• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    海州香薷不同抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因EhvINV序列趨異及表達(dá)差異分析

    2016-11-09 02:22:47蔡深文徐仲瑞熊治廷3王加真陳瑤
    生物技術(shù)通報(bào) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:液泡香薷海州

    蔡深文徐仲瑞熊治廷,3王加真陳瑤

    (1. 遵義師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,遵義 563002;2. 武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,武漢 430079;3. 生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430079;4. 遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遵義 563002)

    海州香薷不同抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因EhvINV序列趨異及表達(dá)差異分析

    蔡深文1,3徐仲瑞2熊治廷2,3王加真4陳瑤4

    (1. 遵義師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,遵義 563002;2. 武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,武漢 430079;3. 生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430079;4. 遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遵義 563002)

    根據(jù)GenBank中海州香薷(Elsholtzia haichowensis)液泡轉(zhuǎn)化酶基因EhNvINV(JX500755)和EhCvINV(JX500756)的序列設(shè)計(jì)特異性引物,克隆cDNA全長(zhǎng)序列,并通過生物信息學(xué)分析基因及推導(dǎo)的蛋白序列,利用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模,并與蔗糖分子進(jìn)行模擬對(duì)接,實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析EhNvINV和EhCvINV在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果表明,海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白EhNvINV和EhCvINV在114和346處存在氨基酸趨異位點(diǎn),模擬3D結(jié)構(gòu)相似,僅在趨異位點(diǎn)Glu114/ Gln114和Leu346/Pro346處有差別。EhNvINV、EhCvINV和模擬突變體(EhNvINV-E114Q和EhNvINV-L346P)與蔗糖分子對(duì)接形成的活性中心構(gòu)象基本一致,但在空間位置上存在細(xì)微差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明銅脅迫7 d后,EhCvINV的表達(dá)受銅的誘導(dǎo),而EhNvINV受銅的抑制。

    海州香薷;液泡轉(zhuǎn)化酶;銅脅迫;轉(zhuǎn)錄表達(dá)

    DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.021

    生長(zhǎng)在重金屬污染土壤中的植物,其生長(zhǎng)受重金屬的脅迫,為了維持正常生長(zhǎng)代謝和重金屬抗性機(jī)制,必須獲得足夠的碳源和能量。在大多數(shù)高等植物中,產(chǎn)自葉的光合同化物以蔗糖的形式經(jīng)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到各個(gè)庫(kù)器官中[1]。庫(kù)器官對(duì)韌皮部蔗糖的卸載和利用促進(jìn)蔗糖向庫(kù)器官流動(dòng),因此庫(kù)器官中與蔗糖卸載和利用相關(guān)的酶對(duì)調(diào)控同化物分配具有關(guān)鍵作用[2],然而蔗糖必須通過蔗糖合酶或轉(zhuǎn)化酶水解為己糖才能被植物生長(zhǎng)代謝所利用。液泡轉(zhuǎn)化酶(vacuolar invertase,vINV),也稱作可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶,最適pH為酸性(pH5.0-5.5),在水解蔗糖和應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫等方面具有重要的作用[3],研究表明液泡轉(zhuǎn)化酶參與低溫、低氧、水分脅迫等環(huán)境逆境的調(diào)控過程[4]。重金屬作為一種重要的環(huán)境脅迫因子,往往影響植物的生長(zhǎng),但關(guān)于液泡轉(zhuǎn)化酶與重金屬脅迫之間的關(guān)系報(bào)道較少。

    大多數(shù)植物在高濃度銅含量的土壤中無法生長(zhǎng)和繁殖,但某些植物在長(zhǎng)期的脅迫環(huán)境下進(jìn)化出銅抗性機(jī)制,能夠在銅礦區(qū)或銅污染的土壤中生存,海州香薷(Elsholtzia haichowensis)便是其中的代表性植物[5]。海州香薷在非礦區(qū)也有分布,但礦區(qū)種群比非礦區(qū)種群具有更高的銅抗性,這可能是由于銅礦區(qū)的海州香薷長(zhǎng)期生活在高濃度銅污染的環(huán)境下,發(fā)生了與銅污染相適應(yīng)的抗性進(jìn)化,形成了與非礦區(qū)種群不同的抗性生態(tài)型。海州香薷已逐漸成為研究植物銅吸收、耐性與解毒機(jī)理的模式植物,但其基因信息還較少報(bào)道,前期研究表明海州香薷兩個(gè)不同抗性種群的液泡轉(zhuǎn)化酶活性在銅脅迫下存在差異[6],而酶活性通常與基因及其表達(dá)調(diào)控過程相關(guān),因此研究海州香薷不同抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因編碼的蛋白信息及在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá),對(duì)于進(jìn)一步深入研究銅脅迫下不同抗性種群酶活性差異的分子機(jī)制具有重要的參考意義。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1試驗(yàn)材料 海州香薷(E. haichowensis)種子分別采自湖北大冶銅綠山古銅礦遺址(抗性種群)和湖北紅安(非抗性種群)。水培14 d后剪取新鮮的根尖(約2 cm)用于RNA提取,水培及銅處理均在人工培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行,光周期14 h光照、10 h黑暗,光照強(qiáng)度122 μmol·m-2s-1,溫度控制25/15℃。

    1.1.2試劑 RNA提取使用的Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;PCR反應(yīng)所用的Ex Taq,dNTP mixture,pMD18-T載體,RNase Inhibitor,PrimeScript?RT reagent Kit(Perfect Real Time),SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time),均購(gòu)自TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT購(gòu)自Promega公司;DNA凝膠回收試劑盒和PCR清潔試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品;大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司;其他生化試劑購(gòu)自丁香園生物技術(shù)有限公司,引物由上海博道生物技術(shù)公司合成,序列測(cè)定由華大基因完成。

