常溫條件下白魚中特定腐敗菌的鑒定

夏秀東，劉小莉，王　英，李　瑩，黃自蘇，賈洋洋，董明盛，周劍忠，*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

常溫條件下白魚中特定腐敗菌的鑒定

夏秀東1，劉小莉1，王英1，李瑩1，黃自蘇1，賈洋洋1，董明盛2，周劍忠1，*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

通過分析常溫條件下無菌白魚魚塊（CK）以及接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊的感官評(píng)價(jià)、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVBN）值、腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)以及pH值的變化，以腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)和TVBN產(chǎn)量因子（YTVBN/CFU）為定量指標(biāo)，鑒定了常溫條件下導(dǎo)致白魚腐敗的特定腐敗菌（specifi c spoilage organism，SSO）。結(jié)果表明，在CK和接種葡萄球菌wf-1（Staphylococcus sp.wf-1）、摩根氏菌wf-1（Morganella sp.wf-1）、摩根氏菌wf-2（Morganella sp.wf-2）、變形桿菌wf-1（Proteus sp.wf-1）、變形桿菌wf-2（Proteus sp.wf-2）和變形桿菌wf-3（Proteus sp.wf-3）的無菌白魚魚塊中，以接種Morganella sp.wf-1的無菌白魚魚塊達(dá)到感官拒絕點(diǎn)的時(shí)間最短，為15.16 h，此時(shí)魚塊的TVNB含量和菌落總數(shù)分別為29.98 mg/100 g和7.53（lg（CFU/g））。對(duì)這些腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)和YTVBN/CFU分析發(fā)現(xiàn)，Morganella sp.wf-1在無菌白魚魚塊上的生長(zhǎng)延滯期最短，為2.60 h；最大比生長(zhǎng)速率最大，為0.304 6 h-1；YTVBN/CFU最大，為6.27×10-9mg TVBN/CFU。所有白魚魚塊均出現(xiàn)pH值先下降后上升的過程，其中接種Morganella sp.wf-1和Morganella sp.wf-2的無菌魚塊在8～48 h之間的pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CK和接種其他腐敗菌的無菌白魚魚塊。結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和SSO的概念，最終確定Morganella sp.wf-1為常溫條件下導(dǎo)致白魚腐敗的SSO。

白魚；特定腐敗菌；揮發(fā)性鹽基氮；生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)；摩根氏菌

魚類因具有較高的水分含量和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而極易腐敗，而微生物的生長(zhǎng)代謝是導(dǎo)致魚類腐敗的主要原因。盡管剛捕獲的魚體所攜帶的細(xì)菌菌相組成較為復(fù)雜，但在特定的貯藏條件下，其細(xì)菌菌相則趨于簡(jiǎn)單。國外研究者從19世紀(jì)中期就開始對(duì)捕獲和貯藏、流通過程中魚類的微生物進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)雖然在最初魚類會(huì)受到多種微生物的污染，但是只有少數(shù)幾種細(xì)菌參與了腐敗過程［1］。這些細(xì)菌能很快適應(yīng)魚肉環(huán)境并迅速繁殖，成為魚肉中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌，同時(shí)利用魚肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)生生物胺、硫化物、醛、酮、酯、有機(jī)酸等物質(zhì)，產(chǎn)生不良?xì)馕逗臀兜?，使魚肉在感官上變的無法接受，這些細(xì)菌便是該種魚的特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）［2-3］。魚類捕獲后到貨架期終點(diǎn)，主要腐敗菌的組成因魚種、捕獲季節(jié)、水域和貯藏條件等的不同而不同。據(jù)報(bào)道，未冷藏鮮魚的SSO主要是弧菌科（Vibrionaceae）等發(fā)酵型革蘭氏陰性細(xì)菌［4］。而在有氧冷藏中來自不同水域的水產(chǎn)品的SSO多為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）或假單胞菌（Pseudomonas）［4］。真空冷藏或氣調(diào)包裝水產(chǎn)品的SSO多為磷發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）、熱殺索氏菌（Brochothrix thermosphacta）和乳酸菌（Lactobacillus）［5］。因此，確定不同水產(chǎn)品特定條件下的SSO，對(duì)于SSO的靶向抑制具有非常重要的指導(dǎo)意義。

