LuxS/AI-2型群體感應系統(tǒng)調(diào)控細菌生物被膜形成研究進展

劉　蕾，桂　萌，武瑞赟，3，李平蘭，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2.北京市水產(chǎn)科學研究所，北京 100068；3.內(nèi)蒙古大學生命科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

LuxS/AI-2型群體感應系統(tǒng)調(diào)控細菌生物被膜形成研究進展

劉蕾1，桂萌2，武瑞赟1，3，李平蘭1，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2.北京市水產(chǎn)科學研究所，北京 100068；3.內(nèi)蒙古大學生命科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

生物被膜是大多數(shù)細菌在自然狀態(tài)下的一種生長方式，使菌體具有浮游態(tài)時不具有的優(yōu)勢。它的形成和發(fā)展受到群體感應系統(tǒng)的調(diào)控，該系統(tǒng)是細菌依賴于群體密度而調(diào)控其生理行為的一種機制。其中LuxS/2型自誘導物（autoinducer 2，AI-2）群體感應系統(tǒng)又稱種間群體感應系統(tǒng)，廣泛存在于G+及G-菌中。其信號分子AI-2被認為是種間通用的信號分子，參與調(diào)控多種細菌的生物被膜。此外，目前已發(fā)現(xiàn)多種LuxS/AI-2型群體感應系統(tǒng)抑制劑，它們可以影響許多細菌生物被膜的形成。目前研究人員已開始致力于揭示LuxS/AI-2型群體感應系統(tǒng)調(diào)控生物被膜形成的分子機制，這對于進一步理解LuxS/AI-2型群體感應系統(tǒng)與生物被膜的關(guān)系具有重要意義。

生物被膜；LuxS/AI-2型群體感應系統(tǒng)；2型自誘導物；群體感應抑制劑；調(diào)控機制

LIU Lei， GUI Meng， WU Ruiyun， et al. Progress in research on biofilm formation regulated by LuxS/AI-2 quorum sensing［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 254-262. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619043. http：//www.spkx.net.cn

生物被膜是大多數(shù)細菌在自然狀態(tài)下的一種生長方式。除海洋細菌外，絕大多數(shù)細菌都生存在非純流體懸浮環(huán)境中，它們都會附著在生物或非生物表面，形成生物被膜。研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜不是細菌個體的簡單堆積，而是由細菌菌體及胞外分泌物如多糖、纖維蛋白、脂蛋白等相互作用而形成的具有復雜結(jié)構(gòu)的膜樣物質(zhì)。多數(shù)細菌在自然環(huán)境中之所以選擇以生物被膜狀態(tài)生存，主要是由于無論單菌種生物被膜，還是多菌種復雜生物被膜均具有浮游狀態(tài)時不可比擬的優(yōu)勢，且被膜態(tài)的細菌可啟動一系列基因的表達來協(xié)調(diào)其群體性行為［1］。

1　生物被膜研究現(xiàn)狀

1.1生物被膜的形成過程

目前的研究已經(jīng)證實，細菌生物被膜的形成需經(jīng)歷5個階段：1）細菌細胞對表面基質(zhì)的初始附著；2）附著的細菌分泌胞外多聚物從而促進細菌對表面基質(zhì)進行不可逆附著；3）生物被膜結(jié)構(gòu)形態(tài)的初步形成和發(fā)展；4）生物被膜結(jié)構(gòu)形態(tài)的成熟；5）生物被膜中個體細胞的脫落。而脫落的個體細胞可以再次附著，并形成一個新的生物被膜。通過這5個階段，細菌生物被膜完成了附著、形成、成熟、老化脫落、再重新附著的循環(huán)過程［2］。

在最初的階段，附著在表面基質(zhì)的細菌個體細胞被其分泌的胞外多聚物包裹，開啟了生物被膜的形成，其中許多細菌還可以通過菌毛的運動來自由地移動。這些初始附著的細菌還沒有開始進行生物被膜形成過程中的分化階段，因此很多細菌還可以離開基質(zhì)表面重新回到之前的浮游狀態(tài)。之后細菌開始啟動一系列基因的表達，分泌胞外多糖等物質(zhì)，使得細菌不可逆地黏附到基質(zhì)表面。

1.2生物被膜發(fā)揮生理功能的群體行為

自然狀態(tài)下的多數(shù)細菌以生物被膜狀態(tài)生存，主要是由于被膜態(tài)細菌具有浮游態(tài)時不具有的優(yōu)勢，且被膜態(tài)的細菌可啟動一系列基因的表達來協(xié)調(diào)其群體性行為［1］。

首先，形成生物被膜的細菌在生理功能上像一個整體發(fā)揮作用。Cheng等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在牛的瘤胃中，各種環(huán)境和細菌形成了一個獨特的小生態(tài)系統(tǒng)，多種細菌共生并附著在纖維素等表面，形成一個復雜的多菌種生物被膜，共同協(xié)作對營養(yǎng)物質(zhì)進行分解代謝。Kim等［4］研究證明，生物被膜中的細菌是通過信號分子的交流來實現(xiàn)其功能的。