    1.2方法

    1.2.1海州香薷總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取兩個(gè)種群海州香薷根部的總RNA,具體操作步驟參照說明書。反轉(zhuǎn)錄酶與引物Oligo(dT)18引導(dǎo)cDNA第一鏈的合成。0.2 mL離心管中依次加入12.5 μL總RNA,3 μL Oligo(dT)18,11 μL DEPC處理的水,70℃溫浴5 min,迅速置于冰上冷卻,微離心收集溶液至離心管底部,再依次加入5×M-MLV RT Buffer 10 μL,RNase Inhibitor 1.5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)10 μL,M-MLV RT 2 μL,用移液槍吸打混勻,42℃反應(yīng)60 min,70℃溫浴10 min失活反轉(zhuǎn)錄酶,冰上分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2EhNvINV和EhCvINVcDNA全長(zhǎng)序列克隆 根據(jù)GenBank中海州香薷非抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因EhNvINV(JX500755)和抗性種群轉(zhuǎn)化酶基因EhCvINV(JX500756)序列,設(shè)計(jì)特異性引物V-FullF和V-FullR(表1)。以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為20 μL:10× Ex Taq Buffer(Mg2+plus)2 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)1 μL,PrimerF 1 μL,PrimerR 1 μL,cDNA 1μL,Ex Taq 0.2 μL,ddH2O 13.8 μL。全長(zhǎng)PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min;98℃變性10 s,50℃退火15 s,72℃延伸2 min,32個(gè)循環(huán)72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測(cè)和陽(yáng)性克隆測(cè)序。

    表1 海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶基因cDNA全長(zhǎng)克隆及RT-PCR引物

    1.2.3基因序列分析 使用NCBI網(wǎng)站的BLAST在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行海州香薷兩個(gè)種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因全長(zhǎng)序列的同源性比對(duì)分析與相似性搜索。使用ClustalX軟件將海州香薷和其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)[7]。使用MEGA4.1軟件構(gòu)建海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶基因的無根系統(tǒng)進(jìn)化樹[8]。

    1.2.4蛋白結(jié)構(gòu)分析 使用在線ExPASy序列分析工具(http://au.expasy.org/tools/)對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析,ProtParam分析蛋白的氨基酸序列組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。將海州香薷兩個(gè)種群液泡轉(zhuǎn)化酶的氨基酸序列提交至在線分析工具SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模,選擇擬南芥(Arabidopsis thaliana)酸性轉(zhuǎn)化酶基因AtcwINV1的3D蛋白結(jié)構(gòu)(PDB:2AC1,www.pdb.org)為模板,預(yù)測(cè)海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白EhNvINV和EhCvINV的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

    1.2.5分子模擬對(duì)接 海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白與蔗糖分子的模擬對(duì)接采用自動(dòng)對(duì)接軟件AutoDock4.0完成。蔗糖分子結(jié)構(gòu)來自于MMsINC數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// mms.dsfarm.unipd.it/MMsINC/)。選擇液泡轉(zhuǎn)化酶活性中心的GLU299設(shè)置為柔性殘基。蛋白分子和蔗糖分子在對(duì)接過程中同時(shí)被賦予Geister Huckel電荷,Grid大小設(shè)置為26×28×28(x、y和z),格點(diǎn)間隔為默認(rèn)值0.375 ?,Grid中心坐標(biāo)設(shè)置為74.158,112.502,-4.938(x、y和z)。Number of GA Runs設(shè)置為30,其他參數(shù)均使用系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。對(duì)接過程使用拉馬克遺傳算法(lamarckian genetic algorithm,LGA)對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行搜索和能量評(píng)價(jià),選擇結(jié)合自由能最低的構(gòu)象為最終的結(jié)合模式。同源模擬生成的PDB文件以及分子對(duì)接結(jié)果均使用PyMOL軟件顯示和分析。

    1.2.6Real-time PCR反應(yīng) 根據(jù)海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因的序列,設(shè)計(jì)Real-time PCR的上下游引物V-rtF和V-rtR(表1)。以EhACT為內(nèi)參基因[9],設(shè)計(jì)定量PCR引物Actin-F和Actin-R(表1)。使用StepOneTMReal-Time PCR System(Applied Bio-systems,USA)分析EhNvINV和EhCvINV在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。幼苗水培10 d后進(jìn)行銅處理,銅處理設(shè)對(duì)照組(不加銅)和處理組(加10 μmol/L Cu2+),Cu2+以CuCl2·2H2O的形式加入營(yíng)養(yǎng)液中。銅分別處理1 d和7 d后收獲植物,RNA提取方法同上所述,按照PrimeScript?RT reagent Kit說明書的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,染料使用SYBR?Green I(TaKaRa,Japan)。反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性30 s后,用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增,即95℃變性5 s,60℃退火和延伸30 s,共40個(gè)循環(huán),PCR擴(kuò)增結(jié)束后作60-95℃的熔解曲線。所有Real-time PCR試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)操作重復(fù)。結(jié)果表示為樣品基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量相對(duì)于非抗性種群對(duì)照組表達(dá)量的倍數(shù)。反應(yīng)結(jié)束后收集Ct值,基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

    2 結(jié)果

    2.1海州香薷總RNA提取

    海州香薷根中的總RNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)呈現(xiàn)3條清晰的條帶,其中28S rRNA的亮度約為18S rRNA的兩倍,5S rRNA亮度較低,無明顯降解,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品OD260/OD280的平均值為1.91,表明所提取的總RNA質(zhì)量較好,可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

    2.2海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因序列分析

    PCR擴(kuò)增分別得到約1 900 bp大小條帶,經(jīng)測(cè)序,非抗性和抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因的開放閱讀框均為1 914 bp,編碼637個(gè)氨基酸,EhNvINV和EhCvINV的核苷酸序列相似性為98.80%,編碼的氨基酸序列相似性為99.69%。海州香薷與NCBI上公布的其他部分雙子葉植物液泡轉(zhuǎn)化酶氨基酸推導(dǎo)序列的同源性比較,見表2。海州香薷與胡蘿卜(Daucus carota)和咖啡(Coffea canephora)的相似性最高,達(dá)75%。

