豆腐蛋白體外消化物抑制膠束轉(zhuǎn)運膽固醇作用分析

董毓玭，陳　責(zé)，宣　佳，賈　慧，趙大云*

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

豆腐蛋白體外消化物抑制膠束轉(zhuǎn)運膽固醇作用分析

董毓玭，陳責(zé)，宣佳，賈慧，趙大云*

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

大豆蛋白肽具有顯著的降血脂功效，但目前研究主要集中在小分子肽段，且對蛋白肽降血脂作用的分子機理探究較少。模擬豆腐蛋白的胃腸道消化，得到豆腐蛋白的體外消化物，按相對分子質(zhì)量（MR）分為3 個級別：＞10 000、3 000～10 000和＜3 000，利用膽固醇膠束實驗（采用兩種實驗基質(zhì)及兩種檢測方法）檢測其抑制膳食混合膠粒轉(zhuǎn)運膽固醇的作用。結(jié)果表明，在分級的3 種豆腐消化物中，MR＞10 000具有最強的抑制膳食混合膠粒轉(zhuǎn)運膽固醇作用，其膽固醇膠束吸收率為62.40%，小于陽性對照（Val-Ala-Trp-Met-Tyr，其膽固醇膠束吸收率為68.41%），且MR＞10 000豆腐消化物的抑制膠束轉(zhuǎn)運膽固醇作用隨著樣品質(zhì)量濃度增大呈先增強后減弱的趨勢。此外，膽固醇膠束實驗中采用的兩種“膳食混合膠?！钡霓D(zhuǎn)運效果及兩種檢測方法的結(jié)果均具有一致性，說明豆腐蛋白消化物具有影響膳食混合膠粒轉(zhuǎn)運和膽固醇吸收的作用。

豆腐；消化肽；膳食混合膠粒；膽固醇轉(zhuǎn)運與吸收

人體內(nèi)膽固醇等脂類組分的吸收是通過小腸腸液中的“膳食混合膠粒”（dietary mixed micelles，DMM）來轉(zhuǎn)運吸收的。經(jīng)過胃腸道蛋白酶等消化的豆腐蛋白在被進一步消化成小分子肽之前就已經(jīng)接觸到DMM從而影響膽固醇等脂類組分的轉(zhuǎn)運和吸收。近年來研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白對于高脂蛋白血癥的人群有明顯降血脂的作用［1-3］。González-Ortega等［4］的研究指出，大豆來源的多肽LPYPR具有降膽固醇作用；Inoue等［5］研究證明了3 種二肽的降甘油三酯作用；Nagaoka等［6］報道相對分子質(zhì)量（MR）＜1 000的肽段Val-Ala-Trp-Met-Tyr具有降血脂作用。但目前對大豆蛋白消化物的研究主要集中在小分子肽，而對MR＞3 000的大分子消化物的作用研究相對較少。且目前大豆蛋白及其酶解產(chǎn)物的降血脂作用研究主要通過細胞和動物實驗來進行功能性判斷［7］，鮮見對其分子機制進行深入的探討。本研究探索豆腐蛋白在消化吸收過程中的消化肽對于DMM轉(zhuǎn)運和吸收膽固醇等脂類組分的影響。

因此，本實驗采用一種常見的豆制品——豆腐來進行體外消化模擬實驗，得到豆腐蛋白體外消化物（tofu protein hydrolysates，TPH），進一步分為3 個不同MR級別的TPH：＞10 000、3 000～10 000和＜3 000。同時利用膽固醇膠束實驗對其進行研究對比，來探討TPH的抑制膠束轉(zhuǎn)運膽固醇（disruption of the transportation of micellar cholesterols，DTMC）作用，從而基于膽固醇的小腸吸收機制來分析TPH的降膽固醇作用。在膽固醇膠束實驗中，天然豬膽汁雖然成分復(fù)雜，但其具有更貼近人體膽汁狀況和更易獲取的優(yōu)點；而人工膽固醇膠束溶液由于其成分簡單，實驗干擾小，亦是一種常用的實驗基質(zhì)［8-9］，所以本實驗中采用了人工膠束和天然膽汁的對比實驗，可增強實驗的可靠性。此外，采用試劑盒法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）聯(lián)用法對具有最強DTMC作用的TPH的量效關(guān)系進行探究，嘗試建立更為精確的膽固醇檢測方法，以期為膽固醇膠束溶解度的檢測提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

