利用魚抗血清及鼠抗血清分析魚腸道弧菌全菌蛋白抗原性?

張銘偉，唐小千，繩秀珍，邢　婧，戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學水產動物病害與免疫實驗室，山東 青島 266003)

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利用魚抗血清及鼠抗血清分析魚腸道弧菌全菌蛋白抗原性?

張銘偉，唐小千??，繩秀珍，邢婧，戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學水產動物病害與免疫實驗室，山東 青島 266003)

從患腹水癥牙鲆脾臟組織中分離得到一株優(yōu)勢菌株CD86，經人工感染實驗證實菌株CD86對牙鲆有較高的致病力，其半致死濃度為1.8×105CFU/尾。通過生理生化特征測定和16S rDNA基因序列分析，判定菌株CD86為魚腸道弧菌(Vibrioichthyoenteri)。以福爾馬林滅活的菌株CD86全菌分別免疫健康的小鼠和牙鲆，ELISA測定鼠抗血清和牙鲆抗血清效價分別為12800和1200。利用間接免疫熒光技術檢測2種抗血清與菌株CD86的結合活性，結果顯示，2種血清均可同菌體發(fā)生陽性反應，其中鼠抗血清陽性反應信號明顯強于魚抗血清。同時，利用Western blotting分析了菌株CD86全菌蛋白的抗原性，結果顯示分子量為27、30和37kDa的菌體蛋白條帶與2種血清均發(fā)生陽性反應；分子量為19、25、28、29和35kDa的菌體蛋白條帶僅與鼠抗血清發(fā)生陽性反應；分子量為45kDa的菌體蛋白條帶只與魚抗血清發(fā)生陽性反應。研究結果表明，牙鲆對菌體抗原產生的抗體應答與小鼠存在明顯差異，該發(fā)現(xiàn)對研篩魚用高效的魚腸道弧菌亞單位疫苗具有重要的參考價值。

魚腸道弧菌；分離鑒定；ELISA；Western blotting；抗原性分析；抗血清

引用格式：張銘偉， 唐小千， 繩秀珍， 等. 利用魚抗血清及鼠抗血清分析魚腸道弧菌全菌蛋白抗原性[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(10): 24-31.

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弧菌(Vibrio)是海洋環(huán)境中最常見的細菌類群之一，廣泛分布于近岸、河口海區(qū)的海水和生物體中，它是引發(fā)海水養(yǎng)殖動物疾病的重要病原菌類群，其致病性受宿主的生理狀態(tài)及水質環(huán)境條件等綜合因素的影響，是一類條件致病菌[1-3]。魚腸道弧菌(Vibrioichthyoenteri)是水產養(yǎng)殖中新近發(fā)現(xiàn)的一種致病菌，1996年日本學者Ishimaru首次報道該菌對牙鲆具有較強的致病力，基于它的生化生理及分子生物學特征，將其定名為弧菌屬的一個新種[4]。

近年來，國內相繼報道了致病性魚腸道弧菌可引起養(yǎng)殖大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、紅鰭東方鲀(Fugurubripes)、斜帶髭鯛(Hapalogenysnitens)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等養(yǎng)殖魚體發(fā)病，由該菌引起的養(yǎng)殖魚類疾病表現(xiàn)出較高的死亡率和較廣的流行范圍，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失[2-3,5-7]。目前國內外已針對魚腸道弧菌在診斷檢測、免疫防治方面開展了初步研究，制備了魚腸道弧菌的多克隆及單克隆抗體，并建立了間接熒光抗體與免疫印跡檢測技術[8-9]；制備的魚腸道弧菌滅活全菌和外膜蛋白免疫牙鲆均表現(xiàn)出一定的免疫保護效果[10-11]，研究結果提示,外膜蛋白可作為魚腸道弧菌亞單位疫苗研制的候選材料。但是，目前世界范圍大多應用鼠、兔等高等動物免疫血清對病原菌進行抗原性分析，該方法不能如實反映魚體對病原菌各抗原組分的應答情況，因而在篩選菌株亞單位疫苗候選蛋白時準確性會受一定程度的影響。