    表2 海州香薷非礦區(qū)種群與其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶氨基酸推導(dǎo)序列的同源性比較

    海州香薷與部分其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果,見圖1。EhNvINV和EhCvINV均具有植物液泡轉(zhuǎn)化酶的13個(gè)保守區(qū)域,其中包括液泡轉(zhuǎn)化酶的兩個(gè)最為保守的特征序列β-呋喃果糖苷基序(NDPN)和半胱氨酸殘基催化區(qū)(WECVD),EhNvINV和EhCvINV具有5個(gè)糖基化位點(diǎn)(NXS/T)。兩個(gè)不同抗性種群的液泡轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列存在趨異位點(diǎn),EhNvINV的第114和346位氨基酸分別為Glu和Leu,而EhCvINV對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸為Gln和Pro。這些趨異位點(diǎn)都位于13個(gè)保守區(qū)域外。

    為進(jìn)一步證實(shí)所克隆的基因?qū)儆诤V菹戕敢号蒉D(zhuǎn)化酶基因,構(gòu)建了與其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的無根進(jìn)化樹。結(jié)果(圖2)顯示,進(jìn)化樹分為4個(gè)類群,分別為(Ⅰ)果糖基轉(zhuǎn)移酶、(Ⅱ)單子葉植物液泡轉(zhuǎn)化酶、(Ⅲ)雙子葉植物液泡轉(zhuǎn)化酶、(Ⅳ)雙子葉植物細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶。EhNvINV和EhCvINV屬于雙子葉植物液泡壁轉(zhuǎn)化酶。

    2.3海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白基本特征

    兩個(gè)種群海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白的氨基酸組成基本一致,天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)和纈氨酸(Val)含量較高,均高于6%,無吡咯賴氨酸(Pyl)和含硒半胱氨酸(Sec)(圖3)。推導(dǎo)的非抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白

    原子總數(shù)為9 933個(gè),分子式C3226H4910N822O964S11,分子量為70.986 kD,理論等電點(diǎn)為4.89??剐苑N群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白原子總數(shù)為9 929個(gè),分子式C3225H4907N823O963S11,分子量為70.969 kD,理論等電點(diǎn)為4.91。

    2.4海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白3D結(jié)構(gòu)

    非抗性和抗性種群海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白的3D結(jié)構(gòu)相似,僅在趨異位點(diǎn)Glu114/Gln114和Leu346/Pro346處有細(xì)微的差別,如圖4所示。液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白由N-末端類似螺旋槳形狀的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)域和C-末端的β-折疊區(qū)組成,這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)較短的α螺旋連接。其中N-末端的結(jié)構(gòu)域由5個(gè)β轉(zhuǎn)角組成,主要負(fù)責(zé)與底物蔗糖結(jié)合,是酶的催化中心,C-末端的結(jié)構(gòu)域由2組反向平行的β折疊組成。

    2.5海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白模擬突變與分子對(duì)接

    本研究從液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白與底物結(jié)合的角度進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬分析,以EhNvINV為基礎(chǔ),在兩個(gè)種群間的趨異位點(diǎn)處進(jìn)行模擬定點(diǎn)突變,獲得突變體酶蛋白分子EhNvINV-E114Q和EhNvINV-L346P,并分別與蔗糖分子進(jìn)行對(duì)接。首先使用擬南芥酸性轉(zhuǎn)化酶蛋白AtcwINV1(PDB ID:2AC1)[10]、突變體AtcwINV1-E203Q(PDB ID:2OXB)、AtcwINV1-E203A(PDB ID:2QQV)和AtcwINV1-D239A(PDB ID:2QQU)[11]的晶體結(jié)構(gòu)模型檢測(cè)海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白與蔗糖的對(duì)接程序,確保對(duì)接結(jié)果的可靠性。

    液泡轉(zhuǎn)化酶與蔗糖分子的對(duì)接模擬結(jié)果(圖5)顯示,蔗糖分子在EhNvINV和EhCvINV催化活性中心的構(gòu)象基本一致,呋喃果糖環(huán)上的氧原子O6分別與Q136上的OE1和W144上的NE1,O4分別與T180上的N和D244上的OD1,O3分別與D244上的OD2、R243上的NE和E299上的OE2,O2與N119上的ND2,O1與D120上的OD1之間形成氫鍵相互作用。吡喃葡萄糖環(huán)上的O2與E299上的OE2,O3與D332上的OD2之間也形成了氫鍵相互作用,使蔗糖分子穩(wěn)定地結(jié)合在液泡轉(zhuǎn)化酶的催化活性中心。

    突變體EhNvINV-E114Q和蔗糖分子的對(duì)接構(gòu)象與EhNvINV基本一致,而對(duì)于EhNvINV-L346P,與EhNvINV和蔗糖分子的對(duì)接構(gòu)象相比較,呋喃果糖環(huán)上的氧原子O6與W144上的NE1,O3與R243上的NE無氫鍵相互作用,而O4與Q136上的OE1,O1與N119上的ND2之間具有氫鍵相互作用。EhNvINV、EhCvINV、EhNvINV-E114Q、EhNvINVL346P與蔗糖分子的對(duì)接模型表明蔗糖分子在酶活性中心的空間位置上存在細(xì)微差異,計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接的結(jié)合能差異較?。ū?),分別為-6.03 kcal/ mol、-6.00 kcal/mol、-6.04 kcal/mol和-5.99 kcal/mol。

    圖1 海州香薷與其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果

    2.6銅脅迫下海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異

    銅脅迫下海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量如圖6所示,銅處理1 d后,與對(duì)照組相比,海州香薷EhNvINV基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著升高(P < 0.05),銅脅迫下,EhNvINV的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于EhCvINV(P < 0.05)。銅處理7 d后,EhNvINV基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與對(duì)照組無顯著表達(dá)差異,而EhCvINV基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P < 0.05),且比EhNvINV基因在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量高約4.5倍。

