木薯MeNCED3基因克隆、結(jié)構(gòu)變異及其表達(dá)分析

丁澤紅 付莉莉 鐵韋韋 顏彥 胡偉

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101）

木薯MeNCED3基因克隆、結(jié)構(gòu)變異及其表達(dá)分析

丁澤紅 付莉莉 鐵韋韋 顏彥 胡偉

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

旨在揭示木薯MeNCED3基因在干旱等非生物脅迫應(yīng)答中的作用。用RT-PCR的方法從木薯葉片中克隆MeNCED3基因，用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹；用DnaSP軟件分析基因結(jié)構(gòu)變異，用熒光定量PCR技術(shù)分析MeNCED3在不同非生物脅迫下的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，從木薯中克隆了一個(gè)NCED基因MeNCED3，該基因具有1 803 bp的開放閱讀框，編碼600個(gè)氨基酸，含有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明，MeNCED3與楊樹和杞柳中同源基因的親緣關(guān)系較近，序列相似性分別達(dá)到83.9%和82.5%?；蚪Y(jié)構(gòu)變異發(fā)現(xiàn)，木薯野生種和栽培種之間共有8個(gè)錯(cuò)義突變，其中5個(gè)可能與MeNCED3的表達(dá)量有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，MeNCED3在根中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片和莖。而且，MeNCED3的表達(dá)能被PEG、ABA和NaCl處理顯著誘導(dǎo)。因此，MeNCED3在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)木薯滲透脅迫、鹽脅迫起調(diào)控作用，可作為候選基因進(jìn)一步研究其在木薯抗旱中的功能。

木薯；MeNCED3；克??；結(jié)構(gòu)變異；表達(dá)分析

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.018

木薯（Manihot esculenta Crantz）是重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物。同大多數(shù)作物一樣，干旱脅迫嚴(yán)重地影響木薯的生長(zhǎng)和發(fā)育，如生長(zhǎng)緩慢、光合作用下降等，最終導(dǎo)致木薯塊根產(chǎn)量減少［1］。前人研究表明，脫落酸（ABA）生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是調(diào)控木薯耐旱性的關(guān)鍵途徑之一［1］。9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）是ABA生物合成的關(guān)鍵酶，在木薯中克隆NCED相關(guān)基因，探討它們?cè)谀臼砜购档姆肿幼饔脵C(jī)制具有重要意義。

ABA是一種重要的植物激素，在種子萌發(fā)、成熟與休眠、果實(shí)成熟以及植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)等方面起著重要作用［2，3］。在干旱條件下，ABA被大量積累，這種累積是以ABA合成酶基因的調(diào)控為基礎(chǔ)［3］。NCED是高等植物ABA 生物合成途徑中的限速酶，其表達(dá)量的變化與ABA含量有著直接關(guān)系。NCED基因最早從玉米突變體中被克隆［4］，隨后在擬南芥［5］、番茄［6］、大豆［7］、水稻［8］和煙草［9］等植物中被克隆。對(duì)不同植物的NCED基因分析表明，這類基因由多個(gè)成員組成，在植物中普遍存在且序列高度保守，無內(nèi)含子?；谌蚪M分析，Tan等［5］最早從擬南芥中鑒定出了5個(gè)NCED成員，并檢測(cè)了它們?cè)跀M南芥轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，AtNCED2和AtNCED3在擬南芥根中大量表達(dá)，主要調(diào)控側(cè)根的萌發(fā)和生長(zhǎng)；AtNCED3、AtNCED5、AtNCED6和AtNCED9在發(fā)育的種子中表達(dá)，調(diào)控種子胚胎成熟和休眠。此外，AtNCED3在葉中的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)，積累大量的ABA以響應(yīng)水分脅迫。

NCED參與植物干旱等非生物逆境脅迫，是響應(yīng)脅迫的重要候選基因，目前木薯中與其相關(guān)的分子作用機(jī)制尚不清楚。本研究從木薯中克隆一個(gè)NCED基因成員，MeNCED3，分析其在木薯野生種和栽培種之間的結(jié)構(gòu)變異，研究其在聚乙二醇（PEG）、脫落酸（ABA）和鹽（NaCl）脅迫處理下的表達(dá)水平，旨在為進(jìn)一步研究MeNCED3的功能并解析其在木薯抗旱中的分子機(jī)理提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)所用材料木薯栽培品種（M. esculenta cv.）Ku50和Arg7及野生種（M. esculenta ssp. Flabellifolia）W14，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。