本研究在分離獲得患腹水癥牙鲆致病菌株CD86的基礎上，通過制備滅活菌株CD86的鼠抗血清和牙鲆抗血清，結合運用Western blotting對魚腸道弧菌全菌蛋白的免疫原性進行分析，以期掌握魚腸道弧菌全菌蛋白引起牙鲆及小鼠抗體免疫應答的差異特點，為研制高效的魚腸道弧菌亞單位疫苗提供數據。

1　材料與方法

1.1 病原菌分離

患病牙鲆取自山東省日照順源牙鲆育苗廠，病魚體色發(fā)黑，不攝食，腹部有明顯膨脹，解剖后有大量腹水，肝臟、腎臟及脾臟均有不同程度腫脹，腸道內無食物且有淡黃色黏液。取內臟鏡檢，有大量細菌，無菌環(huán)境下以接種環(huán)挑取脾臟組織液劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h后觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基平板上生長的菌落形態(tài)較為一致，通過劃線法分離純化得到單一優(yōu)勢菌株，定名為CD86。將純化的菌株CD86保存在含15%甘油的普通營養(yǎng)培養(yǎng)基中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 人工感染實驗

感染實驗用健康牙鲆，購于青島膠南某牙鲆養(yǎng)殖廠，體長為12～13cm。實驗前暫養(yǎng)一周，養(yǎng)殖水溫為(22±1)℃，日換水1/4，每隔1天投喂人工配合飼料。將菌株CD86在普通營養(yǎng)瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24h，以無菌的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌收集細菌，并以7500g離心洗滌菌體3次，每次5min。將洗滌后的PBS菌懸液以麥氏比濁儀將細菌濃度調整為1.0×108CFU/mL，然后進行10倍梯度稀釋分別獲得1.0×107、1.0×106和1.0×105CFU/mL 3個濃度梯度，將4種不同濃度的菌懸液以腹腔注射的方式感染健康牙鲆，每尾注射0.1mL，對照組魚體注射等體積的生理鹽水，每組注射20尾。攻毒后2周內連續(xù)觀察與記錄魚體的發(fā)病與死亡情況。同時，隨機取3尾攻毒后發(fā)病牙鲆，從病灶處再次分離細菌進行菌種鑒定。

1.3 菌株鑒定

將菌株CD86和攻毒感染后再次分離獲得的菌株CD86-1接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，置于28℃培養(yǎng)24h，制備細菌涂片進行革蘭氏染色以確定其形態(tài)特征。使用法國梅里埃公司API鑒定系統(tǒng)的ID32E鑒定條對菌株的生化特性進行鑒定，標準魚腸道弧菌生化特性引自《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》(第二版)[12]。挑取單一菌落混于無菌去離子水中，100℃水浴5min,冷卻后4℃ 10000g離心10min，取上清液作為PCR擴增反應的模板。細菌16S rDNA擴展的正向與反向引物分別采用F27和R1492[13]，具體反應體系與反應條件的設置參考文獻[14]進行。PCR擴增產物交送上海桑尼測序公司進行序列測定，將測定的16S rDNA基因序列通過Blast進行同源性比對分析，并從結果中選取其他相似度較高的菌株序列，使用ClustalX 2.0軟件進行多序列比對，使用MEGA 5.0進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰位相連法構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 菌株CD86鼠抗及魚抗血清的制備

1.4.1 菌株CD86的滅活將普通營養(yǎng)瓊脂28℃培養(yǎng)24h的菌株CD86以PBS洗滌收集，7500g離心洗滌3次，將菌液濃度調整為5×108CFU/mL后，加入0.8%的甲醛在4℃條件下振蕩滅活48h，無菌PBS離心洗滌3次后，以無菌PBS將濃度調整為5×108CFU/mL，取0.2mL菌液在無菌環(huán)境下涂布于普通營養(yǎng)瓊脂平板28℃培養(yǎng)24h，驗證菌體已被滅活。已經滅活后的菌懸液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌株CD86鼠抗血清的制備滅活菌株CD86分4次分別免疫2只Balb/c小鼠，具體程序如下：基礎免疫，滅活菌懸液與弗氏完全佐劑1∶1混勻，腹腔注射0.2mL；第二周后進行第1次加強免疫，滅活細菌懸液與弗氏不完全佐劑1∶1混勻，腹腔注射0.2mL；第三周、第四周再加強免疫各1次，尾靜脈注射滅活細菌懸液0.2mL，無佐劑；最后一次加強免疫后第7天摘眼球一次性取血，室溫傾斜放置2h，放置4℃過夜，次日8000g離心10min獲得鼠抗血清，將2只小鼠抗血清混合后用于后續(xù)實驗。

