鹽度對長江刀鱭幼魚非特異性免疫酶和消化酶活力的影響

鄧平平，施永海，汪洋，徐嘉波，謝永德，劉永士，稅春

（上海市水產研究所，上海200433）

鹽度對長江刀鱭幼魚非特異性免疫酶和消化酶活力的影響

鄧平平，施永海，汪洋，徐嘉波，謝永德，劉永士，稅春

（上海市水產研究所，上海200433）

以人工繁育的長江刀鱭Coilia nasus幼魚（體質量為2.12 g±0.88 g）為對象，研究了鹽度對其肝臟非特異性免疫酶和胃、腸、盲囊消化酶活力的影響。試驗設6個鹽度（3、6、9、12、15、18）處理組，每組設3個平行，每個平行放養(yǎng)50尾魚，試驗共進行55 d。結果表明：鹽度為15時，長江刀鱭幼魚肝臟酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）活力均處于最低值，分別為104.77、60.72 U/g，鹽度為18時，肝臟ACP活力顯著高于其他鹽度組（P＜0.05）；超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力隨鹽度變化的趨勢相同，與谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力變化趨勢相反，鹽度對肝臟CAT活力無顯著性影響（P＞0.05）；相同鹽度下，腸淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）、蛋白酶（胃蛋白酶PPS、胰蛋白酶TPS）活力比胃和盲囊高，胃LPS活力明顯低于盲囊和腸；鹽度為9時盲囊LPS活力以及鹽度為15時腸TPS活力出現最大值；相同鹽度下，不同消化組織AMS活力總體上為腸＞盲囊＞胃，鹽度為12時，各消化組織AMS活力處于較低水平，鹽度為15時，各消化組織AMS活力整體處于相對較高水平。根據鹽度對不同組織不同酶活力的影響規(guī)律，得出適宜長江刀鱭生存的鹽度為12～15。

長江刀鱭；鹽度；非特異性免疫酶；消化酶

刀鱭Coilia nasus隸屬于鯡形目Glupeiformes、鳀科Engraulidae、鱭屬Coilia，俗稱長江刀魚，是一種生殖洄游性魚類，主要分布于長江及通海河口流域［1-2］。繁殖季節(jié)從河口區(qū)進入淡水區(qū)產卵，初孵仔魚經過生長肥育陸續(xù)順流返回河口及近海區(qū)。長江刀鱭因其復雜的生活史可以作為魚類低鹽度脅迫和滲透壓生理的研究對象。鹽度對魚類生理生態(tài)的直接作用是影響魚體對滲透壓的調節(jié)，間接表現為對魚體與環(huán)境間物質交換及能量流動的影響［3］。魚類滲透壓調節(jié)是通過身體各個組織器官協(xié)同作用［4］，如免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、鰓、皮膚等。滲透壓的調節(jié)需要消耗大量的能量，使得用于生長的能量相對減小，從而導致魚類的代謝緩慢、體質下降、免疫力降低［5］。

肝臟是魚類重要的新陳代謝器官，參與魚體抗氧化、糖原合成、分泌膽汁等重要生理過程［6］。在長期低鹽度脅迫條件下，魚類通過完善的非特異性免疫系統(tǒng)來抵御水環(huán)境的脅迫，機體會產生大量的氧自由基，從而導致相應的免疫因子發(fā)生變化以清除過多的自由基［7］，機體產生了大量的相關抗氧化酶。鹽度通過影響魚類消化組織中消化酶活力來影響魚類的消化生理活動，最終影響魚類的生長發(fā)育［8］。

目前，研究人員已對半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis［6］、刺參Apostichopus jappnicus［9］、大菱鲆Scophthalmus maximus［10］、真鯛Pagrosomus major［11］、黃鰭鯛Sparus latus［12］、施氏鱘Acipenser schrenckii Brandt［13］等水產動物進行了鹽度對其非特異性免疫酶或消化酶影響方面的相關研究。本試驗中，以人工繁育的長江刀鱭Coilia nasus幼魚為研究對象，通過逐步增鹽，長期脅迫，研究了鹽度對長江刀鱭幼魚非特異性免疫酶和消化酶活力的影響，以期為長江刀鱭生殖洄游、增殖放流及其相關生態(tài)學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用長江刀鱭幼魚為上海市水產研究所苗種技術中心經人工繁殖培育的幼魚，挑選活力強、規(guī)格相近的個體進行試驗，試驗魚初始體長為（8.326±1.179）cm，體質量為（2.12±0.88）g。