1.2方法

1.2.1材料種植與處理 在木薯種植季節(jié)（2013年5月），將Ku50粗細(xì)均勻的種莖切成長(zhǎng)度大約15 cm至少含3-4個(gè)芽眼的莖段，種植于充滿基質(zhì)（營(yíng)養(yǎng)土與蛭石以1∶1的體積比混合）的塑料盆（高18.8cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm）里，木薯種植10 d后進(jìn)行間苗。種植60 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株用20%的PEG 6000溶液模擬干旱脅迫，以不施PEG（澆灌自來水）為對(duì)照。在處理0、3和24 h后，分別收集木薯葉片（包括未展開葉、第一片完全展開葉和老葉）和根的樣本，液氮冷凍、-80℃保存待用。

此外，對(duì)種植60 d的木薯采用100 μmol/L ABA進(jìn)行葉片噴施處理，0、2、6、10、24、48和72 h后取樣；用200 mmol/L NaCl對(duì)木薯進(jìn)行灌根處理，0 h、2 h、6 h、3 d、14 d、18 d和24 d后取樣。所取樣品液氮冷凍、-80℃保存待用。

為考察木薯野生種W14和不同栽培種Ku50和Arg7中MeNCED3基因的表達(dá)情況，收集正常大田種植環(huán)境下木薯葉片（90 d）、莖（90 d）和儲(chǔ)藏根（150 d）的樣本，用于qRT-PCR分析。

1.2.2RNA提取及cDNA合成 按照RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取木薯總RNA，之后用 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒（Fermentas 公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物合成及qRT-PCR 用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括actin基因（L1：5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'；R1：5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'）［10］，MeNCED3基因qRT-PCR引物（L2：5'-TGGGATGGTTCATGCTGTCC-3'；R2：5'-TATCCCAGAGTGGCCATGGA-3'），和MeNCED3基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物（L3：5'-TCTCTCCCCCAATCAAACACC-3'；R3：5'-ACCCAGAAACAGGGTGATGC-3'）。qRT-PCR按照 SYBR Green Ⅰ試劑盒（TaKaRa公司）說明操作，反應(yīng)體系在Mx 3005P熒光定量PCR儀（Stratagene，美國(guó)）上進(jìn)行。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，表達(dá)量按照2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算［11］。

1.2.4生物信息學(xué)分析 用BLASTP搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫，獲取其他物種與MeNCED3同源性較高的序列；用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì)；用CDD數(shù)據(jù)庫（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；用MEGA5.2軟件構(gòu)建進(jìn)化樹；用DnaSPv5進(jìn)行SNP分析及ka/ks計(jì)算；用PlantCARE進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析；用ExPASy ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)。木薯栽培種Ku50和木薯野生種W14中MeNCED3基因序列由全基因組測(cè)序確定［12］；栽培種AM560中MeNCED3序列從Phytozome數(shù)據(jù)庫下載。

2　結(jié)果

2.1MeNCED3基因克隆

以擬南芥AtNCED3序列（AT3G14440）為基礎(chǔ)，在木薯數(shù)據(jù)庫尋找與其同源的序列（Manes.03-G083500.1），設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1）。測(cè)序后得到一個(gè)全長(zhǎng)為1 965 bp的MeNCED3序列，其中包括54 bp的5' UTR，1 803 bp的開放閱讀框，108 bp的3'UTR。該基因編碼600個(gè)氨基酸，與Phytozome數(shù)據(jù)庫木薯基因組（栽培品種：AM506）的注釋信息一致。經(jīng)與基因組信息比對(duì)，MeNCED3基因僅有1個(gè)外顯子。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為 66 351.2 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為6.32。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示，MeNCED3編碼的蛋白含有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域（PLN02258，圖2），進(jìn)一步證實(shí)克隆到的基因?yàn)镹CED3。

2.2MeNCED3基因進(jìn)化樹分析

經(jīng)序列比對(duì)，獲得了與MeNCED3同源性較高的其他物種序列。進(jìn)化樹分析結(jié)果（表3）表明，NCED3基因可以聚類為3組：第I組以C4物種為代表，包括玉米、谷子、狗尾草、高粱、二穗短柄草和柳枝稷，有趣的是，作為C3植物的水稻也聚類到了這一組，可能是它與二穗短柄草親緣關(guān)系較近；第II組包括擬南芥和白菜型油菜；木薯MeNCED3被聚類到第III組，它與楊樹（Potri.001G393800.1）和杞柳（SapurV1A.0617s0010.1）的親緣關(guān)系較近，序列相似性分別達(dá)到83.9%和82.5%。