其次，生物被膜中的細菌在行為表現(xiàn)上像一個整體共同協(xié)調(diào)作用。Sun Hong等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)物質(zhì)充足的條件下，細菌常?；瑒又翣I養(yǎng)物質(zhì)濃度高的地區(qū)；而在干燥或營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的條件下，個體細胞則分化成包囊，使整個生物被膜形成更為復雜的結(jié)構(gòu)。當然，生物被膜高度的結(jié)構(gòu)化也為其中的細菌個體提供了有利的生存環(huán)境。位于生物被膜不同位置的細菌個體接觸不同的微環(huán)境時，其生長狀態(tài)不同，但高度的結(jié)構(gòu)化能夠讓不同位置的細菌都接觸到營養(yǎng)物質(zhì)，進而采取與所處微環(huán)境相適宜的方式生存，最終從整體上保障整個細菌群體的生存［2］。

1.3乳酸菌生物被膜研究現(xiàn)狀

關(guān)于益生乳酸菌生物被膜的研究還相對匱乏。Lebeer等［6］對L. rhamnosus的生物被膜形成能力與影響因素做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)被膜的形成受到培養(yǎng)基及胃腸道環(huán)境等多種因素的影響。Brink等［7］研究報道，影響益生菌生物被膜形成的因素眾多，除去自身基因調(diào)控的因素外，外界環(huán)境的很多因素都會明顯干擾益生菌生物被膜的形成與發(fā)展，如培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏及限制性碳源的供給均會促進其生物被膜的形成，生物被膜態(tài)比懸液培養(yǎng)時對低pH值更為敏感等。有研究人員對比了不同流速下L. rhamnosus生物被膜的形成能力，發(fā)現(xiàn)在低流速下生物被膜更易形成，而高流速時幾乎無法形成，并推斷這是由于在低流速的環(huán)境下胞外多聚物的含量更高導致的。同時研究發(fā)現(xiàn)，將被膜態(tài)的L. rhamnosus制成微制劑，不僅能更好地控制其釋放，還可增強其耐熱耐酸等性能，如將形成高密度生物被膜的益生菌包裹在殼聚糖包被的藻酸鹽制備的微膠囊中，可顯著提高其抗冷凍干燥的能力和耐熱性。Cheow等［8］的研究顯示，生物被膜態(tài)的益生菌與浮游態(tài)下相比具有更顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。由此可見，生物被膜的形成是乳酸菌在環(huán)境脅迫中發(fā)揮生理功能的重要基礎。被膜態(tài)乳酸菌通過其生理和行為上的共同調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出了其浮游態(tài)不具備的優(yōu)勢。

1.4調(diào)控生物被膜的四大機制

1.4.1雙組分系統(tǒng)（two components system，TCS）

TCS包括兩種蛋白：組氨酸激酶蛋白（histidine protein kinase，HPK），即“受體”，和其偶聯(lián)蛋白即“調(diào)控子”（response regulator，RR）。一旦識別外界刺激，HPK被激活，同時保守的組氨酸殘基發(fā)生自磷酸化。隨后該磷酸基團轉(zhuǎn)移到其耦合RR保守的天冬氨酸殘基上。磷酸化導致RR被激活，它是最常見的調(diào)控因子。例如，P. aeruginosa中控制生物被膜形成的最主要的信號轉(zhuǎn)導機制之一就是GacS（HPK）/GacA（RR）雙組份系統(tǒng)。一旦被信號激活，GacS（HPK）/GacA（RR）雙組份系統(tǒng)便激活rsm基因的轉(zhuǎn)錄。rsm基因編碼兩個非編碼的小RNA（sRNA），即RsmY和RsmZ，它們的表達水平與控制浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。高表達量的rsmY和rsmZ促進生物被膜的形成，低表達量時與生物被膜損傷有關(guān)。Gac調(diào)控通路與另外兩個HPK也有關(guān)聯(lián)，即RetS和LadS。盡管RetS被證明與GacS相互拮抗，抑制生物被膜所需基因的表達，但是LadS可以加固GacS依賴型生物被膜所需基因的激活作用。與此同時，Gac系統(tǒng)激活對糖肽類和氯霉素抗生素耐藥性。在許多細菌中TCS系統(tǒng)都參與調(diào)控生物被膜的形成［9］。