1.4.3 菌株CD86魚抗血清的制備用以制備魚抗血清的健康牙鲆，購于青島膠南某牙鲆養(yǎng)殖廠，體長為23～25cm。實驗前暫養(yǎng)1周，養(yǎng)殖水溫(22±1)℃，日換水1/4，每隔1天投喂人工配合飼料。將滅活菌懸液與弗氏佐劑等體積混勻后分別免疫5尾牙鲆，采取腹腔注射方式，每尾注射0.2mL，首次免疫2周后加強免疫1次，首次免疫后35d尾靜脈取血，室溫傾斜放置1h后，置于4℃冰箱過夜，次日8000g離心10min收集牙鲆抗血清，將收集的5尾牙鲆抗血清混合后用于后續(xù)實驗。

1.5 魚抗血清和鼠抗血清抗體特性分析

1.5.1 ELISA檢測魚抗血清和鼠抗血清效價將滅活菌株CD86菌懸液濃度調整至1×108CFU/mL，將菌懸液以100μL/孔加至96孔酶標板中，設置3個重復，4℃包被過夜；次日PBST(含有0.5%Tween20的PBS緩沖液)洗滌后，加入含4%牛血清白蛋白(BSA)的PBS，37℃溫育1h；PBST洗滌后，加入PBS稀釋成不同濃度梯度的牙鲆抗血清100μL；同上溫育洗滌后，加入鼠抗牙鲆IgM單克隆抗體2D8(本實驗室制備，1∶1500)[15]100μL；同上溫育洗滌后，加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG(Sigma，1∶5000)，37℃溫育45min；洗滌后加入對硝基苯磷酸酯(pNPP)發(fā)色液，酶標儀測量在405nm的吸光值。測定鼠抗血清效價時，以鼠抗血清代替牙鲆抗血清，溫育洗滌后直接加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG，其余步驟與牙鲆抗血清效價測定方法一致。P/N≥2.1時為陽性。

1.5.2 間接免疫熒光技術檢測2種抗血清特性參照張偉妮等[16]的方法進行間接免疫熒光檢測。將菌株CD86菌懸液調整至1×108CFU/mL，將菌懸液滴在載玻片上，傾斜處理后室溫下自然干燥，放入丙酮中固定15min，取出晾干。在玻片菌體位置滴加PBS稀釋100倍的牙鲆抗血清，37℃濕盒中溫育45min，取出載玻片以PBS洗3次，每次5min。然后，以PBS稀釋600倍的鼠抗牙鲆IgM單克隆抗體2D8孵育菌體，37℃濕盒中溫育45min，同上洗滌；最后，以PBS稀釋256倍的FITC標記的羊抗鼠多抗(Sigma)進行孵育，37℃濕盒中溫育45min，取出洗滌后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察結果并拍照。利用鼠抗血清進行免疫熒光反應時，以PBS稀釋100倍的鼠抗血清作為第一抗體，孵育洗滌后滴加FITC標記的熒光抗體孵育，其余步驟與牙鲆抗血清免疫熒光操作方法一致。以PBS代替鼠抗血清和牙鲆抗血清作為陰性對照。

1.6 Western blotting分析菌株CD86全菌蛋白的抗原性

參照孫敏等[17]方法對菌株CD86全菌蛋白進行Western blotting分析。以超聲波破碎的魚腸道弧菌全菌，將全菌破碎液樣品與電泳樣品緩沖液等體積混勻，煮沸5min，冷卻后加樣進行SDS-PAGE，分離膠濃度為10%(v/v)，在60mA恒定電流進行電泳。電泳結束后，凝膠用Mini-ProteanⅡcell系統(tǒng)(Bio-Rad)將蛋白轉移到PVDF膜上(恒壓30V，90min)，轉印后PVDF膜用PBS洗10min，均勻剪裁置于含4%BSA的PBS溶液中4℃封閉過夜，PBST洗滌3次，每次5min；一塊膜在以PBS稀釋100倍的牙鲆抗CD86血清中37℃溫育1h，同上洗滌后在PBS稀釋1000倍的鼠抗牙鲆IgM單克隆抗體2D8中37℃溫育1h，同上洗滌后將膜置于PBS稀釋5000倍的堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG中，37℃溫育45min后同上洗滌。最后將膜置于NBT/BCIP緩沖液中發(fā)色20～30min，去離子水洗滌膜以終止發(fā)色。另一塊膜在封閉后以PBS稀釋1000倍的鼠抗CD86血清進行孵育，洗滌后加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG，其余操作步驟與第一塊膜操作方法一致。晾干后觀察記錄反應結果。