圖1　MeNCED3基因全長(zhǎng)cDNA電泳圖

圖2　MeNCED3編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

2.3MeNCED3基因結(jié)構(gòu)分析

為了揭示MeNCED3在基因組結(jié)構(gòu)上的變異，本研究將AM560（來自Phytozome木薯數(shù)據(jù)庫）、Ku50和W14這3個(gè)材料中MeNCED3的DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，共發(fā)現(xiàn)23個(gè)SNP，其中有8個(gè)為非同義突變（圖4）。

序列兩兩比較表明，MeNCED3的結(jié)構(gòu)變異主要來自于栽培種與野生種之間的差異，共有23個(gè)SNP；栽培種與栽培種之間的差異很小，僅有3個(gè)SNP。栽培種與野生種ka/ks值介于0.14-0.22之間，暗示MeNCED3基因在進(jìn)化過程中受到了純化選擇。2.4 MeNCED3基因啟動(dòng)子元件分析

啟動(dòng)子是基因的重要組成部分，它與基因的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）息息相關(guān)。本研究選取MeNCED3起始密碼子上游1 500 bp進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析，發(fā)現(xiàn)了與干旱相關(guān)的元件，如MBS。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些與激素相關(guān)的元件，如赤霉素相關(guān)元件GARE-motif、水楊酸相關(guān)元件TCA-element和茉莉酸相關(guān)元件TGACG-motif，以及與光相關(guān)的元件，如Sp1、Box I和G-box等。這些結(jié)果表明，除了干旱，MeNCED3可能還參與激素和光相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖3　木薯MeNCED3基因與其他物種NCED3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4　MeNCED3基因結(jié)構(gòu)變異

2.5MeNCED3基因表達(dá)分析

通過分析MeNCED3基因在木薯野生種和栽培種不同組織的表達(dá)情況，結(jié)果（圖5-A）表明，不管是野生種還是栽培種，MeNCED3在根中的表達(dá)量都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片和莖，呈現(xiàn)出根特異性表達(dá)的特點(diǎn)。另外，與野生種W14相比，MeNCED3在栽培種Ku50和Arg7根中的表達(dá)量上升9-10倍，而葉片和莖中則變化較小。

在PEG 6000脅迫條件下，木薯栽培種Ku50不同組織中MeNCED3基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化如圖5-B所示，MeNCED3在根中能被PEG處理快速誘導(dǎo)，其表達(dá)量在脅迫3 h和24 h后分別增加了2.5和12倍。相比之下，MeNCED3在未展開葉、第一片完全展開葉和老葉中的表達(dá)量則幾乎沒有變化，而且在第一片完全展開葉和老葉中表達(dá)量極低。這些結(jié)果進(jìn)一步表明MeNCED3基因主要在木薯根中起作用。

本研究分析MeNCED3基因分別在ABA和NaCl處理下木薯Ku50葉片中表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化（圖5-C）：在ABA處理2-6 h后，MeNCED3的表達(dá)量顯著上升，在10-48 h其表達(dá)量有所下降，隨后在72 h其表達(dá)量達(dá)到最高；與ABA處理類似，在NaCl處理2 h、6 h和3 d后MeNCED3的表達(dá)量顯著升高，在14 d其表達(dá)量有所降低，在24 d達(dá)到最高表達(dá)水平（圖5-D）。這些結(jié)果充分表明，ABA和NaCl處理能夠顯著提高M(jìn)eNCED3基因的表達(dá)水平。

3　討論

NCED是高等植物ABA 生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物干旱等逆境脅迫中扮演著重要角色。目前已經(jīng)從多個(gè)物種中克隆了NCED基因，然而在熱帶作物木薯中還沒有關(guān)于NCED基因克隆的報(bào)道。本研究從木薯中克隆了一個(gè)NCED基因MeNCED3。該基因具有1 803 bp的開放閱讀框，編碼600個(gè)氨基酸，含有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域，這與前人在其他物種中的報(bào)道比較一致［8，9］；同源性分析表明，它與楊樹和杞柳的NCED3基因同源性較高。

圖5　MeNCED3基因表達(dá)分析

基因結(jié)構(gòu)變異可以引起其表達(dá)量的改變。前人通過比較測(cè)序發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtNCED3第274位和第327位氨基酸的變異可能引起AtNCED3表達(dá)量的改變，導(dǎo)致干旱條件下ABA含量的增加［13］。在本研究中，MeNCED3的表達(dá)量在木薯野生種和栽培種之間差異很大，但栽培種內(nèi)部不明顯；木薯野生種和栽培種之間共發(fā)現(xiàn)8個(gè)SNP屬于錯(cuò)義突變，而且其中3個(gè)也存在于栽培種之間，暗示另外的5個(gè)SNP可能是引起MeNCED3表達(dá)量在木薯野生種和栽培種之間差異較大的原因。