1.4.2胞外質(zhì)膜功能信號通路

細菌中常用的也是可能被低估的信號轉(zhuǎn)導機制是胞外質(zhì)膜功能信號通路，包括可轉(zhuǎn)化的Sigma因子，一個Anti-sigma因子，其優(yōu)先存在于細胞質(zhì)膜，隔絕和抑制其同源的Sigma因子和其他可激活該信號通路的胞周質(zhì)及胞外蛋白。周質(zhì)和胞外蛋白識別胞外信號，Anti-sigma因子降解導致釋放Sigma因子，從而促進一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄。在P. aeruginosa中，AlgU ECF Sigma因子控制胞外多聚物藻酸鹽的產(chǎn)生，藻酸鹽可以影響生物被膜的結(jié)構(gòu)。AlgU Sigma因子與Anti-sigma因子MucA共同發(fā)揮功能，對未知信號產(chǎn)生應答，其C端區(qū)域被AlgW蛋白酶切割［10］。

1.4.3胞內(nèi)信使環(huán)二鳥苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）

信號轉(zhuǎn)導分子是胞內(nèi)二級信使c-di-GMP。該信使的量被嚴格控制，當二鳥苷酸環(huán)化酶（diguanylate cyclase，DGC）結(jié)合GGDEF區(qū)域時分泌量增多，當磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）結(jié)合EAL區(qū)域時分泌量減少。在細菌中，高c-di-GMP水平一般與生物被膜形成有關(guān)，這主要是通過產(chǎn)生表面黏附胞器，啟動胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）合成以及降低運動性［11-13］。

1.4.4群體感應系統(tǒng)

細菌通過群體感應（quorum sensing，QS）系統(tǒng)來調(diào)控與生物被膜形成相關(guān)基因的表達。監(jiān)測信號分子的閾值可能是通過組氨酸蛋白激酶，或者是信號分子主動或被動地進入細胞，結(jié)合到調(diào)控蛋白，從而激活了特定基因的表達。在S. aureus中，浮游態(tài)與被膜狀態(tài)的轉(zhuǎn)變主要是受QS系統(tǒng)的調(diào)控［14］。S. aureus的QS系統(tǒng)由agr操縱子調(diào)控，agrD負責編碼信號分子。信號分子一經(jīng)產(chǎn)生、輸出并達到閾值，agrD編碼的信號分子便通過雙組分轉(zhuǎn)導系統(tǒng)AgrCA控制非編碼的小RNA—RNAIII的表達，而RNAIII下調(diào)負責編碼黏附素基因的表達。因此它促進了菌體的分散及胞外蛋白酶的活性，負調(diào)控菌體數(shù)量、生物被膜的形成以及對糖肽類抗生素的耐受性［15］。盡管agr操縱子的功能與糖肽類抗生素耐藥性之間的關(guān)系還存在爭議，但是大多數(shù)糖肽類耐受型的金黃色葡萄球菌都是agr缺陷型的。本文將重點介紹LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)調(diào)控細菌生物被膜形成的研究現(xiàn)狀。

2　LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)調(diào)控的生物被膜的研究現(xiàn)狀

近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)，在生物被膜的逐漸形成和發(fā)展過程中，QS系統(tǒng)和雙組份調(diào)控系統(tǒng)發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［16-17］。其中AI-2信號分子介導的LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)因其廣泛存在于G+和G-菌中而受到越來越多的關(guān)注。

2.1QS系統(tǒng)介紹

QS系統(tǒng)是細菌依賴于群體密度而調(diào)控其生理行為的一種機制。隨著細菌的分裂生長，細菌的密度增加，同時在其生長的過程中，細菌會分泌化學信號分子，伴隨群體密度的增加，胞外信號分子的濃度也增加，細菌通過感知胞外信號分子的濃度而得知其群體的密度，當胞外信號分子濃度達到某一閾值時，細菌啟動一系列基因的表達，從而調(diào)節(jié)其諸多行為，包括生物被膜形成、芽孢形成、生物發(fā)光、叢聚及毒力因子的表達等［18-22］。細菌利用這種信號反饋機制，使其行為呈現(xiàn)群體水平的一致性和協(xié)調(diào)性，像多細胞生物般共同協(xié)調(diào)作用。

QS系統(tǒng)常被分為革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)、革蘭氏陽性菌QS系統(tǒng)和種間QS系統(tǒng)。QS系統(tǒng)首先在海洋發(fā)光菌V. fischeri中發(fā)現(xiàn)，其被認為是大多數(shù)革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)的代表。革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)的特異性信號分子是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs），在多種G-菌共生的環(huán)境下，每種細菌都能夠識別自身所產(chǎn)生的信號分子，并將信號進行傳遞。G+菌利用修飾的寡肽（autoinducingpeptide，AIP）作為種內(nèi)信號分子，綁定在細胞膜上的雙組分組氨酸激酶為受體來進行信息的交流，通過磷酸化級聯(lián)反應來進行信號的傳遞。乳酸菌首先在核糖體中合成AIP的前體肽，其在向外運輸?shù)倪^程中，經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)錄后修飾和加工，成為具有活性的AIP。AIP不能自由穿過細胞壁，通過要ATP結(jié)合盒式蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）轉(zhuǎn)運系統(tǒng)或其他膜通道蛋白作用運送至胞外，從而發(fā)揮作用。有文獻報道稱益生菌的這一QS系統(tǒng)參與細菌素的合成與釋放［23］。