    圖2 海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶與其他植物酸性轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的無根進(jìn)化樹分析

    圖3 海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白氨基酸組成

    3 討論

    圖4 海州香薷兩個(gè)種群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白模擬3D結(jié)構(gòu)

    本研究克隆的EhNvINV和EhCvINV具有植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因的多個(gè)保守序列(圖1),包括β-呋喃果糖苷酶(NDPN)和催化區(qū)域的重要組成部分(WECP/VD)這兩個(gè)最為保守的特征基序。幾乎所有高等植物的液泡轉(zhuǎn)化酶在催化區(qū)域的保守位點(diǎn)上都有一個(gè)纈氨酸(V)[12],海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶(EhNvINV和EhCvINV)也同樣如此。植物酸性轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性較高,具有相同的保守區(qū)域,如蔗糖結(jié)合基序、RDP基序和EC基序[13]。但液泡轉(zhuǎn)化酶與細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的區(qū)別主要在于前者具有一些典型的特征序列,如所有雙子葉植物和大部分單子葉植物的液泡轉(zhuǎn)化酶在前肽區(qū)域具有一個(gè)保守序列R[G/A/P]XXXGVS[E/D/M]K,所有已知的液泡轉(zhuǎn)化酶在成熟蛋白起始位點(diǎn)附近有一個(gè)保守序列WXXX[M/IV]LXWQ[14]。EhNvINV和EhCvINV具有這兩個(gè)保存序列RGVAQGVSEK(第74-83位氨基酸)和WTNVMLSWQ(第97-105位氨基酸)。分子進(jìn)化樹分析也表明EhNvINV和EhCvINV屬于雙子葉植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因家族成員。

    表3 海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶及模擬突變體與蔗糖對(duì)接的最佳結(jié)合能

    圖5 海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白及模擬突變體與蔗糖的對(duì)接模型示意圖

    圖6 銅處理1 d和7 d后海州香薷兩個(gè)種群根中EhNvINV和EhCvINV基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量

    海州香薷非抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶EhNvINV與抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶EhCvINV的氨基酸序列存在兩個(gè)趨異位點(diǎn),這可能是由于抗性種群長(zhǎng)期生活在銅脅迫下發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化。研究表明氨基酸序列的改變可能會(huì)導(dǎo)致蛋白活性的改變,如Ritsema等[15]報(bào)道,替換洋蔥(Allium cepa)液泡轉(zhuǎn)化酶中的33個(gè)氨基酸(第143-175位),將會(huì)使液泡轉(zhuǎn)化酶的蛋白活性從水解蔗糖變?yōu)樘腔D(zhuǎn)移(把蔗糖轉(zhuǎn)換成果聚糖)。NDPN基序和EC基序在轉(zhuǎn)化酶中高度保守,如果將Asp23替換為Asn23,或者將Glu203替換為Ala203,轉(zhuǎn)化酶將失去活性[16]。除高度保守的NDPN、RDP和EC基序外,其附近的氨基酸殘基Trp82、Asp239和Lys242對(duì)于底物分子結(jié)合的穩(wěn)定性也具有重要意義,這些位點(diǎn)的突變將改變轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖的活性參數(shù),如Km和Kcat值[11,17,18]。海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶EhNvINV和EhCvINV對(duì)應(yīng)的NDPN、EC和RDP基序中3個(gè)保守的同源氨基酸分別為Asp120、Asp244和Glu299。AtcwINV1的Trp82、Asp239和Lys242同氨基酸在EhNvINV和EhCvINV中分別為Trp144、Asp332和Lys335,EhNvINV和EhCvINV的趨異氨基酸位點(diǎn)均不在上述活性位點(diǎn)或其附近。