植物中有多個(gè)NCED成員，且各成員在不同組織中表達(dá)量不同，可能與它們各自不同的功能相關(guān)。如擬南芥中AtNCED2和AtNCED3主要在根中表達(dá)，負(fù)責(zé)側(cè)根的萌發(fā)和生長(zhǎng)；AtNCED5、AtNCED6和AtNCED9在發(fā)育的種子中表達(dá)，負(fù)責(zé)種子胚胎成熟和休眠［5］；水稻中OsNCED1和OsNCED3都在葉片中表達(dá)，在水分脅迫條件下，前者被顯著抑制而后者被快速誘導(dǎo)［14］。本研究在木薯中鑒定的MeNCED3基因在根中特異性表達(dá)，且能被PEG處理誘導(dǎo)，與NCED3在其他物種中的報(bào)道［5，15］比較一致。這可能是因?yàn)樵诟珊禇l件下，根是接收水分缺乏信號(hào)（如ABA信號(hào)）最早的器官，它可以吸收更深層的地下水來應(yīng)對(duì)干旱脅迫［1］。

NCED基因的表達(dá)受多種非生物脅迫的誘導(dǎo)。例如，干旱脅迫可以誘導(dǎo)NCED基因的表達(dá)和植物內(nèi)源ABA的積累，而且NCED表達(dá)量的變化與ABA含量有著直接關(guān)系［3，9］。研究表明，ABA也能夠誘導(dǎo)NCED3基因的表達(dá)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PEG和ABA處理下MeNCED3基因的表達(dá)量均顯著上升，暗示MeNCED3參與了ABA介導(dǎo)的干旱脅迫。然而，是否還有其他的木薯NCED基因參與干旱脅迫尚不清楚。與前人研究相似［16，17］，我們發(fā)現(xiàn)木薯MeNCED3基因能被NaCl顯著地誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明，MeNCED3參與了ABA和NaCl介導(dǎo)的非生物逆境脅迫應(yīng)答，但具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

采用RT-PCR的方法從木薯Ku50葉片中克隆了一個(gè)NCED基因MeNCED3，該基因編碼600個(gè)氨基酸，含有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明，MeNCED3與楊樹和杞柳中同源基因的親緣關(guān)系較近。序列比對(duì)分析表明，MeNCED3在木薯野生種和栽培種之間共有8個(gè)錯(cuò)義突變，其中5個(gè)可能與MeNCED3的表達(dá)量有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，不管是野生種還是栽培種，MeNCED3在根中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片和莖，呈現(xiàn)根特異性表達(dá)。而且，PEG、ABA和NaCl處理能顯著誘導(dǎo)MeNCED3的表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Analysis of Structure Variation and Expression of MeNCED3 Gene in Cassava

DING Ze-hong FU Li-li TIE Wei-wei YAN Yan HU Wei
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101）

To reveal the roles of MeNCED3 gene in abiotic stresses（e.g.，drought）in cassava. RT-PCR method was applied to clone MeNCED3 gene from cassava leaves，MEGA software was used to construct its phylogenetic tree，DnaSP software was used to analysis its structural variation，and quantitative RT-PCR（qRT-PCR）was used to explore its expression patterns in response to different abiotic stresses. Results showed that a NCED（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase）gene，MeNCED3，was cloned from cassava. This gene had a 1 803 bp open reading frame，encoded 600 amino acids，and contained a NCED conserved domain. Phylogenetic analysis showed that MeNCED3 had close genetic relationship with its homologs from Populus trichocarpa and Salix purpurea，and the sequence similarity was up to 83.9% and 82.5%，respectively. Genetic structural variation revealed that a total of eight mis-sense mutations were identified between wild and cultivated cassava species，of which five may be associated with the different expression levels of MeNCED3. qRT-PCR analysis revealed that MeNCED3expression was higher in roots than in leaves and stems. In addition，the expression of MeNCED3 was significantly induced by PEG，ABA and NaCl treatments. MeNCED3 played a regulatory role in both salt and osmotic stresses at the transcriptional level and it could be served as a candidate to further study its functions in drought resistance in cassava.

cassava；MeNCED3；clone；structure variation；expression analysis

2016-04-15

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20163120，20153048）

丁澤紅，男，助理研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：dingzehong@itbb.org.cn

胡 偉，男，副研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：huwei2010916@126.com