LuxS/AI-2QS又稱種間QS系統(tǒng)，廣泛存在于G+及G-菌中，甚至存在于真菌中。其信號分子AI-2被認為是種間通用的信號分子，在諸如腸道菌群等多菌種生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著重要的信號傳遞與交流作用，因此受到研究者的關(guān)注。一些歐洲國家如西班牙、挪威等已全面開展了這方面的研究工作，其中與生物被膜形成相關(guān)的QS系統(tǒng)成為研究的熱點［24-26］。

2.2LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)信號分子AI-2的合成途徑及結(jié)構(gòu)

AI-2是介導LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)的通用信號分子，可參與微生物多種行為的信號傳遞與交流，其代謝生成途徑見圖1。

圖1　LuxS/AI-2型QS系統(tǒng)信號分子AI-2生成代謝通路圖［27］Fig.1　Production of signal molecule AI-2 of LuxS/AI-2 quorum sensing［27］

AI-2的前體物質(zhì)是DPD，DPD是SAM代謝的副產(chǎn)物。SAM廣泛存在于各種細菌、真菌及多細胞生物中，是主要的細胞甲基化供體，不同的物種具有不同的SAM代謝途徑。SAM可將甲基基團轉(zhuǎn)移給多種不同的底物，生成具有毒性的產(chǎn)物SAH，然后通過甲硫腺苷核苷酶（5’-methylthioadenosine nucleosidase，MTAN（Pfs））和LuxS兩個蛋白依次將其轉(zhuǎn)化為SRH和同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy），同時生成AI-2的前體物質(zhì)DPD［28］。DPD是一種高活性分子，它經(jīng)過重排及一系列的附加反應生成不同的DPD衍生物，進而可作為信號分子即AI-2被不同的細菌識別［29］。本課題組曾體外克隆表達了禽致病性大腸桿菌的Pfs和LuxS蛋白，通過催化底物SAH體外合成了具有活性的AI-2信號分子，表明了體外生物合成AI-2的可能性［30］。此外，本課題組在早期研究中發(fā)現(xiàn)，禽致病性大腸桿菌的AI-2產(chǎn)生水平與luxS基因的轉(zhuǎn)錄水平具有高度相關(guān)性，而與pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著相關(guān)性［31］。

AI-2作為通用信號分子，其結(jié)構(gòu)引起了研究人員的關(guān)注。有研究報道稱通過捕獲活性分子及其特異受體的復合物，再對其進行晶體分析和結(jié)構(gòu)解析，鑒別了兩種不同的DPD衍生物，即來源于V. harveyi的S-THMF borate和R-THMF［32］。其中，V. harveyi的AI-2含有硼，硼的生物學功能尚不明確，其以高濃度存在于海洋環(huán)境中，可能因此硼在V. harveyi的AI-2中存在。在前體物質(zhì)DPD中添加硼可以使V. harveyi的AI-2生成量大大超過S. typhimurium的AI-2，反過來，去除了硼的前體物DPD促進了S. typhimurium的AI-2信號分子的合成，同時導致了V. harveyi的AI-2信號分子的損失［32］。這些研究表明細菌利用一個保守的生化合成途徑去合成化學性信號分子的中間物，而這些中間物的最終結(jié)構(gòu)組分由特定環(huán)境的化學組成決定。此外，一些細菌可能擁有兩種或更多的AI-2受體以識別不同的DPD衍生物，并根據(jù)不同的信號分子傳遞不同的信息來調(diào)節(jié)特定的行為。AI-2由SRH的核糖基團衍生而來，因此AI-2最有可能是結(jié)構(gòu)與核糖類似的呋喃酮。呋喃酮具有作為理想信號分子的幾個主要特點。首先，呋喃酮是廣泛存在的分子，可以由SAM經(jīng)LuxS催化生成，也可以來源于糖和氨基酸。其次，呋喃酮環(huán)上取代基團不同，可以是水溶性、脂溶性或揮發(fā)性的。最后，每種呋喃酮具有多種立體異構(gòu)體，這對于信號分子的特異性識別至關(guān)重要［28］。

2.3AI-2信號分子的呈遞與內(nèi)化

AI-2信號分子隨著細菌密度的增高而增多，但當其濃度達到一定閾值時，AI-2會發(fā)生內(nèi)化作用。目前研究較為清楚的是弧菌、大腸桿菌和沙門氏菌的AI-2信號分子遞呈及內(nèi)化途徑。