    EhNvINV和EhCvINV的2個(gè)趨異位點(diǎn)雖然不在活性中心,但Glu114/Gln114靠近活性中心,且Glu114/Gln114緊鄰保守區(qū)域YHFQP(109-113)和WMNDPNGP(117-124)。這些氨基酸殘基結(jié)構(gòu)的差異可能會(huì)導(dǎo)致其臨近區(qū)域的蛋白構(gòu)象發(fā)生細(xì)微改變,而這種細(xì)微改變可能會(huì)影響到蛋白的穩(wěn)定性或活性。在玉米(Zea mays)細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶INCW2中,C末端的一個(gè)胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?dǎo)致Pro變?yōu)長(zhǎng)eu,盡管這個(gè)突變位點(diǎn)不在催化活性中心(WECPD),不在糖基化位點(diǎn),也不在β-呋喃果糖基序(NDPNG)中,但突變使INCW2的蛋白活性在Incw2轉(zhuǎn)錄正常的情況下僅為正常值的6%,這可能是由于該位點(diǎn)的Pro被替換后降低了整個(gè)蛋白的穩(wěn)定性[19]。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果(圖4)顯示,海州香薷不同抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶的趨異位點(diǎn)未造成蛋白構(gòu)象的顯著差異,分子對(duì)接結(jié)果表明EhNvINV和EhCvINV與蔗糖分子的結(jié)合構(gòu)象基本一致,且與蔗糖分子對(duì)接的結(jié)合能差異較小,可能趨異的氨基酸位點(diǎn)對(duì)活性中心的構(gòu)象沒有產(chǎn)生影響。然而蔗糖分子與液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白催化活性中心氨基酸之間的空間距離具有細(xì)微差異(圖5),這種細(xì)微差別可能是由于趨異氨基酸的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致其附近的氨基酸殘基的構(gòu)象發(fā)生了改變,盡管這種改變很小,但也可能會(huì)傳遞至活性中心的氨基酸,從而使活性中心底物結(jié)合的口袋構(gòu)象表現(xiàn)出細(xì)微的差異,這種構(gòu)象上的細(xì)微差異是否會(huì)導(dǎo)致不同種群間液泡轉(zhuǎn)化酶的活性表現(xiàn)出顯著差異還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果(圖6)表明,銅脅迫1 d后EhNvINV的表達(dá)顯著高于EhCvINV,這可能是由于非抗性種群在受到銅脅迫后產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)液泡轉(zhuǎn)化酶大量表達(dá)。銅脅迫7 d后,EhNvINV基因的表達(dá)受到抑制,這可能與液泡轉(zhuǎn)化酶受多種脅迫調(diào)控相關(guān)。液泡轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)會(huì)受到外界環(huán)境條件的抑制,如小麥(Triticum aestivum)在受到短暫的缺水脅迫后,其花藥的液泡轉(zhuǎn)化酶基因Ivr5在雄性減數(shù)分裂期下調(diào)表達(dá)[20]。玉米子房在干旱脅迫下也表現(xiàn)出液泡轉(zhuǎn)化酶mRNA表達(dá)量下降[21]。銅脅迫7 d后EhCvINV表達(dá)量顯著升高,這可能是因?yàn)榭剐苑N群在長(zhǎng)期的銅脅迫環(huán)境下進(jìn)化的抗性機(jī)制使之與非抗性種群的液泡轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)存在差異。由于在銅脅迫下抗性種群的海州香薷需要大量的己糖提供碳源和能量用于維持脅迫響應(yīng),液泡轉(zhuǎn)化酶基因可能在銅脅迫條件下對(duì)海州香薷的微進(jìn)化過程中起著輔助基因的作用。因此,在海州香薷定居銅綠山高濃度銅含量環(huán)境的進(jìn)化過程中,銅脅迫誘導(dǎo)作用可能強(qiáng)化了液泡轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)的水平,從而使EhCvINV的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量高于EhNvINV。環(huán)境脅迫抗性植物通常通過上調(diào)表達(dá)酸性轉(zhuǎn)化酶基因,產(chǎn)生更多的小分子碳水化合物(葡萄糖和果糖)作為碳源和能量用于適應(yīng)環(huán)境脅迫。如耐低溫水稻品種R31的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因OSINV4表達(dá)不會(huì)受到低溫的抑制[22]。液泡轉(zhuǎn)化酶基因在銅脅迫下的表達(dá)差異不僅在海州香薷的兩個(gè)不同抗性種群中表現(xiàn),在羊蹄[23]和齒果酸模[24]中也有報(bào)道,均表現(xiàn)為非抗性種群的液泡轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)受到銅的抑制,而抗性種群受銅的誘導(dǎo)。

    4 結(jié)論

    本研究克隆的EhNvINV和EhCvINV基因?qū)儆谝号蒉D(zhuǎn)化酶基因家族成員,推導(dǎo)的蛋白序列存在2個(gè)氨基酸趨異位點(diǎn),其中非抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶EhNvINV在114和346位分別為谷氨酸和亮氨酸,而抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶EhCvINV在這兩個(gè)位點(diǎn)分別為谷氨酰胺和脯氨酸。

    同源模擬表明二者的3D結(jié)構(gòu)相似,僅在趨異位點(diǎn)Glu114/Gln114和Leu346/Pro346處有細(xì)微的差別。EhNvINV、EhCvINV和模擬突變體(EhNvINVE114Q和EhNvINV-L346P)與蔗糖分子對(duì)接形成的活性中心構(gòu)象基本一致,但在空間位置上存在細(xì)微差異,這些結(jié)構(gòu)上的差異可能是造成兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性差異的原因之一。

    銅脅迫7 d后,EhCvINV的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于EhNvINV,可能是抗性種群在長(zhǎng)期的銅脅迫環(huán)境下進(jìn)化的抗性機(jī)制需要更多的己糖提供碳源和能量來維持。

    [1]Rolland F, Baena-Gonzalez E, Sheen J. Sugar sensing and signaling in plants:conserved and novel mechanisms[J]. Annual Review of Plant Biology, 2006, 58(1):675-709.

    [2]Koch K. Sucrose metabolism:regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant development[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2004, 7(3):235-246.

    [3]Ruan YL, Jin Y, Yang YJ, et al. Sugar input, metabolism, and signaling mediated by invertase:roles in development, yield potential, and response to drought and heat[J]. Molecular Plant,2010, 3(6):942-955.

    [4]Albacete A, Grosskinsky DK, Roitsch T. Trick and treat:a review on the function and regulation of plant invertases in the abiotic stress response[J]. Phyton, 2011, 50(2):181-204.

    [5]Liu J, Xiong Z. Differences in accumulation and physiological response to copper stress in three populations of Elsholtzia haichowensis S[J]. Water, Air, and Soil Pollution, 2005, 168(1-4):5-16.

    [6]Cai SW, Xiong ZT, Li L, et al. Differential responses of root growth, acid invertase activity and transcript level to copper stress in two contrasting populations of Elsholtzia haichowensis[J]. Ecotoxicology, 2014, 23(1):76-91.

    [7]Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, et al. The CLUSTAL_ X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality qnalysis tools[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(24):4876-4882.

    [8]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8):1596-1599.

    [9]蔡深文, 熊治廷, 劉晨, 等. 海州香薷Actin基因片段克隆及表達(dá)分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31(2):111-115.

    [10]Verhaest M, Lammens W, Le Roy K, et al. X-ray diffraction structure of a cell-wall invertase from Arabidopsis thaliana[J]. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 2006,62(12):1555-1563.

    [11]Lammens W, Le Roy K, Van Laere A, et al. Crystal structures of Arabidopsis thaliana cell-wall invertase mutants in complex with sucrose[J]. Journal of Molecular Biology, 2008, 377(2):378-385.

    [12]Tymowska-Lalanne Z, Kreis M. The plant invertases:physiology,biochemistry and molecular biology[J]. Advances in Botanical Research, 1998, 28(3):71-117.