2　結果

2.1 人工感染實驗

健康牙鲆在注射感染菌株CD86后2～3d開始出現(xiàn)死亡，其中高濃度感染組在感染后第12天累計死亡率達到95%(見圖1)。感染后發(fā)病魚體主要表現(xiàn)出停止攝食，活動減少，感染1周以后大部分魚體出現(xiàn)腹部脹大，部分牙鲆的體表出現(xiàn)不同程度的潰爛，解剖瀕死牙鲆腹腔內有明顯腹水，脾臟腫大，且腸道內有淡黃色黏液，人工感染魚體的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病魚體表現(xiàn)出高度相似性，且從隨機挑選的發(fā)病牙鲆病灶處可再次分離得到大量細菌，各個菌落形態(tài)一致，與菌株CD86高度相似，而對照組魚體未表現(xiàn)任何癥狀。根據統(tǒng)計的不同濃度感染組魚體的累計死亡率，按照改進的寇氏法[18]計算該菌株對牙鲆的半致死量，結果顯示菌株CD86對健康牙鲆的半致死量(LD50)為1.8×105CFU/尾，表明菌株CD86具有較強毒力。

圖1　人工感染實驗結果Fig.1　Result of artificial infection experiment

2.2 菌株鑒定結果

菌株CD86革蘭氏染色陰性，API系統(tǒng)ID32E鑒定條鑒定的生理生化結果見表1。結果顯示,菌株CD86與菌株CD86-1生化結果與魚腸道弧菌標準菌株[19]的生理生化指標相吻合。測序結果顯示,菌株CD86與菌株CD86-1的16S rDNA序列完全一致，通過在NCBI數據庫中對菌株CD86的16S rDNA序列進行同源比對分析，結果顯示其與已發(fā)布的2株魚腸道弧菌(Genbank no. DQ003270 和no. KC884634)16S rDNA序列相似度最高，均高于99.7%，通過挑取數據庫中與菌株CD86的16S rDNA序列高度同源的20株弧菌菌株利用鄰位相連法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示菌株CD86與2株魚腸道弧菌聚為一支，置信度為100%(見圖2)。

2.3 血清效價及免疫熒光檢測結果

ELISA檢測結果顯示，當鼠抗血清稀釋倍數小于12800時P/N>2.1，而當稀釋倍數為25600時P/N<2.1，因此鼠抗血清效價為12800(見圖3A)；當牙鲆抗血清稀釋倍數小于1200時P/N>2.1，而當稀釋倍數為1400時P/N<2.1，因此牙鲆抗血清效價為12800(見圖3B)。分別應用鼠抗血清和牙鲆抗血清對菌株CD86進行熒光檢測，結果顯示2種血清均能與菌體發(fā)生陽性反應，與牙鲆抗血清免疫熒光檢測結果相比，鼠抗血清的顯示出較強的綠色熒光信號，而陰性對照未觀察到綠色熒光信號(見圖4)。

表1　生理生化鑒定結果Table 1　Result of Physiological and biochemical identification

(“+”表示陽性，“-”表示陰性，“” 表示未記述。“+” show positive, “-” show negative,“” show not described.)

①Identification category; ②Isolated strain CD86; ③Isolated strain CD86-1; ④Standard strain

圖2　基于16S rDNA基因序列構建的弧菌系統(tǒng)進化樹Fig.2　Phylogenetic tree of Vibrio based on 16S rDNA genes

(A：鼠抗CD86血清效價測定結果 Detecting the titer of mouse serum against CD86；B：魚抗CD86血清效價測定結果 Detecting the titer ofParalichthysolivaceusserum against CD86.)

