紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的抗氧化活性比較*

高　原，王福玲，賈　琦，劉　微，周艷巖

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150076）

工程師園地

紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的抗氧化活性比較*

高原*，王福玲，賈琦，劉微，周艷巖

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150076）

本文比較了紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的總酚含量及抗氧化活性差異。通過(guò)比較紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的總酚含量、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、Fe3+總抗氧化能力（FRAP）、鐵還原能力、清除羥基自由基能力等試驗(yàn)，評(píng)價(jià)不同種類葡萄酒的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅葡萄酒總酚含量最高，達(dá)到GAE 2120mg·L-1。其中紅葡萄酒的DPPH自由基清除試驗(yàn)、鐵還原能力試驗(yàn)、清除羥基自由基能力試驗(yàn)的半數(shù)抑制濃度（IC50）值所對(duì)應(yīng)的葡萄酒稀釋倍數(shù)分別為：0.046、0.033和0.13，F(xiàn)e3+總抗氧化能力（FRAP）試驗(yàn)結(jié)果為449.57μmol·L-1FeSO4。紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒均具有一定的抗氧化活性，活性強(qiáng)弱依次為紅葡萄酒＞桃紅葡萄酒＞白葡萄酒。

葡萄酒；總酚；抗氧化；自由基；還原能力

葡萄酒是以葡萄或葡萄汁為原料經(jīng)發(fā)酵釀制而成含有酒精的飲料，它含有花青素、兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸、山奈酚、白藜蘆醇等多酚類抗氧化活性物質(zhì)［1］。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講，多酚物質(zhì)是含有酚羥基的物質(zhì)，在苯環(huán)上聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)羥基的化合物。這類物質(zhì)決定了葡萄酒的感官特征和質(zhì)量指標(biāo)，如葡萄酒的顏色、口感、香氣、骨架和結(jié)構(gòu)等。適量飲用葡萄酒具有防治心腦血管疾病、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、預(yù)防老年癡呆癥等多種保健功能。

氧自由基（ROO·、O～·）和羥自由基（OH-）能引起生物膜過(guò)氧化作用而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，多酚類物質(zhì)可通過(guò)與羥基所提供的氫自由基（H·）的結(jié)合而消除自由基，從而保護(hù)細(xì)胞組織免受氧化作用的損害［2］。自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷是動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、肝病和老化的主要因素。葡萄酒中的多酚類化合物對(duì)一些嚴(yán)重危害人體健康的疾病如肥胖、心臟病、癌癥等都具有一定的治療或預(yù)防作用［3］。

本文通過(guò)對(duì)紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的總酚含量測(cè)定、DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)、Fe3+總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)、鐵還原能力實(shí)驗(yàn)、清除羥基自由基能力等實(shí)驗(yàn)綜合比較了3種葡萄酒的抗氧化活性。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料與試劑

葡萄酒（京東商城澳洲奔富洛神山莊），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Ruitaibio），2，4，6-三吡啶基 -1，3，5-三嗪 （TPTZ）（MYM Biological Technology）；生育酚 Trolox（Sigma），維生素 C（Sigma），福林-酚試劑（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；三氯乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；醋酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠），HAc（西隴化工股份有限公司）；FeSO4（西隴化工股份有限公司），KCN（西隴化工股份有限公司），F(xiàn)eCl3（西隴化工股份有限公司）；水楊酸（西隴化工股份有限公司），甲醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），H2O2（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司），以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

BSA223S-CW型分析天平（上海精天電子儀器公司）；HH-ZK型二孔多能水浴鍋（鄭州英裕予華儀器有限公司）；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.3方法

1.3.1總酚含量的測(cè)定總酚含量的測(cè)定采用Folin-酚比色法［4］。

1.3.2DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)精密稱取DPPH 4.0mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容至10mL中，得濃度為0.04%的DPPH貯存溶液，避光保存，備用。使用時(shí)將DPPH貯存液進(jìn)行10倍稀釋，得到濃度為0.004%DPPH溶液。分別取稀釋不同稀釋倍數(shù)的葡萄酒溶液（1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125）100μL，置4mL離心管中，加入1.4mL無(wú)水乙醇，1.0mL的DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)70min，同時(shí)以無(wú)水乙醇為空白，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值；以1.5mL無(wú)水乙醇加1mL DPPH為對(duì)照。按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率。用無(wú)水乙醇做空白對(duì)照［5］。