哈維氏弧菌和霍亂弧菌的AI-2信號分子被LuxP/LuxQ檢測，引起磷酸化級聯(lián)反應，從而調(diào)控眾多基因的轉(zhuǎn)錄。LuxP是周質(zhì)結(jié)合蛋白家族的成員之一，其結(jié)構(gòu)與核糖體結(jié)合蛋白RbsB類似，它通過兩個結(jié)構(gòu)域夾緊其配體與其結(jié)合，圖2為不結(jié)合/結(jié)合AI-2信號分子的LuxP三維結(jié)構(gòu)模式圖［33］。然而，LuxP的同系物僅在弧菌中發(fā)現(xiàn)。LuxP與膜內(nèi)蛋白LuxQ形成一個混合的雙組份感應激酶系統(tǒng)，由一個膜周質(zhì)感應區(qū)域、細胞質(zhì)組氨酸激酶和應答調(diào)節(jié)區(qū)域構(gòu)成，發(fā)揮檢測AI-2的功能。在低細胞密度時，LuxQ作為一種激酶，在組氨酸激酶域中交互磷酸化組氨酸殘基。一系列磷酸轉(zhuǎn)運反應最終引起LuxO的磷酸化。磷酸化的LuxO間接抑制激活劑LuxR的轉(zhuǎn)錄。在高細胞密度時，AI-2與LuxP綁定相互作用使得LuxQ從激酶轉(zhuǎn)化為磷酸酶。LuxQ的去磷酸化引發(fā)了磷酸基團逆向傳遞級聯(lián)反應，去阻遏LuxR。LuxR激活了編碼熒光素酶lux操縱子的轉(zhuǎn)錄，引起發(fā)光［34］。

LuxS調(diào)控大腸桿菌和沙門氏菌ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的表達，該ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)由lsr（LuxS regulated）操縱子編碼，參與AI-2分子的呈遞和內(nèi)化。大腸桿菌和沙門氏菌AI-2的受體是LsrB受體，AI-2與LsrB結(jié)合并轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，之后被LsrK磷酸化并LsrR相互作用，LsrR是一個SorC樣的轉(zhuǎn)錄因子，抑制lsr操縱子的表達［26］。AI-2的內(nèi)化可能發(fā)揮一下生理作用。首先，AI-2的內(nèi)化可能用于終止QS級聯(lián)反應；其次，AI-2內(nèi)化是為了將AI-2傳遞至內(nèi)部檢測系統(tǒng)；最后，AI-2內(nèi)化可以干擾其他競爭性菌種的AI-2 QS系統(tǒng)，如大腸桿菌內(nèi)化沙門氏菌產(chǎn)生的AI-2被認為可能是一種抗AI-2的交流機制［35］。

圖2　不結(jié)合（a）與結(jié)合（b）AI-2的LuxP三維晶體結(jié)構(gòu)圖［33］Fig.2　Three-dimensional crystal structures of apo-LuxP， without bound AI-2 （a） and holo-LuxP， with bound AI-2 （b）［33］

AI-2的產(chǎn)生與識別和內(nèi)化沒有直接的關(guān)系。本課題組曾研究發(fā)現(xiàn)，鴨疫里默氏桿菌缺乏luxS基因，自身不能合成AI-2信號分子，但可以識別呈遞外源AI-2，且外源AI-2能夠調(diào)控其生物被膜的形成［36］。

2.4luxS基因及AI-2信號分子對細菌生物被膜形成的作用

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌等在內(nèi)的許多細菌具有LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)關(guān)鍵基因luxS。許多研究報道，luxS基因及其合成的信號分子AI-2在多種細菌的生物被膜形成過程扮演重要角色［37-39］。

Sun Zhongke等［40］研究發(fā)現(xiàn)，過表達B. longum NCC2705的luxS，其生物被膜形成能力上調(diào)約50%，顯示luxS基因與其生物被膜形成相關(guān)。Lebeer等［41］也報道，luxS在L. reuteri100-23和L. rhamnosus GG中發(fā)揮著重要的生理代謝作用并影響生物被膜形成能力。此外，研究發(fā)現(xiàn)，外源添加信號分子AI-2可促進P. aeruginosa PAO1［42］、H. pylori［43］、S. epidermidis RP62A［44］等的生物被膜形成；低濃度AI-2可促進Streptococcus suis生物被膜的形成，而高濃度AI-2則抑制Streptococcus suis生物被膜的形成［45］；外源添加AI-2可減弱S. aureus生物被膜的形成［46］；也有研究發(fā)現(xiàn)Streptococcus sanguis的生物被膜形成與AI-2沒有關(guān)系［47］。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的AI-2（0.185 mmol/L）可顯著增強禽致病性大腸桿菌的生物被膜形成能力，且可以減弱其毒力基因（pfs、vat、luxS、tsh、fuyA和iucD）的轉(zhuǎn)錄水平和對雞胚成纖維細胞DF-1的黏附和入侵能力［48］。對于自身缺乏AI-2合成能力的鴨疫里默氏桿菌，我們發(fā)現(xiàn)外源AI-2參與調(diào)控其對非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）的黏附和入侵能力［49］。