    [13]Ritsema T, Smeekens SCM. Engineering fructan metabolism in plants[J]. Journal of Plant Physiology, 2003, 160(7):811-820.

    [14]Van den Ende W, Michiels A, Le Roy K, et al. Cloning of a vacuolar invertase from Belgian endive leaves(Cichorium intybus)[J]. Physiologia Plantarum, 2002, 115(4):504-512.

    [15]Ritsema T, Hernandez L, Verhaar A, et al. Developing fructansynthesizing capability in a plant invertase via mutations in the sucrose-binding box[J]. Plant Journal, 2006, 48(2):228-237.

    [16]Goetz M, Roitsch T. Identification of amino acids essential for enzymatic activity of plant invertases[J]. Journal of Plant Physiology, 2000, 157(5):581-585.

    [17]Le Roy K, Lammens W, Verhaest M, et al. Unraveling the difference between invertases and fructan exohydrolases:A single mmino acid(Asp-239)substitution transforms Arabidopsis cell wall invertase1 into a fructan 1-exohydrolase[J]. Plant Physiology, 2007, 145(3):616-625.

    [18]Mátrai J, Lammens W, Jonckheer A, et al. An alternate sucrose binding mode in the E203Q Arabidopsis invertase mutant:An X-ray crystallography and docking study[J]. Proteins:Structure,F(xiàn)unction, and Bioinformatics, 2008, 71(2):552-564.

    [19]Carlson SJ, Shanker S, Chourey PS. A point mutation at the Miniature1 seed locus reduces levels of the encoded protein, but not its mRNA, in maize[J]. Molecular and General Genetics MGG, 2000, 263(2):367-373.

    [20]Koonjul PK, Minhas JS, Nunes C, et al. Selective transcriptional down-regulation of anther invertases precedes the failure of pollen development in water-stressed wheat[J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(409):179-190.

    [21]Andersen MN, Asch F, Wu Y, et al. Soluble invertase expression is an early target of drought stress during the critical, abortionsensitive phase of young ovary development in maize[J]. Plant Physiology, 2002, 130(2):591-604.

    [22]Oliver SN, Van Dongen JT, Alfred SC, et al. Cold-induced repression of the rice anther-specific cell wall invertase gene OSINV4 is correlated with sucrose accumulation and pollen sterility[J]. Plant, Cell and Environment, 2005, 28(12):1534-1551.

    [23]Huang WX, Cao Y, Huang LJ, et al. Differential expression of acid invertase genes in roots of metallicolous and non-metallicolous populations of Rumex japonicus under copper stress[J]. Chemosphere, 2011, 84(10):1432-1439.

    [24]Cai SW, Huang WX, Xiong ZT, et al. Comparative study of root growth and sucrose-cleaving enzymes in metallicolous and nonmetallicolous populations of Rumex dentatus under copper stress[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2013, 98(11):95-102.

    (責(zé)任編輯 李楠)

    Sequence Divergence and Analysis of Expression Difference of Vacuolar Invertase Gene EhvINV from Different Resistant Populations in Elsholtzia haichowensis

    CAI Shen-wen1,3XU Zhong-rui2XIONG Zhi-ting2,3WANG Jia-zhen4CHEN Yao4
    (1. College of Resources and Environment,Zunyi Normal College,Zunyi 563002;2. School of Resource and Environmental Sciences,Wuhan University,Wuhan 430079;3. Hubei Biomass-Resource Chemistry and Environmental Biotechnology Key Laboratory,Wuhan 430079;4. College of Life Science,Zunyi Normal College,Zunyi 563002)

    Specific primers were designed to clone the cDNA sequences according to the EhNvINV(JX500755)and EhCvINV(JX500756)from GenBank. The DNA and deduced amino acid sequences were analyzed by bioinformatics methods. The three-dimensional structures were constructed by homologous modeling. The structures of vacuolar invertase from two populations of E. haichowensis and nontolerant population with each single point mutation in complex with sucrose were simulated by AutoDock 4.0. Transcript expression of EhNvINV and EhCvINV under copper tress was analyzed by real-time PCR. The results showed that there were two divergent amino acids at position 114 and 346 between EhNvINV and EhCcINV. The three-dimensional structures were exactly similar between EhNvINV and EhCvINV. It showed difference at Glu114/Gln114 and Leu346/Pro346,which were divergent sites. The structures of catalytic active center of EhNvINV,EhCvINV,and simulated mutants(EhNvINV-E114Q,EhNvINV-L346P)binding with sucrose showed no significant differences. However,there were differences on spatial position. The result of real-time PCR indicated that the transcript expression of EhCvINV induced by copper stress after 7 days,however,the transcript expression of EhNvINV inhibited by copper stress after 7 days.

    Elsholtzia haichowensis;vacuolar invertase;copper stress;transcript expression

    2016-04-19

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21477093,31270432),生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(HBRCEBL-2013-2014004),遵義師范學(xué)院博士基金項(xiàng)目(遵師BS[2014]20號(hào))