白魚肉質(zhì)白而細(xì)嫩，味美而不腥，一貫被視為上等佳肴。隨著人工飼養(yǎng)面積的不斷增加，白魚產(chǎn)量不斷提高，但是由于白魚極易腐敗，保存難度較大，因此，對(duì)導(dǎo)致白魚腐敗的特定腐敗菌進(jìn)行研究，并提出靶向抑制措施迫在眉睫。根據(jù)SSO的定義，SSO不僅是腐敗終點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，而且具有產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物能力強(qiáng)等特點(diǎn)。因此，對(duì)于SSO的確定必須同時(shí)從篩選生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌及其腐敗能力兩方面進(jìn)行。在前期的研究中［6］，本課題組已對(duì)常溫條件下腐敗白魚的細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，發(fā)現(xiàn)分離于腸桿菌篩選培養(yǎng)基（violet red bile dextrose aga，VRBDA）的白魚腐敗菌在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，經(jīng)鑒定得到了5 株細(xì)菌，分別為摩根氏菌wf-1（Morganella sp.wf-1）、摩根氏菌wf-2（Morganella sp.wf-2）、變形桿菌wf-1（Proteus sp.wf-1）、變形桿菌wf-2（Proteus sp.wf-2）和變形桿菌wf-3（Proteus sp.wf-3），因此，初步判定它們中的一種或幾種可能是白魚在常溫條件下的SSO。葡萄球菌是最常見的致病菌之一。

本研究對(duì)以上5 株菌及同時(shí)分離得到的一株葡萄球菌（Staphylococcus sp.wf-1）在無菌白魚魚塊上的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)及其腐敗能力進(jìn)行研究，分析了它們的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)、腐敗產(chǎn)物揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVBN）的產(chǎn)量因子（YTVBN/CFU）以及對(duì)照（control group，CK）和接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊的pH值等數(shù)據(jù)，以期確定常溫條件下導(dǎo)致白魚腐敗的SSO，為白魚的防腐保鮮提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、培養(yǎng)基與儀器

鮮活白魚（體質(zhì)量1.5 kg左右）購自江蘇省南京市玄武區(qū)孝陵衛(wèi)菜市場(chǎng)。

平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA） 上海盛思生化科技有限公司。

便攜式pH計(jì) 美國Thermo公司；半微量定氮儀國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HJ-3型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 國華電器有限公司；SX-500-TOMY高壓滅菌鍋日本Tomy公司；3K15 離心機(jī) 美國Sigma公司；JY300C型電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；THZ-C-1型臺(tái)式全溫振蕩器 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-K型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州華宏凈化技術(shù)有限公司；S1000TM熱循環(huán)儀 美國Bio-Rad公司；JT-B均質(zhì)器 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1感官質(zhì)量評(píng)價(jià)

參考Taoukis等［7］的方法。感官評(píng)價(jià)小組由6 名經(jīng)過訓(xùn)練的評(píng)價(jià)員組成，對(duì)白魚的氣味和味道作出評(píng)價(jià)。以3 分法為評(píng)價(jià)手段，0代表最高品質(zhì)；1代表最高品質(zhì)終點(diǎn)，此時(shí)魚塊開始出現(xiàn)輕微異臭味；2代表感官拒絕點(diǎn)，此時(shí)魚塊表面發(fā)亮、黏稠，出現(xiàn)強(qiáng)烈的惡臭味、腥臭味。蒸熟時(shí)將中段魚塊用鋁箔包好，待鍋中水沸騰后，將試樣放入鍋內(nèi)的金屬篦子上，蓋上鍋蓋蒸20 min后取出，立即進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.2.2無菌白魚魚塊的制備