圖3測定抗CD86血清效價結果

Fig.3Detection of the titers of antisera against strain CD86

(A：鼠抗血清免疫熒光染色結果；B：牙鲆抗血清免疫熒光染色結果；C：陰性對照。(標尺=5μm)。A: The result of IFAT using mice antiserum; B: The result of IFAT using flounder antiserum; C: Negative control. (bar=5μm).)

圖4利用鼠抗及牙鲆抗血清對菌株CD86的免疫熒光染色結果

Fig.4Immunofluorescence staining of strain CD86 using mice and flounder antisera

2.4 菌株CD86全菌蛋白免疫原性分析

Western blotting分析結果顯示，鼠抗血清可與菌株CD86全菌分子量為19、25、27、28、29、30、35和37kDa的蛋白條帶發(fā)生陽性反應；牙鲆抗血清可與菌株CD86分子量為27、30、37和45kDa的蛋白條帶發(fā)生陽性反應；對比2種血清陽性反應蛋白條帶發(fā)現(xiàn)，鼠抗血清和牙鲆抗血清均可與分子量為27、30和37kDa蛋白條帶發(fā)生陽性反應；而分子量為19、28、29和35kDa的蛋白條帶僅與鼠抗血清發(fā)生陽性發(fā)生，分子量為45kDa的蛋白條帶僅與牙鲆抗血清發(fā)生陽性反應(見圖5)。

3　討論

人工感染實驗顯示，從患腹水癥牙鲆體內分離的優(yōu)勢菌株CD86對健康牙鲆具有較高的致病力，且感染后魚體表現(xiàn)出自然發(fā)病魚體的典型癥狀，主要包括腹水及腸炎的出現(xiàn)，因而可以判定本研究分離的菌株CD86為牙鲆腹水癥的病原菌。菌株CD86生理生化鑒定結果顯示，其生化指標與標準菌株相吻合，但與張曉君等[6]報道的魚腸道弧菌在β-半乳糖甙酶指標存在差異，推測其可能是由于不同地區(qū)分離菌株的變異造成的。通過對菌株CD86的16S rDNA序列進行同源性比對分析顯示該序列與數據庫中魚腸道弧菌相似度最高，基于16S rDNA序列構建的系統(tǒng)進化樹也顯示菌株CD86與魚腸道弧菌聚為一支。結合生化特性以及16S rDNA序列分析結果，判定菌株CD86為魚腸道弧菌。

(M：蛋白質分子量標準；1：菌株CD86全菌SDS-PAGE結果；2：鼠抗血清Western blotting分析結果；3：牙鲆抗血清Western blotting分析結果。M: Marker; 1: SDS-PAGE of total bacterial proteins of strain CD86; 2: The result of Western blotting using mice antiserum; 3: The result of Western blotting using flounder antiserum.)

圖5菌株CD86 SDS-PAGE和Western blotting分析結果

Fig.5SDS-PAGE and Western blotting of strain CD86

為了分析魚腸道弧菌的抗原性，本研究分別制備了滅活菌株CD86的鼠抗和魚抗血清，ELISA檢測顯示鼠抗血清效價顯著高于魚抗血清，免疫熒光結果同樣顯示鼠抗血清的免疫熒光陽性信號顯著高于牙鲆抗血清，說明小鼠對于相同的菌體抗原表現(xiàn)出較高的免疫應答水平，產生的抗體水平顯著高于牙鲆。另外，小鼠血清中產生的免疫球蛋白以IgG為主，牙鲆應答產生的免疫球蛋白以IgM為主，而IgG對抗原的親和力顯著高于IgM[20]，這也與2種抗血清在效價及免疫熒光反應信號強度上存在差異密切有關。