    蔡深文,男,博士,副教授,研究方向:環(huán)境生物學(xué);E-mail:caishenwen@163.com

    猜你喜歡
    液泡香薷海州
    近代海州城市中心的轉(zhuǎn)移與發(fā)展困境
    江蘇地方志(2023年6期)2024-01-18 07:07:48
    江蘇省海州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)示范園
    《海州繡——十二生肖兒童吉祥玩具》
    海州刺綉
    植物液泡膜H+-ATPase和H+-PPase 研究進(jìn)展
    白念珠菌液泡的致病性作用
    黃連香薷飲中4種成分在大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:10
    香薷揮發(fā)油對(duì)濕困脾胃證模型大鼠的作用
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:22
    農(nóng)用紙膜破損試驗(yàn)
    香薷?jìng)鹘y(tǒng)栽培技術(shù)及應(yīng)用研究
    亚洲av成人一区二区三| 少妇粗大呻吟视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产精品电影一区二区三区| 日韩欧美在线二视频| 中出人妻视频一区二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲成av人片免费观看| 国产色视频综合| 久久久国产成人免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 女人被狂操c到高潮| 欧美成人免费av一区二区三区| www国产在线视频色| 国产激情久久老熟女| 亚洲第一电影网av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 美女 人体艺术 gogo| 一级片免费观看大全| 啦啦啦 在线观看视频| a级毛片a级免费在线| 黄频高清免费视频| 成人午夜高清在线视频 | 亚洲第一电影网av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 黄色丝袜av网址大全| 中文字幕久久专区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一本综合久久免费| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲一区中文字幕在线| 搞女人的毛片| 中文资源天堂在线| 亚洲午夜理论影院| 天天一区二区日本电影三级| 女同久久另类99精品国产91| 丝袜在线中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产三级在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 男女视频在线观看网站免费 | 91国产中文字幕| 99riav亚洲国产免费| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩大码丰满熟妇| 在线观看免费日韩欧美大片| 麻豆av在线久日| 亚洲国产欧美一区二区综合| 最近最新免费中文字幕在线| av视频在线观看入口| av超薄肉色丝袜交足视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲第一电影网av| 久久久久久久久中文| 在线观看66精品国产| 国产精品久久久av美女十八| www.999成人在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久精品成人免费网站| 亚洲成a人片在线一区二区| 日韩欧美在线二视频| 精品福利观看| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲全国av大片| 国产精品九九99| 美女 人体艺术 gogo| 久久精品国产综合久久久| 最好的美女福利视频网| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 长腿黑丝高跟| aaaaa片日本免费| 国产精品亚洲美女久久久| 色在线成人网| 一级片免费观看大全| 精品久久久久久久久久久久久 | 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲欧美精品综合久久99| 757午夜福利合集在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 日韩高清综合在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 男人舔女人的私密视频| 99国产综合亚洲精品| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 搡老熟女国产l中国老女人| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产不卡一卡二| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲电影在线观看av| 亚洲av美国av| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲男人的天堂狠狠| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品免费一区二区三区在线| 女警被强在线播放| 又黄又爽又免费观看的视频| 男女床上黄色一级片免费看| 精品无人区乱码1区二区| 一级作爱视频免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 悠悠久久av| 午夜福利免费观看在线| 欧美中文综合在线视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本在线视频免费播放| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 免费在线观看完整版高清| 国产欧美日韩一区二区精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 色老头精品视频在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 麻豆成人av在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 岛国视频午夜一区免费看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜久久久久精精品| 一级毛片女人18水好多| 色播亚洲综合网| 久久香蕉激情| 久久久国产成人精品二区| 正在播放国产对白刺激| 婷婷丁香在线五月| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精品人妻1区二区| 亚洲精品美女久久av网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲av美国av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人国产一区最新在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美在线黄色| 男女之事视频高清在线观看| 成人午夜高清在线视频 | 日本免费a在线| 久久九九热精品免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品 欧美亚洲| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲自拍偷在线| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美日韩一级在线毛片| 狂野欧美激情性xxxx| 伦理电影免费视频| 成人国产综合亚洲| 精品久久久久久,| 成人亚洲精品一区在线观看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本黄色视频三级网站网址| 久久中文字幕人妻熟女| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本五十路高清| 日本 欧美在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 91成人精品电影| 国产精品 国内视频| 久久青草综合色| 久久国产乱子伦精品免费另类| 日本 欧美在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产亚洲欧美在线一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 97碰自拍视频| 青草久久国产| 又黄又爽又免费观看的视频| 在线天堂中文资源库| 性欧美人与动物交配| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 啪啪无遮挡十八禁网站| 一本综合久久免费| 国产91精品成人一区二区三区| 很黄的视频免费| 老司机在亚洲福利影院| 女性生殖器流出的白浆| 九色国产91popny在线| 国产男靠女视频免费网站| 久久精品91无色码中文字幕| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 中文字幕最新亚洲高清| 国产成人av激情在线播放| 一本大道久久a久久精品| 久久久久久九九精品二区国产 | 午夜福利18| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜久久久久精精品| 亚洲真实伦在线观看| 又大又爽又粗| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲电影在线观看av| 91av网站免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| av在线播放免费不卡| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 露出奶头的视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品影院久久| 男人操女人黄网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 极品教师在线免费播放| 久久 成人 亚洲| 色综合亚洲欧美另类图片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 手机成人av网站| 久久久久久国产a免费观看| 人妻久久中文字幕网| av免费在线观看网站| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲第一电影网av| 一级毛片高清免费大全| 欧美日韩黄片免| 亚洲激情在线av| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 天堂动漫精品| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美丝袜亚洲另类 | av免费在线观看网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 免费在线观看日本一区| 国产私拍福利视频在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产野战对白在线观看| 99久久国产精品久久久| 国产成人欧美| a在线观看视频网站| 欧美性长视频在线观看| 香蕉丝袜av| 日本一本二区三区精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 女性生殖器流出的白浆| 久久青草综合色| 一a级毛片在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 一级黄色大片毛片| 国产高清有码在线观看视频 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品久久久久久久久久久久久 | 精品无人区乱码1区二区| 日本黄色视频三级网站网址| 久久久久国内视频| 在线观看66精品国产| 一夜夜www| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美黑人精品巨大| 成熟少妇高潮喷水视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 午夜老司机福利片| 国产爱豆传媒在线观看 | 怎么达到女性高潮| 国产成年人精品一区二区| 欧美中文综合在线视频| 99re在线观看精品视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 成人av一区二区三区在线看| www.www免费av| 国产精品国产高清国产av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 脱女人内裤的视频| 哪里可以看免费的av片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲人成伊人成综合网2020| 