清除率Ai=（Ac-Ao）Ac×100%

式中Ac：1.5mL無(wú)水乙醇+1mL DPPH；Ao：100μL樣品+1.4mL無(wú)水乙醇+1mLDPPH

1.3.3Fe3+總抗氧化能力（FRAP法） 取0.3mol·L-1醋酸鹽緩沖液（NaAc-HAc pH=3.6）25mL，加入2.5mL經(jīng)過(guò)十倍稀釋的10mmol·L-1TPTZ（溶解于40mmol·L-1鹽酸），最后加入 20mmol·L-1FeCl32.5mL，混合均與即為FRAP工作液。取300μL不同稀釋濃度的葡萄酒樣品（1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125）與2.7mL FRAP工作液混合，在37℃恒溫水浴鍋中保溫30min，593nm測(cè)吸光度。將300μL無(wú)水乙醇和2.7mL FRAP工作液的混合液作對(duì)照。空白是無(wú)水乙醇［6］。

同時(shí)進(jìn)行FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，以1μmol·L-1FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的微摩爾數(shù)表示。

1.3.4鐵還原能力實(shí)驗(yàn)取不同稀釋濃度的葡萄酒樣品，分別為1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125的樣品0.35mL，加入相應(yīng)體積的的PBS（625mL 0.2 mol·mL-1Na2HPO4及375mL 0.2mol NaH2PO4混合，pH=6.6）及1%的鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］），混合均勻后在50℃中水浴20min后冷卻至室溫，再加入0.35mL 10%三氯乙酸，在3000rpm下離心10min，取上清液1.2mL，分別加1.2mL蒸餾水和0.24mL 0.1% FeCl3，室溫靜置10min，在700nm下測(cè)OD。以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照中以水為代替，其余與待測(cè)樣品步驟相同［7］。

1.3.5清除羥基自由基能力的測(cè)定取稀釋濃度分別1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125的葡萄酒樣品1mL，9mmol·L-1FeSO4溶液1mL，9mmol·L-1水楊酸乙醇溶液1mL、8.8mmol·L-1H2O2溶液1mL。搖勻，37℃保存30min。在3000rpm下離心10min，取上清液，以水為參比液于510nm處測(cè)光密度Ax；每管中加入與待測(cè)液濃度及體積相同的待測(cè)液，其余試劑用水代替，測(cè)得本底光密度Axo；Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以水代替測(cè)得陰性對(duì)照光密度A0［8］。按下式計(jì)算清除率：

清除率（%）S=［1-（Ax-Axo）/A0］×100%

式中Ax：加入水解液后的吸光度值；Axo：水解液本底吸光度值；A0：空白對(duì)照液吸光度值。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及方法應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用ANOVA方差分析并行方差齊性檢驗(yàn)；結(jié)果以X±S表示。

2　結(jié)果與討論

2.1總酚含量的測(cè)定

葡萄酒中的酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性和清除自由基的能力，對(duì)人體有很好的保健作用，因此，葡萄酒的抗氧化活性可以作為評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量高低的一個(gè)指標(biāo)，含有酚類物質(zhì)是酒精性飲料具有抗氧化化功能的主要原因之一［9］。通過(guò)對(duì)紅葡萄酒、桃紅葡萄酒及白葡萄酒中總酚含量的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，見(jiàn)圖1，我們發(fā)現(xiàn)紅葡萄酒中的總酚含量最高，與桃紅葡萄酒和白葡萄酒存在顯著性差異，達(dá)到2120mg·L-1，其次是桃紅葡萄酒，含量為1255mg·L-1，白葡萄酒的含量最低，約為290mg·L-1。

圖1　葡萄酒中總酚含量的測(cè)定Fig.1　Total phenol content in wine

2.2DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，常用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的體外抗氧化能力。其能力用清除率來(lái)表示，清除率越大，其抗氧化能力越強(qiáng)［10］。DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)紅葡萄酒、桃紅葡萄酒及白葡萄酒的IC50值分別為0.046，0.17和0.29，即當(dāng)紅葡萄酒、桃紅葡萄酒及白葡萄酒分別稀釋至0.046，0.17和0.29時(shí)，DPPH清除率達(dá)到50%。葡萄酒具有較好的清除自由基能力，且紅葡萄酒的清除自由基能力最強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照維生素C的DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)其IC50值為0.711μg·mL-1。

圖2　DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)Fig.2　DPPH radical scavenging assay

2.3Fe3+總抗氧化能力（FRAP法）

Fe3+總抗氧化能力（FRAP）實(shí)驗(yàn)利用Fe3+被還原成Fe2+，從而使其與三吡啶三吖嗪（TPTZ）形成的復(fù)合物在593nm下吸光度發(fā)生變化這一原理來(lái)測(cè)定樣品的抗氧化活性。而且該方法不是針對(duì)某一種特定自由基的清除能力測(cè)定，而是反應(yīng)樣品的總抗氧化能力。葡萄酒稀釋液通過(guò)FRAP總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，表明3種葡萄酒具有均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，通過(guò)繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.0023x+0.193（R2=0.9991）。以1μmol·L-1FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的微摩爾數(shù)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，當(dāng)葡萄酒稀釋倍數(shù)為1時(shí)，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的總抗氧化能力為分別為 449.57、380.25和264.05μMFeSO4。陽(yáng)性對(duì)照維生素C的FRAP值為11.38mMFeSO4。