老豆腐（蛋白質(zhì)含量8.5%；脂肪含量5.1%） 上海清美綠色食品有限公司；豬膽 取自上海郊區(qū)一屠宰場。

胃蛋白酶、胰酶 美國Sigma公司；人工合成肽（Val-Ala-Trp-Met-Tyr，MR854.03） Synpeptide公司；膽固醇含量檢測試劑盒 日本和光純藥工業(yè)株式會社；離心過濾器、0.22 μm濾膜 美國Millipore公司；96 孔板 美國Corning公司。

1.2儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 步琦實驗室設(shè)備（上海）貿(mào)易有限公司；臺式離心機 德國艾本德（上海）貿(mào)易有限公司；高速臺式冷凍離心機 上海盧湘儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機 上海比朗儀器有限公司；氮吹儀 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng)（600 Controller 泵；717 Plus自動進樣器；2996紫外檢測器；Anpel LAG-5000G無油空氣發(fā)生器） 美國Waters公司；ELSD 2000蒸發(fā)光散射檢測儀 美國Alltech公司；冷凍干燥機 美國Labconco公司；酶標儀 瑞士帝肯公司。

1.3方法

1.3.1樣品預(yù)處理

豆腐與70%乙醇等體積混勻。超聲波萃取3～4 h，3 000 r/min離心15 min。棄去上清液，取下層沉淀于-18 ℃冷凍保藏。豆腐制品中除了蛋白質(zhì)，還含有大豆異黃酮、植物甾醇等物質(zhì)，它們在小腸被吸收并且也具有一定的生物活性［10-11］，所以需要預(yù)處理步驟去除干擾因素。

1.3.2胃腸道消化模擬

加入1 mg/mL酶解底物——乙醇處理過的老豆腐，并用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0。豬胃黏膜蛋白酶添加量為40 mg/g底物，于37 ℃酶解90 min。再用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，豬胃黏膜蛋白酶添加量為40 mg/g底物，37 ℃酶解150 min。把模擬消化完成后的消化液沸水浴10 min滅酶活，再快速冷卻至室溫，并用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.6；待沉淀析出后，旋蒸去除多余的水溶液，6 000 r/min離心20 min。棄去下層沉淀，得到上清液，即胃腸道模擬酶解的消化液；取一半上清液冷凍干燥成粉末，為TPH；另一半上清液予以下面的超濾分級處理。

1.3.3消化產(chǎn)物超濾分級

分別用3 000和10 000兩種截留相對分子質(zhì)量的離心過濾器，取胃腸道模擬酶解的消化上清液，分為3 個MR級別的TPH：＞10 000、3 000～10 000、＜3 000，分別冷凍干燥成粉末，備用。

1.3.4分級產(chǎn)物的膽固醇膠束實驗

1.3.4.1天然豬膽汁預(yù)處理

屠宰場取新鮮豬膽4 只，刺破膽囊取膽汁于燒杯中。6 000 r/min離心20 min后，去沉淀（主要是組織殘留細胞），取上清液用pH 7.4的緩沖溶液調(diào)節(jié)豬膽濃度至2 mmol/L，于-80 ℃冰箱凍藏備用。