2.5LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)抑制劑對生物被膜形成的影響

QS系統(tǒng)對細菌群體性生理行為進行全局調(diào)控，這種調(diào)控通常發(fā)生在不同細菌群體的交界面或細菌-宿主相互作用的邊緣處。在自然環(huán)境中，細菌競爭有限的資源，具有干擾群體感應能力的細菌要比依賴于群體感應的其他細菌具有優(yōu)勢［50］。因此，通過抑制群體感應從而開發(fā)新型抗菌療法引起研究者的廣泛關(guān)注。其中，研發(fā)群體感應抑制劑從而阻斷群體感應是一個重要的研究方向。

AI-2合成包括兩步主要的反應。首先是腺嘌呤從SAH經(jīng)MTAN（pfs編碼）作用產(chǎn)生SRH。接下來SRH經(jīng)LuxS裂解形成DPD和Hcy。此外，MTAN也與AHL QS系統(tǒng)有關(guān)，LuxS和MTAN僅在細菌中發(fā)現(xiàn)，這使得它們可以作為很好的作用靶點。目前已經(jīng)報道了一些LuxS和MTAN的抑制劑。S-脫氫核糖-L-同型半胱氨酸和S-同型核糖-L-半胱氨酸分別阻斷LuxS合成的第一步和最后一步。在這些分子的基礎上，Shen Gang等［51］合成一些更有效的LuxS抑制劑?？梢砸种芁uxS的肽類物質(zhì)也在不斷研發(fā)［52-53］。從Immucillin和DADMe-immucillin開始，一些在10-12和10-14級別的其他MTAN抑制劑（如BuTDADMeimmucillin-A和p-Cl-PhT-DADMe-immucillin-A）也被研發(fā)出來［54］。

DPD衍生物包括Ac2-DPD、烷基-DPD、碳酸-DPD、三氟-S-THMF-borate以及一些與DPD結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，如Laurencione和4-羥基-5-甲基-3-（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-5-methyl-3-（2H）-furanone，MHF）可以激活AI-2 QS系統(tǒng)，然而一些含有二醇的物質(zhì)（包括焦櫚酚），硼酸和砜可以作為AI-2-LuxP結(jié)合的潛在拮抗劑［55］。熊果酸、異丁基-DPD和苯基-DPD可以抑制E. coli和P. aeruginosa生物被膜的形成［56-57］。此外，4-羧酸甲酯-苯基硼酸和LMC-21會影響V. anguillarum和V. vulnificus生物被膜形成量而不影響菌體總數(shù)量［58］。

QS系統(tǒng)能夠在信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應這一水平被阻斷。這類物質(zhì)中研究最廣泛的是天然呋喃酮復合物，（5Z）-4-溴-5-溴亞甲基-3-丁酰基-2（5H）-呋喃酮和肉桂醛。天然的呋喃酮或Fimbrolide首先分離自紅藻D. pulchra，而肉桂醛來源于肉桂樹的樹皮。迄今為止不同的天然Fimbrolide類似物和一些合成的呋喃酮已被發(fā)現(xiàn)或合成。這些與?；鶄?cè)鏈和鹵素取代物非常不同。此外，一些肉桂醛類似物也被報道過［59-60］。具有QS抑制效果的肉桂醛類似物的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)包含了α、β不飽和?；鶊F，作為與疏水基團和部分負電荷連接的Michael接受者參與反應［61］。

呋喃酮和肉桂醛可以影響不同類型的QS系統(tǒng)。這些物質(zhì)可以通過降低應答調(diào)節(jié)子LuxR的DNA結(jié)合能力從而抑制V. harveyi的AI-2 QS，LuxR位于信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應的基礎位置［59］。這些物質(zhì)也可以阻斷不同的AHL QS系統(tǒng)，可能是通過將AHL與其受體分開。此外，共價修飾的天然呋喃酮，失活的LuxS及加速LuxR的翻轉(zhuǎn)可以分別阻斷AI-2和AHL QS。

鹵代呋喃酮可以影響P. aeruginosa、E. coli、B. subtilis、S. epidermidis、P. gingivalis、S. enterica serovar Typhimurium、Streptococcus spp.和Vibrio spp.生物被膜的形成［61-67］。肉桂醛可以影響B(tài). cenocepacia、B. multivorans、P. aeruginosa、E. coli和Vibrio spp.生物被膜的形成［60，68-69］。雖然一些研究表明呋喃酮對生物被膜的QS具有抑制效果，但是這些物質(zhì)的毒性限制了它們的使用。相反，肉桂醛作為風味添加劑被廣泛地應用在食品和飲料上。

2.6LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)參與調(diào)控細菌生物被膜形成的機制

關(guān)于LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)如何調(diào)控生物被膜形成方面，目前的研究初步表明，LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)主要參與調(diào)控了生物被膜形成的關(guān)鍵基因。