圖3　總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)Fig.3　Ferric ion total antioxidant power assay

2.4鐵還原能力實(shí)驗(yàn)

在鐵還原能力實(shí)驗(yàn)中，抗氧化劑通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基。樣品中的抗氧化劑可使鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］）的Fe3+被還原成Fe2+，與氯化鐵生成普魯士蘭（Fe4［Fe（CN）6］3），在700nm處有最大吸光度，因此，可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明其抗氧化活性的大小，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得3種葡萄酒均具有一定的鐵還原能力，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的IC50值分別為0.033、0.085和0.17，表示在吸光度值為0.5時(shí)紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的稀釋濃度為0.033、0.085和0.17。

見(jiàn)圖4。陽(yáng)性對(duì)照生育酚（Trolox）的IC50值為0.9600μg·mL-1。

圖4　鐵還原能力實(shí)驗(yàn)Fig.4　Reducing power assay

2.5清除羥基自由基能力的測(cè)定

羥自由基是活性氧中對(duì)生物體危害最大的一種自由基，可造成生物體內(nèi)的氨基酸、糖類、核酸及脂類等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷，使其失去正常的生理功能。水楊酸可以捕獲羥基自由基生成2，3-二羥基苯甲酸和2，5-二羥基苯甲酸，在波長(zhǎng)510nm處有最大吸收值。基于以上原理可間接反應(yīng)樣品清除羥基自由基能力。羥基自由基清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　羥自由基清除實(shí)驗(yàn)Fig.5　Hydroxyl radical scavenging assay

由圖5檢測(cè)結(jié)果可計(jì)算得，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的 IC50值分別為 0.13、0.19和0.26，表示在清除率為50.00%時(shí)，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的稀釋濃度分別為0.13、0.19和0.26。陽(yáng)性對(duì)照生育酚（Trolox）的羥自由基清除能力IC50值為0.0220mg·mL-1。

3　結(jié)論

紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒在成分含量上有所區(qū)別。其中不同顏色的葡萄酒中多酚含量不同，其抗氧化活性也有所差別。葡萄酒中的酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力，對(duì)人體有很好的保健作用，因此，葡萄酒的抗氧化活性可以作為評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量高低的一個(gè)指標(biāo)。

本研究通過(guò)比較紅葡萄酒、白葡萄酒、桃紅葡萄酒的總酚含量及抗氧化活性的差異，并通過(guò)多種方法對(duì)3種葡萄酒的抗氧化功能進(jìn)行了綜合性的評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒對(duì)DPPH自由基、羥基自由基均具有清除和抑制作用。FRAP實(shí)驗(yàn)和鐵還原能力實(shí)驗(yàn)表明3種葡萄酒均具有抗氧化能力及還原能力。綜合評(píng)價(jià)可知，紅葡萄酒抗氧化能力最強(qiáng)，白葡萄酒最弱。

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Antioxidant activity difference in red wine，rose wine and white wine research*

GAO Yuan ，WANG Fu-ling，JIA Qi，LIU Wei，ZHOU Yan-yan
（College of pharmacy，Cell and molecular biology research institute，Harbin commercial university，Harbin 150076，China）

In this study antioxidant activity of wines was evaluated by comparing the red wine，rose wine and white wine，including the total phenol content，1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical scavenging capacity，ferric iron ion total antioxidant capacity（FRAP），reducing power assay and hydroxyl radical scavenging assay. The results showed that the red wine has the highest total phenol content which was Gallic acid（GAE）2120mg· L-1.Red wine has better antioxidant activity than rose wine and white wine，the IC50value was 0.046、0.033 and 0.13 dilution ratio wine in DPPH radical scavenging assay，iron reducing power experimental and hydroxyl radical scavenging assay，respectively，results of ferric iron ion total antioxidant capacity was 449.57μM FeSO4.Red wine，rose wine and white wine has a certain antioxidant activity，and the antioxidant power was that red wine was greater than rose wine，rose wine was greater than white wine.

wine；total phenol；antioxidant；free radicals；reducing power

TS262

A

2016-06-16

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12541204）資助

高原（1983-），女，博士，講師，2012年畢業(yè)于東北林業(yè)大學(xué)植物學(xué)專業(yè)，研究方向：抗氧化活性作用機(jī)制。