1.3.4.2膽固醇膠束實驗

分別準確稱量TPH以及3 個MR級別＞10 000、3 000～10 000 TPH和＜3 000的TPH，用去離子水溶解至300 mg/mL。取200 μL，加入1 800 μL稀釋的膽汁膠束溶液，使得樣品質(zhì)量濃度為30 mg/mL，將得到的2 mL溶液常溫振蕩5 min混勻。37 ℃條件下，樣品與膽汁膠束反應(yīng)1 h。15 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL用氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）萃取。萃取物氮氣吹干后，于高效液相進樣檢測其膽固醇含量。實驗中取人工合成肽（Val-Ala-Trp-Met-Tyr）作為陽性對照；以不加任何樣品的溶劑為空白組。

1.3.4.3HPLC-ELSD法檢測膽固醇含量

色譜條件：分析柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：50 ℃；流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流動相 B：0.1%三氟乙酸-甲醇溶液；洗脫梯度：0～5 min，20% A，80% B；5～15 min，0% A，100% B；15～18 min，20% A，80% B；18～25 min，20% A，80% B；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；在線脫氣（氦氣）速率：30 mL/min；HPLC-ELSD法檢測條件：漂移管溫度：52 ℃；氦氣流速：1.6 mL/min；氦氣壓力：0.2 MPa；進樣方式：不分流進樣。實驗條件參照文獻［12-13］并結(jié)合實際檢測進行了優(yōu)化。

1.3.4.4膽固醇吸收率計算

式中：S1為空白組（不加任何樣品的溶劑）膠束溶解度/（mg/mL）；S2為樣品組膠束溶解度/（mg/mL）。

1.3.5實驗方法驗證

1.3.5.1人工膽固醇膠束溶液對比天然膽汁驗證實驗

按10 mmol/L?；悄懰徕c、2 mmol/L膽固醇、5 mmol/L油酸、132 mmol/L氯化鈉、15 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），超聲波乳化20 min制備人工膽固醇膠束溶液，置于37 ℃、24 h過夜。稱取MR＞10 000 TPH用去離子水溶解至300 mg/mL。取200 μL，加入1 800 μL人工膽固醇膠束溶液中，使得樣品質(zhì)量濃度為30 mg/mL，將得到的2 mL溶液常溫振蕩5 min混勻。37 ℃條件下，樣品與人工膽固醇膠束溶液反應(yīng)1 h。15 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL用氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）萃取。萃取物氮氣吹干后，于HPLC-ELSD進樣檢測其膽固醇含量。HPLC-ELSD條件和計算方法同1.3.4節(jié)。

1.3.5.2試劑盒法驗證HPLC-ELSD法檢測膽固醇含量以及抑制膽固醇轉(zhuǎn)運量-效關(guān)系實驗

試劑盒法檢測MR＞10 000 TPH的量效關(guān)系。稱取MR＞10 000 TPH用去離子水分別溶解至100、300、600 mg/mL。分別取20 μL，加入180 μL人工膽固醇膠束溶液中，使得樣品質(zhì)量濃度為10、30、60 mg/mL，將得到的200 μL溶液常溫振蕩5 min混勻。37 ℃條件下，樣品與人工膽固醇膠束溶液反應(yīng)1 h。15 000 r/min離心20 min，取上清液2 μL，添加到每孔已有300 μL顯色劑（試劑盒自帶）的96 孔板上。37 ℃反應(yīng)5 min，于酶標儀600 nm（700 nm輔波長）波長處檢測其膽固醇含量。計算方法同1.3.4節(jié)。

HPLC-ELSD法檢測MR＞10 000 TPH的量效關(guān)系。稱取MR＞10 000 TPH用去離子水分別溶解至100、300、600 mg/mL。分別取200 μL，加入1 800 μL人工膽固醇膠束溶液中，使得樣品質(zhì)量濃度為10、30、60 mg/mL，將得到的2 mL溶液常溫振蕩5 min混勻。37 ℃條件下，樣品與人工膽固醇膠束溶液反應(yīng)1 h。15 000 r/min離心20 min，取上清液1 mL用氯仿-甲醇溶液萃取。萃取物氮氣吹干后，于HPLC進樣檢測其膽固醇含量。HPLC-ELSD條件和計算方法同1.3.4節(jié)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果與分析