目前研究較為清楚的是V. cholerae中QS系統(tǒng)調(diào)控生物被膜的途徑（圖3）。V. cholerae通過Ⅰ型種特異性自誘導物（genus-specific autoinducer-1，CAI-1）和AI-2兩類信號分子AIs來控制QS的目標基因。CAI-1屬種內(nèi)信號分子，是由CqsA產(chǎn)生的一個結(jié)構(gòu)不明確的復合物，可通過其同源傳感器激酶蛋白CqsS來檢測。LuxS合成的種間信號分子AI-2，則可通過LuxPQ受體復合物進行檢測。當菌體密度低AIs缺乏時，CqsS和LuxQ表現(xiàn)為激酶，通過磷酸轉(zhuǎn)移蛋白LuxU將磷酸基團轉(zhuǎn)移至相應的調(diào)節(jié)蛋白LuxO。LuxO～P復合物激活了編碼4 種小RNA（small RNAs，sRNAs）的基因轉(zhuǎn)錄，這4 種sRNAs被命名為群體調(diào)控RNAs1-4（quorum regulatory RNAs1-4，Qrr1-4）。Qrr sRNAs與其sRNA伴侶蛋白Hfq和mRNA編碼基因hapR堿基配對并使該mRNA不穩(wěn)定，從而導致沒有HapR蛋白產(chǎn)生。在這種條件下，受HapR抑制的基因啟動表達，而受HapR激活的基因無法表達。當菌體密度高時，AIs與其同源性傳感器結(jié)合，將傳感器從激酶轉(zhuǎn)換為磷酸酶，從而逆轉(zhuǎn)了磷酸化級聯(lián)反應。去磷酸化的LuxO是沒有活性的，因此qrr基因的轉(zhuǎn)錄終止，HapR產(chǎn)生，HapR抑制型基因調(diào)控模式發(fā)生反轉(zhuǎn)。QS系統(tǒng)控制的基因包括負責毒力因子表達基因和生物被膜形成的基因。重要的是迄今為止發(fā)現(xiàn)的每一個V. cholerae 的QS目標基因都需要HapR參與調(diào)控［70］。Xue Ting等［44］采用外源添加AI-2信號分子，證明AI-2可增強ica操縱子及編碼生物被膜相關(guān)蛋白的基因bhp的轉(zhuǎn)錄，進而顯著提高了S. epidermidis生物被膜的形成能力。而Henke等［71］研究發(fā)現(xiàn)，信號分子AI-2通過抑制V. harveyi Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因的表達而影響其生物被膜的形成。S. pneumoniae的LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)通過調(diào)控lytA基因的轉(zhuǎn)錄改變自溶素的表達從而影響細胞壁的降解和生物被膜的產(chǎn)生［72］。在A. pleuropneumoniae中還發(fā)現(xiàn)，LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)與編碼生物被膜PGA合成蛋白的基因pgaABC有關(guān)［73］。

圖3　V. cholerae的QS系統(tǒng)調(diào)控途徑［74］Fig.3　Regulation pathway of quorum sensing in V. cholera［74］

2.7細菌QS系統(tǒng)的保守與進化

QS系統(tǒng)對于細菌群體有利，細菌通過該系統(tǒng)協(xié)調(diào)群體生理行為。由此延伸的與進化有關(guān)的問題非常新穎且亟待解決：細菌細胞-細胞間的信號交流如何進化？細菌實現(xiàn)交流付出的代價？QS系統(tǒng)的可靠性如何保證？“偷聽”是否發(fā)生及怎樣發(fā)生？

類似于群居的昆蟲，微生物中也存在著犧牲個體利益成全群體利益的行為。例如，土壤中的M. xanthus在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的環(huán)境中產(chǎn)生耐受性芽孢，它可以非生長狀態(tài)存活很久并散播到新的環(huán)境中［75-76］。芽孢的發(fā)展需要細胞群體中很大比例的成員進行致死性分化，從而形成可以促進芽孢生成并傳播的結(jié)構(gòu)。QS系統(tǒng)通過調(diào)控菌體的化學性交流控制了M. xanthus的致死性分化過程［77］。