丝袜在线中文字幕| 国产欧美日韩一区二区精品| 妹子高潮喷水视频| tocl精华| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久九九热精品免费| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 两个人视频免费观看高清| 久久精品国产综合久久久| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩大尺度精品在线看网址| 老汉色av国产亚洲站长工具| 91老司机精品| 国产av一区二区精品久久| 性欧美人与动物交配| 久久久久亚洲av毛片大全| 麻豆国产av国片精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产成人精品久久二区二区91| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 精品久久久久久久久久免费视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲久久久国产精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美另类亚洲清纯唯美| avwww免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 美女午夜性视频免费| 免费在线观看成人毛片| 手机成人av网站| 深夜精品福利| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久伊人香网站| 又黄又粗又硬又大视频| 91成人精品电影| 成人午夜高清在线视频 | 久热这里只有精品99| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲国产看品久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产人伦9x9x在线观看| 好男人电影高清在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 男女那种视频在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品第一国产精品| 亚洲精品在线观看二区| a级毛片在线看网站| 国内精品久久久久精免费| 久久天堂一区二区三区四区| 高清在线国产一区| 久久中文看片网| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 成人精品一区二区免费| 亚洲七黄色美女视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 狂野欧美激情性xxxx| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品九九99| 欧美成人免费av一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 淫秽高清视频在线观看| 国产激情久久老熟女| 精品国产一区二区三区四区第35| 午夜成年电影在线免费观看| 一进一出好大好爽视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 老司机福利观看| 丁香欧美五月| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产片内射在线| 亚洲激情在线av| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 我的亚洲天堂| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜日韩欧美国产| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产伦在线观看视频一区| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 麻豆av在线久日| 亚洲中文字幕日韩| 在线观看免费午夜福利视频| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 午夜福利成人在线免费观看| 1024香蕉在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | av天堂在线播放| 国产97色在线日韩免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日韩欧美在线二视频| 亚洲激情在线av| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 一级毛片精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久热爱精品视频在线9| 午夜免费激情av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产野战对白在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 1024香蕉在线观看| 成人欧美大片| 欧美激情高清一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av| 一区二区三区精品91| 成人av一区二区三区在线看| 桃色一区二区三区在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 黄色视频不卡| 在线播放国产精品三级| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美乱妇无乱码| 老司机在亚洲福利影院| 欧美zozozo另类| netflix在线观看网站| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 国产av一区二区精品久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 97碰自拍视频| 一级作爱视频免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 黄片播放在线免费| av在线播放免费不卡| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久香蕉激情| 亚洲精品国产区一区二| 欧美成人一区二区免费高清观看 | aaaaa片日本免费| 久久久久久人人人人人| 18美女黄网站色大片免费观看| 激情在线观看视频在线高清| 制服丝袜大香蕉在线| 色播在线永久视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久青草综合色| 久久精品影院6| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久中文看片网| 国产片内射在线| 一a级毛片在线观看| 中出人妻视频一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲欧美激情综合另类| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产区一区二久久| www.自偷自拍.com| 一进一出抽搐动态| 久久久久久九九精品二区国产 | 精品无人区乱码1区二区| ponron亚洲| 在线观看日韩欧美| 999精品在线视频| 一本久久中文字幕| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费人成视频x8x8入口观看| www日本在线高清视频| 露出奶头的视频| netflix在线观看网站| 淫秽高清视频在线观看| 成人欧美大片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美乱码精品一区二区三区| or卡值多少钱| 看片在线看免费视频| 一二三四社区在线视频社区8| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲av熟女| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久久久久午夜电影| 国产1区2区3区精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产免费男女视频| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美日本视频| a在线观看视频网站| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产黄片美女视频| 亚洲成人久久爱视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲精华国产精华精| 在线观看免费日韩欧美大片| 日本熟妇午夜| 丝袜美腿诱惑在线| 波多野结衣巨乳人妻| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费观看精品视频网站| www.999成人在线观看| 一级毛片高清免费大全| 淫秽高清视频在线观看| 国产精品野战在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产av不卡久久| 可以在线观看毛片的网站| 啦啦啦 在线观看视频| 怎么达到女性高潮| 十八禁网站免费在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产欧美日韩一区二区三| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品久久蜜臀av无| 午夜a级毛片| 天堂动漫精品| svipshipincom国产片| 欧美在线黄色| 中出人妻视频一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| aaaaa片日本免费| 国产av在哪里看| 一进一出抽搐动态| 欧美又色又爽又黄视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 欧美黑人精品巨大| 一级毛片精品| 亚洲精华国产精华精| 波多野结衣高清无吗| 色尼玛亚洲综合影院| a级毛片a级免费在线| 精品不卡国产一区二区三区| 女警被强在线播放| 色综合亚洲欧美另类图片| 91在线观看av| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲第一av免费看| 日日爽夜夜爽网站| 男女视频在线观看网站免费 | 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品国产高清国产av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品亚洲美女久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 丁香欧美五月| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲国产欧美一区二区综合| 97碰自拍视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 人人妻人人看人人澡| 日本 欧美在线| 亚洲真实伦在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美乱色亚洲激情| 91成年电影在线观看| 国产免费男女视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 在线观看66精品国产| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 观看免费一级毛片| av在线天堂中文字幕| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 免费看日本二区| 午夜福利一区二区在线看| 日本三级黄在线观看| 国产精品,欧美在线| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久九九精品影院| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99国产精品99久久久久| 久久久久九九精品影院| 啦啦啦免费观看视频1| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩大码丰满熟妇| 欧美在线黄色| 国产成人精品久久二区二区免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲国产看品久久| netflix在线观看网站| 精品欧美国产一区二区三| 午夜福利欧美成人| 中文字幕高清在线视频| a在线观看视频网站| 国产一区在线观看成人免费| 国产成人精品久久二区二区免费| 成人手机av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| a级毛片在线看网站| 国产区一区二久久| 搡老岳熟女国产| 久久国产精品人妻蜜桃| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产av在哪里看| 法律面前人人平等表现在哪些方面|