利用鼠抗血清和牙鲆抗血清通過Western blotting分析了菌株CD86全菌蛋白的抗原性，結果顯示鼠抗血清可與分子量在27～37kDa范圍內絕大多數的蛋白條帶發(fā)生陽性反應，而牙鲆抗血清僅與27、30、37、45kDa的4個蛋白條帶發(fā)生明顯的陽性反應，結果說明鼠抗血清和牙鲆抗血清中特異性抗體的種類和豐度存在顯著差異，表明小鼠和牙鲆在免疫相同的菌體抗原后抗體應答具有明顯差異，小鼠作為高等哺乳動物相比魚體的抗體應答表現(xiàn)出更強的水平及更高的多樣性。研究結果提示，在篩選細菌亞單位疫苗候選蛋白時，利用魚體自身的免疫血清對病原菌進行抗原性分析，可以準確地反映魚體對菌體不同抗原的應答情況，抗原性鑒定結果更具參考價值。因此，本研究利用牙鲆抗血清鑒定4條陽性反應條帶，特別是45kDa蛋白，其僅與牙鲆抗血清發(fā)生陽性反應而未與小鼠抗血清發(fā)生陽性反應，它們將作為我們后續(xù)研制魚腸道弧菌亞單位疫苗的重要候選靶標蛋白。另外，與前期魚腸道弧菌抗性研究結果對比發(fā)現(xiàn)[21-22]，本研究鑒定的免疫反應陽性蛋白條帶在數量和分子量上存在一定差異，推測其原因可能是跟菌株自身特性及培養(yǎng)條件、免疫原的選擇與處理方式及免疫動物不同有關。

4　結論

本研究證實分離鑒定的魚腸道弧菌菌株CD86為引起牙鲆腹水癥的病原菌，而利用制備的菌株CD86鼠抗血清與牙鲆抗血清從全菌蛋白中鑒定出的免疫原性蛋白條帶存在明顯差異，表明牙鲆對菌體抗原產生的抗體應答與小鼠存在一定差異，該結果對研篩魚用高效的魚腸道弧菌亞單位疫苗具有重要的參考價值。

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責任編輯朱寶象

Antigenic Analysis of Total Protein ofVibrioichthyoenteriUsing Mice and Flounder Antisera

ZHANG Ming-Wei, TANG Xiao-Qian, SHENG Xiu-Zhen, XING Jing, ZHAN Wen-Bin

(Laboratory of Pathology and Immunology of Aquatic Animals, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A dominant bacterial strain named CD86 was isolated from the spleen of flounderParalichthysolivaceuswith ascites. The artificial infection experiment revealed that strain CD86 was quite virulent to healthy flounder with an LD50value of 1.8×105CFU/fish. The biochemical test was performed with Rapid ID32E strip. The results showed that all the detected indexes of strain CD86 were in agreement with the standard strain. Meanwhile, the sequence of 16S rDNA of strain CD86 showed the highest similarity with that ofVibrioichthyoenteriretrieved from the gene bank database.Vibriophylogenetic tree based on 16SrDNA sequences also showed that strain CD86 andV.ichthyoentericlustered into one blade. Combining with its biochemical result we concluded that strain CD86 was actuallyV.ichthyoenteri. Furthermore, healthy mice and flounder were immunized with formalin inactivated strain CD86. The results of ELISA showed that the titers of the antisera from mice and flounder were determined to be 12 800 and 1 200, respectively. Indirect Immunofluorescence assay showed that antisera from mice and flounder could both react with strain CD86, whereas the mice antiserum showed a stronger reaction compared with flounder antiserum. Meanwhile, Western blotting was employed to analyze the antigenicity of the whole bacterial protein of strain CD86 using the antisera from mice and flounder, and the result showed that these two antisera could both reacted with three proteins with molecular weight (MW) of 27, 30 and 37 kDa, and the proteins with MW of 19, 25, 28, 29 and 35 kDa was only recognized by mice antisera, whereas a 45 kDa protein was only recognized by flounder antisera. These results demonstrated that the antibody response patterns of mice and flounder to bacterial antigen were much different, which has important reference value for screening and developing subunit vaccine ofV.ichthyoenteri.

Vibrioichthyoenteri; isolation and identification; ELISA; western blotting; antigenicity analysis; antisera

國家自然科學基金項目(31302216;31472295;31672685)；國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目(2012CB114406)；泰山學者特聘專家項目；國家科技支撐計劃項目(2012BAD17B01)資助

2016-02-01；

2016-05-20

張銘偉(1990-)，男，碩士生，主要從事水產動物病害與免疫學研究。

??通訊作者：E-mail：tangxq@ouc.edu.cn

S91

A

1672-5174(2016)10-024-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160031

Supported by National Natural Science Foundation of China (31302216; 31472295; 31672685); National Basic Research Program of China(2012CB114406); Taishan Scholar Program of Shangdong Province; National Science and Technology Supporting Program (2012BAD17B01)