Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCTmethod［J］. M ethods，2001，25：402-408.

［19］Nolden L，F(xiàn)arw ick M，Burkovski，et al.Glutamine synthetases of Corynebacterium glutamicum：transcriptional control and regulation ofactivity［J］.FEMSM icrobiol Lett，2001，201：91-98.

［20］Pendleton S J，Story R，O’Bryan C A，et al.Brief communication：a membrane filtration method for determining minimum inhibitory concentrationsofessentialoils［J］.Agric Food Anal Bacteriol，2012，2（2）：88-93.

［21］Shaw W V.Chloramphenicol acetyltransferase from chloramphenicol-resistant bacteria［J］.M ethods Enzymol，1975，43：737-755.

Expression of G lobal Regulator Lrp Facilitates L-Valine Production in Corynebacterium glutam icum

CHEN Cheng1，2，LIYanyan2， YIN Lianghong2， HU Jinyu2， WANG Xiaoyuan*1，2，3
（1.State Key Laboratory of Food and Science Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Collaborative Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

L-valine is one of the branched chain am ino acids w idely used in food，feed，and drug industries.In this study，the global regulator Lrp was found to improve L-valine production in C. glutamicum，butslightly inhibit the grow th.RT-PCR analysisshowed thatexpression of lrp increased the transcriptional levels of genes related to L-valine biosynthesis（ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD）and export（brnFE），whichm ightbe the reason for the improved L-valine production.A single amino acid substitution（Arg39Trp）in Lrp reduced the grow th inhibition and led to higher L-valine production，especially in L-valine production strain C.glutamicum VWB-1 which containsmutations in the region between lrp and brnF.By co-expressing lrp1 and brnFE in VWB-1，L-valine productionof fed-batch fermentation reached 42.1 g/Lwhichwas48.9%increase.

Lrp，regulation，Corynebacterium glutamicum，L-valine

Q 933

A

1673—1689（2016）09—0920—08

2014-09-09

國家自然科學基金項目（31370131）；江蘇省“六大人才高峰”資助項目（2012-SWYY-008）。

王小元（1956—），男，山西垣曲人，博士，教授，博士研究生導師，主要從事工業(yè)微生物代謝工程優(yōu)化和食源性病原微生物的致病機制方面的研究。E-mail：xwang@jiangnan.edu.cn