依據(jù)Herbert［8］和Dalgaard［9］等的方法制備無菌白魚魚塊。用刀背用力敲擊白魚后腦部，使其無掙扎立即死亡。將清洗后去除鱗、魚鰭、內(nèi)臟的白魚置于鋪有保鮮膜的砧板上，吸干魚體表面的水分，用75%的酒精擦拭魚體，殺滅魚體表面細(xì)菌。用滅菌解剖刀將白魚背脊部無污染魚肉切下，注意不能切至腹腔。去掉魚皮后，將魚肉修剪成25～35 g/塊的無菌白魚魚塊。

1.2.3腐敗菌的接種

參照李學(xué)英等［1］在無菌魚塊上接種腐敗菌的方法。將過夜培養(yǎng)的菌液（約108CFU/mL）離心，去除上清液，用0.8%生理鹽水稀釋至106CFU/mL。將無菌魚塊分別浸入Morganella sp.wf-1、Morganella sp.wf-2、Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2、Proteus sp.wf-3和Staphylococcus sp.wf-1的生理鹽水稀釋液中，10 s后取出瀝干，分裝到1 000 mL滅菌錐形瓶中，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔4 h取樣品分別進(jìn)行感官評(píng)價(jià)、 TVBN值測(cè)定、菌落總數(shù)計(jì)數(shù)和pH值測(cè)定。沒有接種腐敗菌的魚塊為對(duì)照組（CK）。

1.2.4微生物計(jì)數(shù)與培養(yǎng)

參考夏秀東等［6］的方法，每個(gè)稀釋液做3 個(gè)重復(fù)。1.2.5 微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

根據(jù)25 ℃條件下CK和接種不同腐敗菌白魚魚塊得到的細(xì)菌總數(shù)，用修正的Gompertz方程［10］通過Origin 8.0軟件對(duì)腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行描述。修正的Gompertz方程見公式（1）。

式中：t為培養(yǎng)時(shí)間/h；N（t）為t時(shí)的菌數(shù)；N0、Nmax為初始和最大菌數(shù)/（CFU/g）；μmax為微生物生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率/h-1；Lag為微生物生長(zhǎng)的延滯時(shí)間/h，Lag-t為延滯時(shí)間與培養(yǎng)時(shí)間的差。

具體步驟為：運(yùn)行Origin 8.0軟件，錄入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，制作散點(diǎn)圖，選擇擬合中的非線性擬合，新建方法，在公式欄輸入擬合方程，并對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行定義后進(jìn)行擬合，同時(shí)，在分析結(jié)果中得到μmax和Lag值。

1.2.6TVBN值的測(cè)定

參照SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》［11］中的具體方法。

1.2.7pH值的測(cè)定

參照Fan Hongbing等［12］的方法，準(zhǔn)確稱取10 g樣品用剪刀剪成小塊后放入均質(zhì)機(jī)中，加90 mL去離子水，用均質(zhì)器充分均質(zhì)30 s后室溫放置30 min，用數(shù)顯pH計(jì)測(cè)量pH值。

1.2.8腐敗菌腐敗能力的定量分析

參照李學(xué)英等［1］的實(shí)驗(yàn)方法，把達(dá)到感官拒絕點(diǎn)時(shí)單位腐敗菌產(chǎn)生TVBN的量，即產(chǎn)量因子YTVBN/CFU作為腐敗菌腐敗能力評(píng)價(jià)的定量指標(biāo)，計(jì)算見公式（2）。

式中：YTVBN/CFU為單位腐敗菌產(chǎn)生T V B N的量/（mg TVBN/CFU）；N0為初始菌數(shù)/（CFU/g）；Ns為感官拒絕點(diǎn)時(shí)的腐敗菌數(shù)即最小腐敗菌數(shù)/（CFU/g）；TVBN0、TVBNs分別為初始和感官拒絕點(diǎn)時(shí)的TVBN含量/（mg/100 g）。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

感官評(píng)價(jià)和TVBN的變化用 Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，腐敗菌生長(zhǎng)采用修正的Gompertz方程描述，用Origin 8.0軟件進(jìn)行非線性回歸分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS 10軟件中的單因素方差分析 （one way analysis of variance，one-way ANOVA）進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1常溫條件下接種不同腐敗菌無菌白魚魚塊的感官評(píng)價(jià)

圖1　常溫條件下接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊的感官評(píng)價(jià)Fig.1　Sensory quality change of sterile fish blocks inoculated with different spoilage bacteria at room temperature

表1　達(dá)到高品質(zhì)終點(diǎn)和感官拒絕點(diǎn)所用時(shí)間Table1　limits of the best quality and sensory acceptability for CK and whitefish blocks inoculated with different spoilage bacteria at room temperature h

由6 名經(jīng)過培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)員對(duì)CK和接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊進(jìn)行評(píng)價(jià)后的結(jié)果如圖1和表1所示。經(jīng)評(píng)價(jià)，CK達(dá)到最高品質(zhì)終點(diǎn)和感官拒絕點(diǎn)的時(shí)間最長(zhǎng)，分別為14.22 h和30.30 h，其次是接種Staphylococcus sp.wf-1和Proteus sp.wf-3的無菌白魚魚塊，達(dá)到最高品質(zhì)終點(diǎn)和感官拒絕點(diǎn)的時(shí)間分別為11.11、25.00 h和11.17、23.14 h，接種Morganella sp.wf-2、Proteus sp.wf-1和Proteus sp.wf-2的無菌白魚魚塊達(dá)到最高品質(zhì)終點(diǎn)和感官拒絕點(diǎn)的時(shí)間比較相近，分別在8～9 h和17～20 h。而接種Morganella sp.wf-1的無菌白魚魚塊達(dá)到最高品質(zhì)終點(diǎn)和感官拒絕點(diǎn)最快，分別只有7.24 h和15.16 h。

2.2接種不同腐敗菌無菌白魚魚塊TVBN含量的變化

圖2　接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊TVBN含量的變化Fig.2　TVBN change of sterile fish blocks inoculated with different spoilage bacteria at room temperature

TVBN是微生物分解蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮化合物產(chǎn)生的氨、生物胺等堿性代謝產(chǎn)物的總稱，是評(píng)價(jià)食品品質(zhì)最常用的指標(biāo)之一。CK和接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊的TVBN含量變化曲線如圖2所示，新鮮白魚TVBN含量為7.12 mg/100 g。在最初8 h內(nèi)CK和接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊的TVBN含量沒有明顯的變化，均維持在7～10 mg/100 g之間。8 h以后CK和接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊的TVBN含量迅速增加，其中接種Morganella sp.wf-1的無菌白魚魚塊增加最快，其次為Morganella sp.wf-2，CK增加最慢。CK以及接種Staphylococcus sp. wf-1、Morganella sp.wf-1、Morganella sp.wf-2、Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2和Proteus sp.wf-3的無菌白魚魚塊達(dá)到最高品質(zhì)終點(diǎn)時(shí)的TVBN含量分別為12.64、11.80、10.95、12.36、11.99、13.74、10.67 mg/100 g，達(dá)到感官拒絕點(diǎn)時(shí)的TVBN含量分別為27.45、28.58、29.98、25.26、22.64、26.70、23.70 mg/100 g。

2.3接種不同腐敗菌無菌白魚魚塊菌落總數(shù)的變化

微生物的生長(zhǎng)和代謝是導(dǎo)致魚類腐敗的主要原因，CK和接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊的微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)可以用修正的Gompertz方程描述，如圖3所示，微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)均呈現(xiàn)典型的S型曲線，且擬合所得的R2均較高（表2）。由圖3和表2數(shù)據(jù)可知，本研究制作的無菌魚塊的菌落總數(shù)為1.87（lg（CFU/g）），小于2（lg（CFU/g）），符合實(shí)驗(yàn)要求。接種Staphylococcus sp.wf-1、Morganella sp.wf-1、Morganella sp.wf-2、Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2和Proteus sp.wf-3后的無菌白魚魚塊的菌落總數(shù)分別為4.10、3.86、4.09、3.89、3.86（lg（CFU/g））和3.92（lg（CFU/g）），各腐敗菌在數(shù)量上占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無菌魚塊的細(xì)菌總數(shù)均低于接種腐敗菌的魚塊，保證了接種后的腐敗菌是引起魚塊腐敗主要原因。CK的殘留細(xì)菌和接種于無菌魚塊上的腐敗菌經(jīng)過一段時(shí)間的延滯期后迅速增殖，其中Morganella sp.wf-1和Morganella sp.wf-2的增殖速率最快，其他腐敗菌的增殖速率相對(duì)較慢。

圖3　常溫條件下接種不同腐敗菌的無菌白魚魚塊菌落總數(shù)的變化Fig.3　Total bacterial count change of sterile fish blocks inoculated with different spoilage bacteria at room temperature

2.4腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表2　常溫條件下CK殘留細(xì)菌和接種于無菌白魚魚塊的腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table2　Growth kinetic parameters of remaining and inoculated spoilage bacteria at room temperature

如表2所示，CK殘留細(xì)菌及接種于無菌白魚魚塊上的腐敗菌的最大腐敗菌數(shù)（Nmax）均高于最小腐敗菌數(shù)（Ns），這表明這些微生物均能引起白魚的腐敗。Morganella sp.wf-1的生長(zhǎng)延滯期最短，為2.60 h，說明Morganella sp.wf-1能迅速適應(yīng)魚肉環(huán)境，利用魚肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速生長(zhǎng)繁殖。Staphylococcus sp.wf-1、Morganella sp.wf-2、Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2和Proteus sp.wf-3的生長(zhǎng)延滯期相差不大，在3.09～5.68 h之間，CK殘留細(xì)菌的延滯期最長(zhǎng)達(dá)到了7.51 h。Morganella sp.wf-1的比生長(zhǎng)速率最大，為0.304 6 h-1。其次為CK殘留細(xì)菌和Morganella sp.wf-2，最大比生長(zhǎng)速率分別為0.298 5 h-1和0.275 4 h-1。Staphylococcus sp.wf-1的比生長(zhǎng)速率最小，為0.220 3 h-1。Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2和Proteus sp.wf-3的比生長(zhǎng)速率相差不大，分別為0.257 4、0.262 0 h-1和0.263 4 h-1。

2.5腐敗菌TVBN產(chǎn)量因子

腐敗菌腐敗能力的定量指標(biāo)常以達(dá)到感官拒絕點(diǎn)時(shí)單位腐敗菌產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物來衡量。由表3可知，CK殘留微生物及6 種腐敗菌的TVBN產(chǎn)量因子YTVBN/CFU從大到小依次為Morganella sp.wf-1＞Morganella sp.wf-2＞Proteus sp.wf-2＞CK＞Proteus sp.wf-1＞Proteus sp.wf-3＞Staphylococcus sp.wf-1，說明Morganella sp.wf-1代謝白魚營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物的能力最強(qiáng)。

表3　接種腐敗菌的無菌白魚魚塊在常溫條件下腐敗菌的產(chǎn)量因子Table3　Yield factors for TVBN production of spoilage bacteria inoculated to sterile fish blocks at room temperature 10-9mg TVBN/CFU

2.6接種不同腐敗菌白魚魚塊在腐敗過程中pH值的變化

CK和接種不同腐敗菌的無菌白魚塊在48 h內(nèi)的pH值變化情況如圖4所示。剛宰殺的白魚的pH值為6.81，與已報(bào)道的魔鬼魚和青魚的pH值相近［12-13］。在最初8 h內(nèi)白魚魚塊的pH值下降到6.41～6.51，隨后持續(xù)升高到48 h的7.31（CK）、7.69（Staphylococcus sp.wf-1）、7.98（Morganella sp.wf-1）、7.89（Morganella sp.wf-2）、7.67（Proteus sp.wf-1）、7.81（Proteus sp.wf-2）和7.65（Proteus sp.wf-3），本研究結(jié)果與Benjakul［14］和熊雄［15］等的研究結(jié)果一致。值得注意的是接種Morganella sp.wf-1和Morganella sp.wf-2的無菌魚塊在8～48 h之間的pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CK和接種其他腐敗菌的無菌白魚魚塊。