2.1HPLC-ELSD檢測膽固醇含量

圖1　HPLC-ELSD法檢測標準品和樣品中的膽固醇Fig.1　Detection of cholesterol by HPLC with ELSD detector

從圖1 HPLC-ELSD法的檢測圖譜中發(fā)現(xiàn)，1.0 mg/mL的膽固醇標準溶液在22 min時有電信號輸出，可知膽固醇的保留時間為22 min。以光散射檢測的電信號積分值作為縱坐標，以0.05、0.10、0.50、1.0、2.0、5.0 mg/mL這一系列膽固醇標準溶液的膽固醇含量對數(shù)值作為橫坐標，得到標準曲線方程：y = 1.201 3x+5.835 1（R2= 0.998 1）。同時圖1B、C顯示人工膽固醇膠束溶液和天然膽汁在22 min時也均有電信號輸出，因此高效液相蒸發(fā)光散射檢測聯(lián)用法可用于膽固醇含量的檢測，圖譜基線穩(wěn)定，峰形窄尖，檢測結(jié)果直觀可靠。

2.2分級產(chǎn)物的抑制DTMC作用

大豆蛋白肽的降膽固醇作用可由抑制DTMC作用的增強而得到增強［14-17］，在人體小腸吸收時，只有形成膠束的膽固醇才可以被轉(zhuǎn)運至腸細胞表面被人體吸收利用。膽固醇膠束溶解度即為溶液中形成膠束的膽固醇的含量。所以當(dāng)添加樣品后，膽固醇膠束被破壞，溶液中的膠束減少，可被人體吸收的膽固醇的量減少。膽固醇膠束溶解度越小，則樣品的DTMC作用越強。膽固醇吸收率越低，則樣品的DTMC作用越強。故實驗中圖表常以膽固醇膠束溶解度和膽固醇吸收率表征樣品的DTMC作用。又因為血脂主要由人體血清中的膽固醇和甘油三酯構(gòu)成，所以DTMC作用也起到一定的降血脂的作用。

圖2　HPLC-ELSD法檢測不同分子質(zhì)量分級的TPH與人工合成肽的DTMC作用對比Fig.2　Comparison of micellar cholesterol transportation-disrupting activity of TPH with different MRand a synthetic peptide by HPLC-ELSD

從圖2的不同分子質(zhì)量分級的酶解物（TPH）和TPH本身以及作為陽性對照的人工合成肽Val-Ala-Trp-Met-Tyr的檢測結(jié)果來看，TPH均具有DTMC作用。TPH、MR＞10 000 TPH、MR3 000～10 000 TPH和MR＜3 000 TPH這4 種樣品在添加量為30 mg/mL時其膽固醇膠束溶解度分別為（0.445±0.003）、（0.334±0.002）、（0.454±0.001）、（0.369±0.001） mg/mL（以空白膽固醇膠束溶解度（0.535±0.002） mg/mL計）。按DTMC作用由強到弱排序依次為MR＞10 000 TPH、MR＜3 000 TPH、TPH、MR3 000～10 000 TPH；其中MR＜3 000 TPH與人工合成肽Val-Ala-Trp-Met-Tyr的DTMC作用相當(dāng)，膽固醇膠束吸收率分別為（68.90±0.45）% 和（68.41±0.63）%。MR＞10 000 TPH膽固醇膠束吸收率為（62.40±0.61）%，其DTMC作用最強。