QS系統(tǒng)存在著“間諜”行為或“偷聽”機制。P. aeruginosa沒有l(wèi)uxS基因，不能合成AI-2。但是，在囊性纖維變性的唾液樣品中P. aeruginosa可以監(jiān)測其他非致病菌產(chǎn)生的AI-2。在囊性纖維變性的肺中存在各種致病菌和非致病菌。P. aeruginosa通過監(jiān)測外部環(huán)境中的S. enterica具有類似V. fi scheri LuxR的蛋白SdiA，它可以截取其他革蘭氏陰性菌LuxI產(chǎn)生的AHLs。S. enterica對這些信號分子產(chǎn)生應答，表達rck操縱子和其他保護菌體免受宿主腸道免疫防御作用的基因［78］。S. gordonii可以通過分泌AI-2調(diào)節(jié)C. albicans的生物被膜形成［79］。S. gordonii的luxS基因突變會影響與P. gingivalis luxS缺失株混合生物被膜形成的能力［80］。此外，有些細菌自身不產(chǎn)生AI-2，但是可以利用其他細菌的AI-2來調(diào)節(jié)自身的行為，同時干擾其他細菌的行為，如S. melilot自身不產(chǎn)生AI-2，但是可以利用E. carotovora分泌的AI-2來調(diào)控自身生理行為［81］。

關(guān)于細菌中菌體-菌體之間交流的研究對于理解生物進化具有重要意義。群體感應可以促發(fā)細菌種內(nèi)交流并使細菌監(jiān)測群體數(shù)量從而協(xié)調(diào)基因的表達。此外，雖然一些作為信號分子自體誘導物具有很高的種特異性，但是一些自體誘導物可以促發(fā)種間信號交流。因此，原核生物同真核生物類似，也存在著化學信號交流的機制。細菌群體感應信號檢測和傳遞系統(tǒng)是非常復雜的，由多個網(wǎng)絡組成，而每個網(wǎng)絡又由不同的結(jié)構(gòu)布局形成。由于細菌存在于變化的環(huán)境中，其中具有多種化學物質(zhì)，一些是信號分子，一些是不能傳遞信息的物質(zhì)。細菌如何識別特定的信號分子啟動相應的QS系統(tǒng)網(wǎng)絡需要更多深入的研究。

3　展 望

LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)作為種間信號交流系統(tǒng)，幫助細菌實現(xiàn)自然環(huán)境下多菌種跨種間的信息交流，不僅調(diào)控細菌自身菌群的生理行為，而且對維持微生物多樣性起重要作用。對于病原性細菌，其生物被膜的形成與耐藥性及毒力密切相關(guān)，而傳統(tǒng)抗生素療法的失效導致迫切需要研發(fā)新型療法。此外，在食品生產(chǎn)加工過程中，生產(chǎn)設備中形成的微生物生物被膜難以根除，不僅影響了食品的風味和品質(zhì)，對食品行業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，而且對消費者的身體健康帶來了負面影響。因此通過抑制它們的AI-2合成能力、競爭AI-2作用靶點或阻斷AI-2呈遞內(nèi)化，干擾其QS系統(tǒng)及其下游級聯(lián)反應，從而削弱或清除其生物被膜仍是主要研究方向。對于有益微生物，其生物被膜及LuxS/AI-2 QS的相關(guān)研究尚處于起步階段。如何通過調(diào)節(jié)LuxS/AI-2 QS而影響其生物被膜形成能力，從而提高其對胃腸道及益生菌產(chǎn)品生產(chǎn)過程中不良環(huán)境的耐受性逐漸引起了研究人員的關(guān)注。同時，腸道中的有益微生物是如何調(diào)控自身及周圍細菌的群感系統(tǒng)，從而調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和拮抗病原微生物是另一大研究熱點。

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Progress in Research on Biofilm Formation Regulated by LuxS/AI-2 Quorum Sensing

LIU Lei1， GUI Meng2， WU Ruiyun1，3， LI Pinglan1，*
（1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health， College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University， Beijing 100083， China； 2. Beijing Fisheries Research Institute， Beijing 100068， China；3. College of Life Sciences， Inner Mongolia University， Hohhot 010021， China）

The majority of bacteria form biofi lms for growth and development and bacteria within biofi lms may better adapt to environment than their planktonic counterparts. LuxS-dependent quorum sensing is a widespread system used by bacteria for cell-to-cell communication， which can regulate biofi lm formation in a cell density-dependent manner. Autoinducer 2 （AI-2）produced by LuxS， is a species-nonspecific signal used by both gram-negative and gram-positive bacteria for biofilm formation. Currently， several inhibitors of LuxS/AI-2 quorum sensing have been determined to infl uence biofi lm formation based on their anti-AI-2 communication mechanisms. Recently， there has been a surging interest in the mechanism of biofi lm regulation by LuxS/AI-2 quorum sensing system， which is important to better understand the relationship between LuxS-dependent QS system and biofi lm formation.

biofilms； LuxS/AI-2 quorum sensing； autoinducer 2； quorum sensing inhibitor； regulation mechanism

10.7506/spkx1002-6630-201619043

Q939.99

A

1002-6630（2016）19-0254-09

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10.7506/spkx1002-6630-201619043. http：//www.spkx.net.cn

2016-05-13

國家自然科學基金面上項目（31271827；31471707；31671831）；北京市自然科學基金項目（6164033）

劉蕾（1988—），女，博士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：liulei0606@gmail.com

李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn