光棘球海膽多肽的制備及其生物活性

王　婷，王曉慧，馬　瑩，季曉彤，王　玲，年益瑩，薛　鵬，孟　雙，秦　磊，李冬梅，張公亮，侯紅漫，孫黎明，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264003）

光棘球海膽多肽的制備及其生物活性

王婷1，2，王曉慧3，馬瑩1，2，季曉彤1，2，王玲1，2，年益瑩1，2，薛鵬1，2，孟雙1，秦磊1，2，李冬梅1，2，張公亮1，侯紅漫1，孫黎明1，2，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264003）

光棘球海膽（Strongylocentrotus nudus）又稱大連紫海膽，是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)型海膽之一，其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的食用和藥用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以大連紫海膽為研究對(duì)象，采用酶解法制備海膽活性肽，并對(duì)其部分生物活性進(jìn)行研究。使用木瓜蛋白酶對(duì)海膽黃進(jìn)行水解，得到分子質(zhì)量分布范圍＜1、1～3、3～5、5～10 kD和＜10 kD的5 種海膽多肽組分。活性研究結(jié)果顯示，在多肽終質(zhì)量濃度為200 ?g/mL時(shí)，不同分子質(zhì)量分布的海膽多肽均可促淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)。在這一質(zhì)量濃度下，除了小于1 kD的多肽，其他多肽均對(duì)人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）增殖有一定抑制作用，對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力有一定促進(jìn)作用。在多肽終質(zhì)量濃度為50 ?g/mL時(shí)，不同組分海膽多肽對(duì)叔丁基脂氫過(guò)氧化物所致的Chang肝細(xì)胞氧化損傷均可發(fā)揮直接和間接抗氧化保護(hù)作用。然而，不同分子質(zhì)量分布的海膽多肽均可抑制補(bǔ)體的經(jīng)典途徑活性，且呈現(xiàn)明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。上述結(jié)果表明，海膽多肽對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫功能具有潛在的調(diào)節(jié)作用，其功能活性的多向性值得深入研究。

光棘球海膽；多肽；生物活性；人宮頸癌細(xì)胞

海膽屬棘皮動(dòng)物門(mén)（Echinodermata）海膽綱（Echinoidea），是一類(lèi)常見(jiàn)的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物。海膽的生殖腺，俗稱海膽黃，是海膽的可食部位，具有特殊鮮美的味道，而且富含蛋白質(zhì)、油脂、多糖、色素等組分?！侗静菰肌泛汀吨兴幹尽范加涊d了海膽的藥用作用［1］。從古至今，臨床上用海膽治療疾病主要應(yīng)用其棘殼。而現(xiàn)代科學(xué)也對(duì)海膽黃的組分和功效進(jìn)行了系統(tǒng)研究，無(wú)論是其水相和有機(jī)相提取物［2-3］，還是海膽油脂［4-5］、蛋白質(zhì)［6］、多糖［7］等組分均具有較為明確的生物活性。

本研究室Qin Lei等［8］對(duì)大連紫海膽（Strongylocentrotus nudus）多肽的制備和抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)海膽肽的抗氧化活性主要與所用蛋白酶的種類(lèi)有關(guān)，與中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶相比，木瓜蛋白酶水解所得海膽肽的抗氧化能力最強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用木瓜蛋白酶制備不同分子質(zhì)量范圍的海膽多肽，對(duì)其部分生物活性進(jìn)行探索，為海膽活性多肽的產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大連紫海膽生殖腺由大連乾日海洋食品有限公司提供；SPF級(jí)Balb/c小鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

人宮頸癌HeLa細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；脫纖維綿羊血 煙臺(tái)品格林實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；健康人血漿大連市中心醫(yī)院。

溶血素 鄭州百基生物科技有限公司；木瓜蛋白酶、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT） 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、Hank’s溶液美國(guó)Thermo Fishier Scientific公司；胎牛血清、臺(tái)盼藍(lán)染液、青霉素、鏈霉素 美國(guó)Ameresco 公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2儀器與設(shè)備

LG-1.0型真空冷凍干燥機(jī) 沈陽(yáng)新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司；WKY型微量移液器、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；電熱恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；超濾膜、8050超濾攪拌器美國(guó)Milipore公司；AB204-N電子分析天平 梅特勒-托利多有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV2100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；快速自動(dòng)平衡離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁電子儀器廠；超低溫冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司；立式壓力蒸汽滅菌 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)學(xué)設(shè)備廠；KDN-102F自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；倒置顯微鏡、顯微鏡 奧林巴斯公司；多孔酶標(biāo)儀德國(guó)Tecan公司；超凈工作臺(tái) 哈東聯(lián)公司；漩渦振蕩器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；WKY型微量移液器 上海求精儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1海膽基本組成成分的測(cè)定

根據(jù) GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》［9］中直接干燥法測(cè)定水分含量；根據(jù) GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》［10］中灼燒稱質(zhì)量法測(cè)定灰分含量；根據(jù)GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》［11］中凱氏定氮法（F=6.25）測(cè)定蛋白質(zhì)含量；根據(jù) GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》［12］中索氏抽提法測(cè)定脂肪含量；采用苯酚-硫酸法（以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)）測(cè)定總糖含量［13］。

1.3.2海膽肽的制備

選用酶活力為37 500 U/g的木瓜蛋白酶，底物質(zhì)量濃度為8 g/100 mL，加酶量為2 500 U/g底物，在48.8 ℃，pH 7.0條件下對(duì)海膽黃水解3 h。水解完成后煮沸滅酶10 min，2 000×g離心10 min收集上清液，首先用10 kD的超濾膜，截留分子質(zhì)量小于10 kD的多肽，然后進(jìn)一步利用5、3、1 kD的超濾膜，將其（＜10 kD的多肽）進(jìn)行超濾分級(jí)，得到分子質(zhì)量分布范圍在5～10、3～5、1～3 kD 和＜1 kD的4 種多肽，經(jīng)冷凍干燥后將各分子質(zhì)量分布范圍的組分于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3人宮頸癌HeLa細(xì)胞體外增殖的測(cè)定

采用MTT法［14］，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化后用含體積分?jǐn)?shù)10%的滅活的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 ?g/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，配成單個(gè)細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔180 ?L，然后加入質(zhì)量濃度分別為50、200 ?g/mL的多肽樣品溶液（用生理鹽水配制并用微孔濾膜過(guò)濾）20 ?L；陰性對(duì)照組加相應(yīng)體積的生理鹽水；每組設(shè)5 個(gè)平行孔；分別于37 ℃、5% CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，向每孔中加入20 ?L的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。1 500 r/min離心15 min，棄上清液，每孔加入150 ?L二甲基亞砜，振蕩后室溫靜置15 min，用酶標(biāo)儀于570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值。

1.3.4淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定

參考Sun Liming等［15］的方法制備脾臟淋巴細(xì)胞。頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌條件下取小鼠脾臟，剔除脂肪和結(jié)締組織，加入適量的Hank’s溶液，用滅菌的注射器針芯碾碎小鼠脾臟，經(jīng)滅菌的200 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集含細(xì)胞的濾過(guò)液，經(jīng)氯化銨破碎紅細(xì)胞、Hank’s溶液洗滌后，獲得小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液。加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度調(diào)整為3×106個(gè)/mL，以180 .L/孔的細(xì)胞、20 .L/孔的不同分子質(zhì)量組分樣品（終質(zhì)量濃度為50、200 mg/L）接種于96 孔培養(yǎng)板中，設(shè)生理鹽水為對(duì)照組，37 ℃、5% CO2、濕度95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入20 ?L 5 mg/mL 的MTT溶液，后續(xù)過(guò)程同1.3.3節(jié)。

1.3.5腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定

參考Kaur等［16］的方法制備腹腔巨噬細(xì)胞。在取腹腔巨噬細(xì)胞前，連續(xù)3 d每天給小鼠腹腔注射0.5 mL淀粉蛋白胨培養(yǎng)基（6 g/100 mL淀粉、0.3 g/100 mL牛肉膏、1 g/100 mL蛋白胨和0.5 g/100 mL NaCl）。第4天頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌條件下剪開(kāi)小鼠腹部外層皮膚，腹腔注入適量的Hank’s溶液，輕揉腹部后，用毛細(xì)吸管吸出腹腔液，收集后經(jīng)破除紅細(xì)胞和洗滌，得到小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，以200 ?L/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，洗去未貼壁細(xì)胞，加入不同分子質(zhì)量組分的樣品（終質(zhì)量濃度為50，200 mg/L），設(shè)生理鹽水為對(duì)照組，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育2 h后，在每孔中加入100 ?L濾過(guò)的1%中性紅生理鹽水溶液，0.5 h后離心棄上清液，用Hank’s液洗滌沉淀3 次后加入200 ?L細(xì)胞裂解液（V（乙醇）∶V（乙酸）=1∶1），靜置10 min后于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.3.6補(bǔ)體抑制作用的測(cè)定

采用補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，觀察不同分子質(zhì)量組分的海膽多肽對(duì)補(bǔ)體經(jīng)典途徑的影響［17］。致敏綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC）懸液的制備：將綿羊血用緩沖液（glucose gelatin veronal buffer，GGVB）（0.141 mol/L NaCl、0.5 mmol/L MgCl2、0.15 mmol/L CaCl2、1.8 mmol/L巴比妥鈉、0.1 g/100 mL明膠，pH 7.4）洗滌3 次，制成2%的SRBC懸液。與經(jīng)1∶4 000稀釋后的溶血素（2 U）等體積混勻， 37 ℃水浴孵育30 min，即為致敏SRBC懸液。

抗補(bǔ)體活性的測(cè)定：采用補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，將100 ?L不同分子質(zhì)量組分的多肽樣品溶液（終質(zhì)量濃度分別為100、50 mg/L），200 ?L 1∶50稀釋的人血清，200 ?L GGVB混合，37 ℃水浴30 min后，加入100 ?L制備的致敏SRBC溶液，37 ℃水浴30 min，1 000×g離心10 min。吸取200 ?L上清液，用酶標(biāo)儀于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，設(shè)生理鹽水代替多肽樣品溶液為對(duì)照組。按下式計(jì)算多肽樣品對(duì)SRBC（補(bǔ)體）的抑制能力。

式中：OD為多肽樣品的光密度值；OD0為對(duì)照組的光密度值。

1.3.7細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用測(cè)定

直接抗氧化作用的測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Chang 肝細(xì)胞，使用含10 g/100 mL的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基，配成細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔添加180 μL細(xì)胞懸液后，加入多肽樣品溶液20μL（樣品終質(zhì)量濃度為10、50 μg/mL），為樣品組?？瞻捉M和叔丁基脂氫過(guò)氧化物（tert-butyl hydroperoxide；butylhydroperoxid，tBOOH）組均加入20 μL培養(yǎng)基代替多肽樣品溶液?；靹蚝螅丝瞻捉M，其他各組均立即加入5 ?L tBOOH溶液（8×10-5mol/L）。繼續(xù)培養(yǎng)2 h，加入MTT溶液（5 mg/mL），后續(xù)過(guò)程同1.3.3節(jié)。

間接抗氧化作用的測(cè)定：細(xì)胞準(zhǔn)備及分組同間接抗氧化作用，樣品組加入多肽后，再培養(yǎng)20 h。之后除空白組，其他各組均加入5 ?L tBOOH溶液（濃度為8×10-5mol/L）。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入MTT溶液（5 mg/mL），后續(xù)過(guò)程同1.3.3節(jié)。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1海膽黃干粉基本成分

本研究所用的海膽黃經(jīng)冷凍干燥后測(cè)得干粉中的水分含量2.02%（以干基計(jì)）、粗蛋白含量40.36%、總糖含量20.93%、脂肪含量28.87%、灰分含量5.98%。結(jié)果表明，海膽黃干粉中蛋白含量較高，其次是油脂及碳水化合物等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這與Dincer等［18］對(duì)Paracentrotus lividus的基本組成研究結(jié)果相似。

2.2對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響

圖1　海膽多肽對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1　Effect of sea urchin peptides on the proliferation of HeLa cells in vitro

不同分子質(zhì)量的海膽多肽對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞體外增殖的影響如圖1所示，與對(duì)照組相比，當(dāng)終質(zhì)量濃度為50 ?g/mL和200 ?g/mL時(shí)，分子質(zhì)量分布范圍為1～3、3～5、5～10 kD的海膽多肽均能顯著抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)（P＜0.05），但這3 種多肽的抑制能力無(wú)顯著差異；另外，＜10 kD的海膽多肽在200 ?g/mL時(shí)也可顯著抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)。

海膽的抗腫瘤活性早有報(bào)道，主要集中在海膽多糖和蛋白質(zhì)提取物方面。高翼等［19］從光棘球海膽棘殼中分離出一種蛋白質(zhì)，對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、胃癌SGC7901細(xì)胞、口腔上皮癌KB細(xì)胞和肺腺癌A549細(xì)胞都具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。劉純慧等［20］制備的海膽黃多糖可顯著抑制S180荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，并可提高荷瘤小鼠免疫功能和抗氧化能力。張忠玲等［21-22］發(fā)現(xiàn)海膽提取物（一種糖脂）對(duì)SGC-7901人胃腺癌細(xì)胞和Bel7402人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果表明海膽多肽在較寬的分子質(zhì)量范圍內(nèi)（1～10 kD）對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)均具有比較穩(wěn)定的抑制作用。組分分析顯示，光棘球海膽黃中多糖含量高達(dá)20.93%，因此海膽多肽的抗腫瘤作用機(jī)制很可能與也是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)的。

2.3對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖2　海膽多肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.2　Effect of sea urchin peptides on lymphocyte growth

由圖2可知，不同分子質(zhì)量范圍的海膽多肽在終濃度為200 ?g/mL時(shí)顯示出對(duì)體外小鼠脾淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，但是其作用效果與多肽分子質(zhì)量之間無(wú)明顯相關(guān)性。高輝等［2］報(bào)道了紫海膽提取物能夠提高受試小鼠外周血的T淋巴細(xì)胞活力和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。劉純慧［23］和徐張展［24］等均發(fā)現(xiàn)海膽黃多糖能夠促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖。因此可以推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)所制備海膽多肽的促淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)作用與多肽中含有的多糖成分密切相關(guān)。

2.4對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

由圖3可知，除分子質(zhì)量＜1 kD的多肽組分外，其他組分的海膽肽在終質(zhì)量濃度為 200 ?g/mL時(shí)能夠明顯促進(jìn)體外小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，其中3～5 kD的多肽組分作用最強(qiáng)。

圖3　海膽肽對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.3　Effect of sea urchin peptides on the phagocytic activity of peritoneal macrophages

巨噬細(xì)胞的吞噬功能是機(jī)體非特異性免疫功能的重要組成部分，發(fā)揮免疫防御、監(jiān)視、調(diào)節(jié)等多種免疫功能［25］。海膽多肽除了能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，還能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，表明海膽多肽對(duì)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能均具有一定的調(diào)節(jié)功能。

2.5對(duì)補(bǔ)體經(jīng)典途徑的影響

圖4　海膽多肽對(duì)補(bǔ)體經(jīng)典途徑活性的抑制作用Fig.4　Inhibitory effect of sea urchin peptides on classical complement pathway activity

由圖4可知，不同分子質(zhì)量范圍的海膽多肽對(duì)補(bǔ)體均有一定的抑制作用。其中，1～3 kD的多肽組分抑制作用相對(duì)較高，當(dāng)終質(zhì)量濃度為50 ?g/mL和200 ?g/mL時(shí)，抑制率分別為24.36%和67.49%，其半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為140.75 ?g/mL。其他組分海膽多肽的IC50在169.39～187.89 ?g/mL之間。上述結(jié)果表明，分子質(zhì)量對(duì)補(bǔ)體的抑制作用有一定影響，但對(duì)補(bǔ)體的抑制作用與多肽分子質(zhì)量之間無(wú)明顯相關(guān)性。

補(bǔ)體系統(tǒng)是人體重要的免疫防御系統(tǒng)之一，其非正常激活會(huì)引起人體免疫系統(tǒng)的過(guò)度反應(yīng)從而造成人體自身的損傷［26］。補(bǔ)體活性異常增高與關(guān)節(jié)、腎臟、紅細(xì)胞等損傷密切相關(guān)。天然存在的抗補(bǔ)體有多糖、黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)、皂苷類(lèi)及蛋白質(zhì)等。關(guān)于多肽的抗補(bǔ)體作用研究并不多見(jiàn)。由于補(bǔ)體經(jīng)典途徑活性是從C1活化啟動(dòng)的，因此海膽多肽很有可能直接抑制C1的活化或抑制C1活化產(chǎn)物；此外，還有可能作用于C2、C3或C4，阻止這3個(gè)組分的活化。具體機(jī)制還有待今后深入研究。

2.6對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

圖5　海膽多肽對(duì)tBOOH致Chang肝細(xì)胞氧化損傷的直接保護(hù)作用Fig.5　Direct protection effect of sea urchin peptides against tBOOH-induced oxidation of Chang liver cells

圖6　海膽多肽對(duì)tBOOH致Chang肝細(xì)胞氧化損傷的間接保護(hù)作用Fig.6　Indirect protection effect of sea urchin peptides against tBOOH-induced oxidation of Chang liver cells

海膽多肽的直接和間接抗氧化作用如圖5、6所示。與空白組比較，tBOOH可導(dǎo)致Chang肝細(xì)胞發(fā)生明顯氧化損傷。由圖5可知，在加入tBOOH溶液的同時(shí)加入海膽多肽，海膽多肽對(duì)tBOOH所致氧化損傷具有直接保護(hù)作用，即海膽多肽的直接抗氧化作用。當(dāng)多肽樣品溶液終質(zhì)量濃度為10 ?g/mL時(shí)，1～3 kD和3～5 kD兩組分的海膽多肽能夠明顯提高Chang肝細(xì)胞活力，具有顯著的抗氧化活性。當(dāng)終質(zhì)量濃度提高至50 ?g/mL時(shí)，所有多肽組分均顯示出明顯的抗氧化能力。其中，3～5 kD的多肽組分抗氧化活性相對(duì)較高。

先加入海膽多肽，使其與Chang肝細(xì)胞作用20 h后再加入tBOOH溶液，可顯示海膽多肽對(duì)Chang肝細(xì)胞內(nèi)在抗氧化能力的影響，結(jié)果如圖6所示。5 個(gè)海膽多肽組分均顯示出抵抗tBOOH氧化損傷的作用。但是，當(dāng)質(zhì)量濃度相同時(shí)，只有5～10 kD多肽組分在10 μg/mL時(shí)的抗氧化能力明顯低于其他組分，總的來(lái)說(shuō)不同多肽組分間的抗氧化活性無(wú)明顯差異。

一般認(rèn)為，多肽的分子質(zhì)量大小與其活性有直接關(guān)系，低分子質(zhì)量多肽通常具有更高的活性［27-28］。在本研究中，海膽多肽的直接抗氧化功能體現(xiàn)了低分子質(zhì)量多肽的抗氧化作用優(yōu)勢(shì)，但在間接抗氧化作用中，這一特點(diǎn)并不突出，其原因有待于進(jìn)一步研究。

3　結(jié) 論

采用木瓜蛋白酶制備了分子質(zhì)量分布范圍＜1、1～3、3～5、5～10 kD和＜10 kD的5 種海膽多肽組分多肽，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平檢測(cè)了上述多肽的抑制腫瘤生長(zhǎng)、淋巴細(xì)胞增殖及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能調(diào)節(jié)、抗補(bǔ)體以及對(duì)氧化損傷Chang肝細(xì)胞的保護(hù)作用?？傮w來(lái)說(shuō)，除了＜1 kD的多肽未表現(xiàn)出抑制腫瘤生長(zhǎng)及促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，1～3 kD多肽的抗補(bǔ)體活性明顯強(qiáng)于其他組分多肽，所制備的海膽多肽均有一定調(diào)節(jié)功能，且不同分子質(zhì)量分布范圍的多肽間活性差異不明顯。高翼［19］、劉純慧［20，23］、張忠玲［21-22］及徐張展［24］等分別從蛋白、多糖和糖脂的角度證明了海膽免疫、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能，為解釋海膽多肽具有上述多種生物活性提供了有力解釋和支持。與Qin Lei等［8］的研究有所不同，＜1 kD多肽的抗氧化活性并非最強(qiáng)，這種現(xiàn)象可能與所用抗氧化模型的不同有關(guān)。與海膽多糖、海膽蛋白相比，海膽多肽不但具有較強(qiáng)生物活性，分子質(zhì)量小，更易吸收，而且加工過(guò)程幾乎沒(méi)有損失。另外，＜10 kD組分生物活性較強(qiáng)且穩(wěn)定，將其作為海膽活性多肽產(chǎn)業(yè)化的主要形式，省去超濾加工環(huán)節(jié)，能顯著降低生產(chǎn)成本。

［1］ 張奕強(qiáng)， 李群， 許實(shí)波. 海膽的化學(xué)與藥理研究概況［J］. 中藥材，1998（2）: 102-105. DOI:10.13863/j.issn1001-4454.1998.02.025.

［2］ 高輝， 陳淑梅， 李領(lǐng)華. 紫海膽提取物SNC的藥理研究: 雄激素樣活性和免疫增強(qiáng)作用探討［J］. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 1987（3）: 166-169.

［3］ SHEEAN P D， HODGES L D， KALAFATIS N， et al. Bioactivity of extracts from gonadal tissue of the edible Australian purple sea urchin Heliocidaris erythrogramma［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2007， 87（4）: 694-701. DOI:10.1002/jsfa.2771.

［4］ NAIR M S R， MATHUR A， TABEI K， et al. Isolation and structure determination of two new bioactive lipids from the gonads of a sea urchin， Stronglyocentrotus droebachiensis［J］. Journal of Natural Products， 1988， 51（1）: 184.

［5］ 童圣英， 陳煒， 由學(xué)策， 等. 三種海膽性腺總脂的脂肪酸組成的研究［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 1998， 22（3）: 247-252.

［6］ GONZALEZ M， CARIDE B， LAMAS A， et al. Nutritive value of protein from sea urchin， and its effects on intestinal leucine aminopeptidase and intestinal and hepatic gammaglutamyltranspeptidase［J］. International Journal of Food Sciences and Nutrition， 2001， 52（3）: 219-24. DOI:10.1080/09637480020027000-3-3.

［7］ 劉純慧， 曹吉超， 王鳳山， 等. 海膽多糖的化學(xué)與藥理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)海洋藥物， 2014， 33（3）: 85-90.

［8］ QIN L， ZHU B W， ZHOU D Y， et al. Preparation and antioxidant activity of enzymatic hydrolysates from purple sea urchin（Strongylocentrotus nudus） gonad［J］. LWT-Food Science and Technology， 2011， 44: 1113-1118. DOI:10.1016/j.lwt.2010.10.013.

［9］ 衛(wèi)生部. GB 5009.3—2010 食品中水分的測(cè)定［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

［10］ 衛(wèi)生部. GB 5009.4—2010 食品中灰分的測(cè)定［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

［11］ 衛(wèi)生部. GB 5009.5—2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

［12］ 衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 5009.6—2003 食品中脂肪的測(cè)定［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2003.

［13］ DUBOIS M， GILLES K A， HAMILTON J K， et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］. Analytical Chemistry， 1956， 28（3）: 350-356. DOI:10.1021/ AC60111A017.

［14］ 王蒞莎， 朱蓓薇， 孫黎明， 等. 鮑魚(yú)內(nèi)臟多糖的體外抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性研究［J］. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 27（4）: 289-293.

［15］ SUN L M， ZHU B W， LI D M， et al. Purifi cation and bioactivity of a sulphated polysaccharide conjugate from viscera of abalone Haliotis discus hannai Ino［J］. Food and Agricultural Immunology， 2010， 21（1）: 15-21. DOI：10.1080/09540100903418859.

［16］ KAUR G， ATHAR M， ALAM M S. Quercus infectoria galls possess antioxidant activity and abrogates oxidative stress-induced functional alterations in murine macrophages［J］. Chemico-Biological Interactions， 2008， 171（3）: 272-282. DOI:10.1016/j.cbi.2007.10.002.

［17］ TATIANA N Z， NATALIA M S， IRINA V N， et al. Inhibition of complement activation by water-soluble polysaccharides of some fareastern brown seaweeds［J］. Comparative Biochemistry and Physiology，2000， 126（3）: 209-215. DOI:10.1016/S0742-8413（00）00114-6.

［18］ DINCER T， CAKLI S. Chemical composition and biometrical measurements of the Turkish sea urchin （Paracentrotus lividus，Lamarck， 1816）［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2007， 47（1）: 21-26. DOI:10.1080/10408390600550265.

［19］ 高翼， 奚濤， 劉純慧， 等. 海膽殼蛋白的分離純化及抗腫瘤活性［J］.中國(guó)天然藥物， 2006， 4（6）: 464-467.

［20］ 劉純慧， 葉亮林， 林親雄， 等. 海膽黃多糖SEP的制備及其抗腫瘤作用研究［J］. 藥物生物技術(shù)， 2006， 13（6）: 429-432.

［21］ 張忠玲， 劉亞民， 韓金祥， 等. 海膽腸提取物的抗腫瘤作用［J］. 腫瘤研究與臨床， 2002， 14（5）: 302-304.

［22］ 張忠玲， 張翠， 梁浩， 等. 海膽腸提取物體外抗腫瘤活性的研究［J］.中華腫瘤防治雜志， 2003， 10（6）: 569-572.