在前人研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，Lule等［18］發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為5.5 kD的肽 Lunasin 具有潛在的抗氧化、抗炎癥、抗癌變等多種生物活性，也在調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇生物合成方面有重要作用。Ishiguro等［19］發(fā)現(xiàn)Kori-Tofu豆腐蛋白的高分子質(zhì)量物質(zhì)（high-molecular-weight fraction，HMF）的含量比大豆分離蛋白更大，從而可以表現(xiàn)出更好的降低膽固醇作用，并且物質(zhì)的降膽固醇作用與其HMF含量這兩者之間有著密切的聯(lián)系。本實驗結(jié)果（圖2）與前述［18-19］的實驗發(fā)現(xiàn)具有一致性。這可能是由于隨著胃腸道消化的進行，酶解大豆肽中具有破壞轉(zhuǎn)運膽固醇膠束作用的氨基酸片段會被機體內(nèi)胃或胰蛋白酶降解，而分子質(zhì)量大的大豆肽較為完整地保留了這些特殊的片段。

2.3實驗方法驗證

2.3.1人工膽固醇膠束溶液對比天然膽汁驗證實驗

圖3　人工膠束和稀釋天然豬膽汁的HPLC-ELSD檢測MR＞10 000 TPH的DTMC作用對比Fig.3　Comparison of micellar cholesterol transportation-disrupting activity of MR＞ 10 000 TPH with artificial micelles and swine bile by HPLC-ELSD

從圖3人工膠束和稀釋的天然膽汁的HPLC-ELSD檢測對比來看，MR＞10 000 TPH在添加量為30 mg/mL時，無論是人工膠束基質(zhì)，還是稀釋的天然豬膽汁均具有顯著DTMC作用。所以，人工膠束和天然膽汁這兩種基質(zhì)具有較好的檢測一致性，在方法上兩者可相互驗證。

2.3.2試劑盒法驗證HPLC-ELSD法檢測膽固醇以及抑制膽固醇轉(zhuǎn)運的量-效關(guān)系實驗結(jié)果

試劑盒檢測膽固醇含量是一種常見的檢測方法，但當(dāng)實驗樣本較大，試劑盒使用成本高；HPLC-ELSD檢測雖然前期實驗條件優(yōu)化困難，但是對于大量樣本較經(jīng)濟實惠。為了進一步保證HPLC檢測的實驗準確性，本實驗采用的膽固醇含量試劑盒檢測和HPLC-ELSD檢測兩種方法進行對比實驗，也進而對MR＞10 000 TPH的DTMC作用的量效關(guān)系進行了探究。

試劑盒中膽固醇含量和吸光度存在線性關(guān)系，以吸光度作為縱坐標，膽固醇含量為橫坐標，得到標準曲線方程：y = 0.116 6x+0.011 6（R2 = 0.998 2）。

圖4　試劑盒法和HPLC-ELSD法檢測不同質(zhì)量濃度下MR＞10 000TPH的DTMC作用Fig.4　Comparison of micellar cholesterol transportation-disrupting activity of MR＞ 10 000 TPH with artificial micelles at different concentrations by kit and HPLC-ELSD

對比圖4中試劑盒法和HPLC-ELSD法這兩種檢測方法的結(jié)果，可觀察到一致性，相互驗證了樣品的DTMC作用。此外，可觀察到當(dāng)TPH添加量從10 mg/mL增加到30 mg/mL時，膽固醇吸收率有顯著性下降。這可能是由于相同大小的空間內(nèi)有了更多的TPH，增加了TPH與膽固醇膠束的接觸機率，使得更多的膽固醇膠束被破壞［20］。當(dāng)以膽固醇吸收率表征時，膽固醇吸收率隨著TPH質(zhì)量濃度增大而下降，說明在實驗中膽固醇膠束溶解度占空白組膽固醇膠束溶解度的比率越來越低，而空白組膽固醇膠束溶解度始終不變，所以溶液中膽固醇膠束減少，更少的膽固醇被人體小腸吸收利用，所以在一定范圍內(nèi)，TPH的DTMC作用隨著TPH質(zhì)量濃度的增大呈增強的趨勢。然而，當(dāng)TPH質(zhì)量濃度從30 mg/mL增加到60 mg/mL時，膽固醇吸收率略微上升，表示TPH的DTMC作用減弱。這可能是由于當(dāng)TPH質(zhì)量濃度持續(xù)增大時，單位空間內(nèi)的TPH過于飽和，反而會影響TPH與膽固醇膠束的相互作用，并不能使得更多的膽固醇膠束被破壞，沒有增強DTMC的作用。