1.2 方法

1.2.1 試驗條件 試驗用水由自然河水、杭州灣半咸水和鹽鹵按比例配制。試驗期間，每天投喂劍水蚤和糠蝦各2次，每天吸污換水各1次，并及時監(jiān)測水溫和鹽度的變化，控制光強。

1.2.2 試驗設計 試驗設6個處理組，鹽度分別為3、6、9、12、15和18，每組設3個平行，每個平行放養(yǎng)50尾魚，試驗在盛有1 t水體的水泥池中進行。各試驗組起始均為淡水養(yǎng)殖，暫養(yǎng)5 d，然后鹽度按每天升2的速度分別升至6、9、12、15和18，并設鹽度為3的對照組。試驗共進行55 d，試驗水溫為26.7～31.3℃。

取樣前24 h停止投喂，將各組試驗魚封袋分類保存于冰箱（-80℃）中。采集各試驗組長江刀鱭的肝臟、腸道、盲囊和胃樣本，分別測定非特異性免疫酶和消化酶活力。

1.2.3 酶液的制備 將冷凍的試驗魚從-80℃冰箱移至冰箱（-20℃）中，再置于冰盤上逐步解凍后解剖，取出肝臟、腸道、盲囊、胃，剔除內容物和脂肪后，用0.9％預冷的生理鹽水快速沖洗，并用濾紙吸干水分。將分批解剖獲得的各組織保存于冰箱（-80℃）中，測定前先在冰盤內將樣品剪碎，稱取一定量的組織于玻璃勻漿器中，加入一定體積預冷的生理鹽水后，在冰浴條件下勻漿。所得勻漿液于4℃下以2500 r/min離心20 min，取上清液作為酶液，冰浴保存，10 h內分析完畢。

1.2.4 免疫酶和消化酶活力的測定 試驗過程中使用的測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，且其不同酶的活力定義如下。

BCA總蛋白定量：將56.3 mg/L蛋白標準品用雙蒸水稀釋成不同濃度，制作標準曲線，然后準確稱取組織質量，按質量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水，在冰水條件下機械勻漿，以2500 r/min離心10 min，取上清液再用生理鹽水按1∶9稀釋成組織勻漿，待測。

堿性磷酸酶（AKP）活力定義為：在37℃條件下每克組織蛋白與基質作用15 min產生1 mg酚為一個活力單位（U）。

酸性磷酸酶（ACP）活力定義為：在37℃條件下每克組織蛋白與基質作用30 min產生1 mg酚為一個ACP酶活力單位（U）。

超氧化物歧化酶（SOD）活力定義為：在37℃條件下每毫克組織蛋白與1 mL反應液作用40 min，SOD抑制率達50％時所對應的SOD量為一個SOD酶活力單位（U）。

過氧化氫酶（Catalase，CAT）活力定義為：在37℃條件下每克組織蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度0.50～0.55的底物中的過氧化氫相對量為一個CAT酶活力單位（U）。

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）活力定義為：在37℃條件下每毫克蛋白質每分鐘扣除非酶反應的作用，使反應體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個GSH-PX酶活力單位（U）。

脂肪酶（Lipase，LPS）活力定義為：在37℃條件下每克組織蛋白在本反應體系中與底物反應1分鐘，每消耗1μmol底物為一個LPS酶活力單位（U）。

淀粉酶（Amylase，AMS）活力定義為：在37℃條件下每毫克組織蛋白與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為一個AMS酶活力單位（U）。

胃蛋白酶（Pepsin，PPS）活力定義為：在pH為8.0、37℃條件下每毫克組織蛋白中含有的胃蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為一個PPS酶活力單位（U）。

胰蛋白酶（Trypsin，TPS）活力定義為：在pH為8.0、37℃條件下每毫克組織蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為一個TPS酶活力單位（U）。

1.3 數據處理

運用Excel和SPSS 17.0軟件對試驗數據進行統(tǒng)計和處理，用單因素分析法（One-way ANOVA）進行方差分析，用Duncan法進行多重比較。試驗結果均用平均值±標準差（mean±S.D.）表示，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 鹽度對長江刀鱭幼魚肝臟組織中免疫酶活力的影響

從圖1可見：長江刀鱭幼魚肝臟組織中ACP活力約為AKP活力的2倍；當鹽度為15時，ACP和AKP活力分別處于最低值，當鹽度為18時，ACP活力顯著高于其他鹽度組（P＜0.05）。

圖1 鹽度對長江刀鱭幼魚肝臟組織中水解免疫酶活力的影響Fig.1 Effect of salinity on activities of immune enzymes in the liver of esturarine tapertail anchovy Coilia nasus

從圖2可見：長江刀鱭幼魚肝臟組織中SOD和CAT活力的變化趨勢相似，與GSH-PX活力的變化趨勢正好相反；GSH-PX活力隨鹽度的變化先降后升再降，鹽度為3時，GSH-PX活力最大（23.76 U/mg）；SOD活力隨鹽度的變化先升后降再升，鹽度為6時，SOD活力最大（20.71 U/g），鹽度為15時，SOD活力最?。?5.21 U/mg）且顯著低于其他鹽度組（P＜0.05）；CAT活力隨鹽度的變化先升后降再升，但鹽度對肝臟組織CAT活力無顯著性影響（P＞0.05），鹽度為6時，CAT活力最大（21.97 U/mg）。

圖2 鹽度對長江刀鱭幼魚肝臟組織中非特異性抗氧化酶活力的影響Fig.2 Effect of salinity on activities of non-specific antioxidant enzymes in the liver of esturarine tapertail anchovy Coilia nasus

2.2 鹽度對長江刀鱭幼魚消化酶活力的影響

2.2.1 淀粉酶 從圖3可見：相同鹽度下，不同消化組織的AMS活力總體上為腸＞盲囊＞胃；當鹽度為9～18時，鹽度對不同消化組織AMS活力的影響趨勢相同，即先降后升再降；鹽度為12時，各消化組織AMS活力均處于較低水平，鹽度為15時，各消化組織AMS活力整體處于相對較高水平。

圖3 鹽度對長江刀鱭幼魚消化組織中淀粉酶活力的影響Fig.3 Effect of salinity on activity of am ylase in digestive organs of esturarine tapertail anchovy Coilia nasus

2.2.2 蛋白酶 從圖4可見：相同鹽度下，不同組織中蛋白酶活力總體上為腸＞盲囊＞胃；不同鹽度對腸TPS的活力影響波動幅度小于盲囊TPS、胃PPS，只有鹽度為9時，腸TPS活力顯著高于除對照組（鹽度3）之外的其他鹽度組（P＜0.05）。

圖4 鹽度對長江刀鱭幼魚消化組織中蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of salinity on activity of protease in digestive organs of esturarine tapertail anchovy Coilia nasus

2.2.3 脂肪酶 從圖5可見：相同鹽度下，胃組織中LPS活力明顯低于盲囊和腸組織；當鹽度為3～12時，鹽度對腸和盲囊LPS的活力影響相同，即先降后升再降；不同鹽度對盲囊LPS的活力影響波動幅度小于腸LPS和胃LPS，只有在鹽度為9時，盲囊LPS活力顯著高于其他鹽度組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 鹽度對長江刀鱭幼魚非特異性水解免疫酶的影響

ACP和AKP是免疫防御體系中比較重要的水解酶［14］，也是巨噬細胞溶酶體酶的重要代謝調控酶，在體內負責磷酸集團的轉移和代謝，在免疫反應中發(fā)揮作用［15-16］。本試驗中低鹽脅迫顯示：當鹽度為15時，肝臟組織ACP和AKP活力分別處于最低值；鹽度為3～15時，各鹽度組ACP活力無顯著性差異，長江刀鱭幼魚能夠適應低鹽度的脅迫；而當鹽度升高為18時，ACP和AKP活力顯著升高。這可能與長江刀鱭長期在自然狀態(tài)下形成的生活史有關，即在洄游過程中能較好地適應低鹽度的變化，且鹽度為15時更接近長江刀鱭幼魚的等滲點鹽度。

圖5 鹽度對長江刀鱭消化組織中脂肪酶活力的影響Fig.5 Effect of salinity on activity of lipase in digestive organs of esturarine tapertail anchovy Coilia nasus

3.2 鹽度對長江刀鱭幼魚非特異性抗氧化免疫酶的影響

肝臟是魚類重要的新陳代謝器官，參與魚體中抗氧化、糖原合成、分泌膽汁等重要生理過程［6］。測定抗氧化酶活力一般選取肝臟或者血液［17］，當鹽度偏離魚類的等滲點時，魚體受應激反應而產生過多的活性氧自由基，而抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-PX）活力增強有助于清除這些氧自由基［10］。SOD是一種重要的抗氧化酶，能將機體內O-2·轉化成H2O2和O2，而CAT和GSH-PX與SOD具有協(xié)同作用［18-19］，還可以將H2O2分解為H2O和O2［20］。SOD活力越高，表明有待消除的氧自由基越多，則越需要增強CAT和GSH-PX活力來分解H2O2。本試驗中發(fā)現，隨著鹽度的升高，SOD和CAT活力變化趨勢相似，與GSH-PX活力變化趨勢相反。這可能是由于CAT與GSH-PX在參與H2O2分解過程中有拮抗作用，不同鹽度下這兩類酶活力優(yōu)勢不一致。余燕等［17］對點帶石斑魚幼魚抗應激酶進行低鹽度脅迫研究時，SOD、CAT和GSH-PX活力的變化趨勢也是前兩者相似而與后者者相反，這一結果與本試驗結果相似。本試驗中，鹽度為3或15時，SOD和CAT活力與其他鹽度組相比相對較低。鹽度對長江刀鱭幼魚CAT活力無顯著性影響，這與王帥等［21］的相關研究結果一致。

3.3 鹽度對長江刀鱭幼魚消化酶的影響

細胞外的滲透壓主要是由鰓和皮膚從外界環(huán)境主動吸收或排除Na+和Cl-而實現［22］，而離子的主動吸收需要消耗能量［23］。受這兩方面的影響，魚體的消化能力會隨著鹽度的升高而下降。從本試驗結果看，隨著鹽度的升高，AMS和蛋白酶的活力總體呈現下降趨勢，而LPS則呈現小幅上升趨勢。而對洄游性水產動物，特別是具有廣鹽性生理調節(jié)機制的太平洋鮭魚類，鹽度作用表現出的結果有較大的個體差異［24］。本試驗中，不同組織中的AMS活力在鹽度15時明顯上升，各消化組織AMS活力整體處于相對較高水平。不同鹽度對腸TPS活力的影響波動幅度小于盲囊TPS、胃PPS，對盲囊LPS活力影響的波動幅度小于腸LPS和胃LPS，只有在鹽度為9時，腸TPS和盲囊LPS的活力較其他鹽度組有顯著性影響（P＜0.05）。相同鹽度下，長江刀鱭幼魚不同組織消化酶活力總體從強到弱依次為腸＞盲囊＞胃。由此推測，長江刀鱭幼魚酶液消化能源物質，可能主要以腸道和盲囊組織為主。

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Effectsofsalinityonactivitiesofnon-specificimmuneanddigestive enzymesinjuvenileestuarinetapertailanchovyCoilianasus

DENGPing-ping，SHIYong-hai，WANGYang，XUJia-bo，XIEYong-de，LIUYong-shi，SHUIChun

（ShanghaiFisheriesResearchInstitute，Shanghai200433，China）

Anexperimentwasconductedtoinvestigateeffectsofvarioussalinitiesonactivitiesofnon-specificimmuneanddigestiveenzymesinliver，stomach，intestineandcaecumofjuvenileestuarinetapertailanchovyCoilia nasus（bodyweight2.12g±0.88g）.Juvenileestuarinetapertailanchovywithbodyweightof（2.12±0.88）gwas rearedina1ttankatarateof50fishatasalinityof3，6，9，12，15and18for55dayswithtriplication.Results showedthatthereweretheminimalactivitiesofacidphosphatase（ACP）（104.77U/g）andalkalinephosphatase（AKP）（60.72U/g）inliverofthefishatasalinityof15，significantlyhigherACPactivityinliveratasalinityof 18thanatothersalinities（P＜0.05）.Thesametrendwasobservedinthechangesinactivitiesofsuperoxidedismutase（SOD）andcatalase（CAT）asthesalinitywaselevated，whiletheoppositecasewasfoundinactivityof glutathioneperoxidase（GSH-PX），withoutsignificantdifferenceinCATactivity.Therewerehigheractivitiesof amylase（AMS），lipase（LPS）andtrypsin（TPS）inintestinethaninstomachandcaecum，significantlylowerLPS activityinstomachthaninintestineandcaecum，withthemaximalactivitiesofLPSincaecumandofTPSinintestineatasalinityof9（P＜0.05）.Atthesamesalinity，theorderofamylaseactivitywasrangedindescendingorder asintestine＞caecum＞stomach，andtherelativelyloweramylaseactivitiesindifferentdigestiveorganswereobserved atasalinityof12andhigheratasalinityof15，indicatingthat12-15isoftheoptimalsalinityforjuvenileestuarinetapertailanchovy.

Coilianasus；salinity；non-specificimmuneenzyme；digestiveenzyme

S917.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.05.011

2095-1388（2016）05-0533-05

2016-02-15

上海市科委重點科技公關項目（11391901300）；科技部與上海市共同重大任務科研專項（12dz1909302）；上海市青年成長計劃項目［滬農青字（2014）第3-3號］

鄧平平（1986—），男，工程師。E-mail：kokou365@sohu.com

施永海（1975—），教授級高工。E-mail：yonghais@163.com