［23］ 劉純慧， 奚濤林， 林親雄， 等. 海膽黃多糖的分離、純化及免疫活性測(cè)定［J］. 中國(guó)海洋藥物， 2006， 25（3）: 7-11.

［24］ 徐張展， 邢瑩瑩， 周長(zhǎng)林， 等. 海膽黃多糖SEP 酶解及產(chǎn)物免疫活性測(cè)定藥物生物技術(shù)［J］. 藥物生物技術(shù)， 2009， 16（4）: 342-346.

［25］ HESEGAWA T， HIROTA K， TOMODA K， et al. Phagocytic activity of alceolar macrophages toward polystyrene latex microspheres and PLGA microspheres loaded with anti-tuberculosis agent［J］. Colloids and Surfaces B Biointerfaces， 2007， 60（2）: 221-228. DOI:10.1016/ j.colsurfb.2007.06.017.

［26］ MAKRIDEA S C. Therapeutic inhibition of the complement system［J］. Pharmaceutical Reviews， 1998， 50: 59-87.

［27］ LI X X， HAN L J， CHEN L J. In vitro antioxidant activity of protein hydrolysates prepared from corn gluten meal［J］. Science Food Agriculture， 2008， 88（9）: 1660-1666. DOI:10.1002/jsfa.3264.

［28］ CHEN G T， ZHAO L， ZHAO L Y， et al. In vitro study on antioxidant activities of peanut protein hydrolysate［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2007， 87（2）: 357-362. DOI:10.1002/jsfa.2744.

Preparation and Bioactivity of Peptides from Strongylocentrotus nudus

WANG Ting1，2， WANG Xiaohui3， MA Ying1，2， JI Xiaotong1，2， WANG Ling1，2， NIAN Yiying1，2， XUE Peng1，2，
MENG Shuang1， QIN Lei1，2， LI Dongmei1，2， ZHANG Gongliang1， HOU Hongman1， SUN Liming1，2，*（1. Food Science and Technology School， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China； 2. National Engineering Research Center of Seafood， Dalian 116034， China； 3. Shandong Oriental Ocean Group Limited Company， Yantai 264003， China）

Strongylocentrotus nudus is one of the major species of economic sea urchin in China. It has high food and medicinal value due to its delicious taste and nutritional richness. In this work， bioactive peptides were prepared by enzymatic hydrolysis of Strongylocentrotus nudus gonads with papain and their bioactivities were investigated. Five fractions with molecular weight distribution of ＜ 1， 1-3， 3-5， 5-10 and ＜10 kD were obtained by ultrafiltration of the hydrolysate. Results showed that all the peptide fractions at a fi nal concentration of 200 ?g/mL could promote lymphocyte growth. Moreover， at this concentration， all the peptides except the fraction of ＜ 1 kD could inhibit the growth of HeLa cells， and promote the phagocytic function of peritoneal macrophages. At 50 ?g/mL， all the peptide fractions could protect Chang liver cells against oxidation induced by tert-butyl hydroperoxide； butylhydroperoxid through direct and indirect pathways. All the peptides could inhibit the classical complement pathway activity in a dose-dependent manner. All the above results suggested potential regulatory activity on cellular and humoral immune function and anti-oxidant capacity. The multiple bioactivities of these peptides deserve further investigation.

sea urchin； peptide； bioactivities； HeLa cell

10.7506/spkx1002-6630-201619040

S985；R151.3

A

1002-6630（2016）19-0237-06

王婷， 王曉慧， 馬瑩， 等. 光棘球海膽多肽的制備及其生物活性［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 237-242. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619040. http：//www.spkx.net.cn

WANG Ting， WANG Xiaohui， MA Ying， et al. Preparation and bioactivity of peptides from Strongylocentrotus nudus［J］. Food Science，2016， 37（19）： 237-242. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619040. http：//www.spkx.net.cn

2016-04-08

遼寧省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目（2015020794）；遼寧省優(yōu)秀人才項(xiàng)目（LJQ2012048）

王婷（1990—），女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)食品加工與活性物質(zhì)研究。E-mail：254087063@qq.com

孫黎明（1974—），女，教授，博士，主要從事水產(chǎn)品加工、質(zhì)量控制及活性物質(zhì)研究。

E-mail：sunlm1974@163.com