3　結(jié) 論

本實驗發(fā)現(xiàn)豆腐消化產(chǎn)物TPH對DTMC具有抑制作用，表明豆腐經(jīng)體外模擬消化后的產(chǎn)物仍具有較好的降膽固醇作用。實驗還發(fā)現(xiàn)MR＞10 000的大相對分子質(zhì)量的TPH在各級TPH中具有最強的DTMC抑制作用，其膽固醇膠束吸收率為62.40%，優(yōu)于陽性對照（其膽固醇膠束吸收率為68.41%），且MR＞10 000 TPH的DTMC作用隨著樣品質(zhì)量濃度增大呈先增強后減弱的趨勢。人工膠束和天然膽汁的轉(zhuǎn)運效果均較好，試劑盒法與HPLC-ELSD這兩種檢測方法的結(jié)果也是高度一致的，可相互驗證樣品的DTMC作用，也為膽固醇的精確定量檢測提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持，這對大豆制品降膽固醇的研究工作具有指導(dǎo)意義。

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Disrupting Effect of Peptides Derived from in Vitro Digestion of Tofu Protein on the Transportation of Micellar Cholesterol

DONG Yupin， CHEN Ze， XUAN Jia， JIA Hui， ZHAO Dayun*
（School of Agriculture and Biology， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China）

Soy protein peptides have signifi cant hypocholesterolemic activity. But at present most studies are focused on small molecular peptides， and few explorations have been made on their hypolipidemic mechanism. In the present study， an in vitro gastrointestinal digestion model was applied to simulate the gastrointestinal digestion of tofu protein. The digested products were classifi ed into three levels: ＞ 10 000， 3 000-10 000， and ＜ 1 000， according to their molecular weights （MR）. The effect of these digested products on disrupting the transportation of micellar cholesterol was explored based on dietary mixed micelles （DMM） experiments with two experimental matrixes and two test methods. The results indicated that the products with MR＞ 10 000 had the strongest suppressing effect on transportation of micellar cholesterol. The absorption rate of micellar cholesterol in their presence was 62.40%， which was superior to the positive control， VAWWMY （Val-Ala-Trp-Met-Tyr） with an absorption rate of micellar cholesterol of 68.41%. The effect of the products with MR＞ 10 000 was enhanced fi rst and then reduced with the increase in its concentration. In addition， the results of two cholesterol detection methods and the transportation effi ciencies of two cholesterol micelles were consistent. Peptides derived from in vitro digestion of tofu protein exerted a signifi cant inhibitory effect on the micellar solubility of cholesterol. The current work has provided the fi rst approach to exploring the potential effect of tofu protein hydrolysates （TPH） on reducing cholesterol absorption in the intestine.

tofu； digested peptides； dietary mixed micelles （DMM）； cholesterol transport and absorption

10.7506/spkx1002-6630-201619039

TS214.2

A

1002-6630（2016）19-0232-05

董毓玭， 陳責(zé)， 宣佳， 等. 豆腐蛋白體外消化物抑制膠束轉(zhuǎn)運膽固醇作用分析［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 232-236.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619039. http：//www.spkx.net.cn

DONG Yupin， CHEN Ze， XUAN Jia， et al. Disrupting effect of peptides derived from in vitro digestion of tofu protein on the transportation of micellar cholesterol［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 232-236. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619039. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-06

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102207-6）

董毓玭（1991—），女，碩士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：pennydong@qq.com

趙大云（1966—），男，副教授，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：dyzhao@sjtu.edu.cn