圖4　接種不同腐敗菌白魚魚塊常溫條件條件下pH值的變化Fig.4　pH change of CK and sterile fish blocks inoculated with different spoilage bacteria at room temperature

3　討 論

研究魚類SSO的腐敗特性可以為開發(fā)新的魚肉保鮮技術(shù)和確保魚類產(chǎn)品的安全提供必要的理論依據(jù)。對(duì)腐敗菌的腐敗能力分析時(shí)，滅菌魚汁和無菌魚塊分別為腐敗菌的常用培養(yǎng)基質(zhì)［16］。用滅菌魚汁作為基質(zhì)測(cè)定腐敗菌的腐敗能力具有簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)，但這一方法也存在嚴(yán)重缺陷，那就是難以模擬魚肉復(fù)雜的組織環(huán)境；雖然制作無菌魚塊的操作要求較高，而且其本身含有一定數(shù)量的微生物，但總數(shù)小于102CFU/g［17-18］，最重要的是無菌魚塊更接近腐敗菌的生長(zhǎng)環(huán)境，只要控制好操作過程，得到的數(shù)據(jù)更能準(zhǔn)確地反映腐敗菌的真實(shí)生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，對(duì)于貨架期的預(yù)測(cè)具有更接近實(shí)際的指導(dǎo)意義。篩選優(yōu)勢(shì)腐敗菌并分析其腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)量因子是研究腐敗菌的腐敗能力、確定SSO最常用的手段之一。

為確定氣調(diào)包裝下大馬哈魚的SSO，Macé等［16］提出了兩步分析法，首先對(duì)腐敗的氣調(diào)包裝大馬哈魚中篩選出的8 株潛在腐敗菌及感官指標(biāo)進(jìn)行比較分析，從中篩選出3 株腐敗能力較強(qiáng)的菌株；進(jìn)而將這3 株腐敗菌反接到無菌魚塊上，對(duì)感官、微生物及理化指標(biāo)作進(jìn)一步分析后確定一株腐敗能力最強(qiáng)的發(fā)光磷桿菌為氣調(diào)包裝下大馬哈魚的SSO。本實(shí)驗(yàn)前期研究表明Morganella sp.wf-1、Morganella sp.wf-2、Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2和Proteus sp.wf-3這5 株菌中的一株或幾株可能是腐敗白魚的SSO［6］。進(jìn)一步的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)Morganella sp.wf-1的最大比生長(zhǎng)速率最快，生長(zhǎng)延滯期最短，最大菌落總數(shù)最大（表2），這說明它能很快適應(yīng)魚肉環(huán)境，迅速生長(zhǎng)繁殖，并最終成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

衡量腐敗菌的腐敗能力的指標(biāo)有很多種，TVBN、三甲胺（trimethylamine，TMA）的產(chǎn)量因子則是最常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)［19-20］。氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）是廣泛存在于硬骨海產(chǎn)魚中的鮮味物質(zhì)，海水魚中TMAO含量較高，每100 g魚肉組織中含1～100 mg TMAO［21］。TMA是魚體內(nèi)的氧化TMA還原酶還原TMAO的產(chǎn)物，且隨著魚體品質(zhì)的下降逐漸增加，因此，TMA含量常作為海產(chǎn)魚類腐敗菌的腐敗能力評(píng)價(jià)指標(biāo)之一［22］。而淡水魚肉一般僅含有5～20 mg TMAO，隨著魚肉品質(zhì)的下降TMA的增加量并不明顯，不適合作為淡水魚腐敗菌的腐敗能力指標(biāo)［21］。TVBN是微生物分解蛋白及氨基酸等產(chǎn)生的一系列低級(jí)揮發(fā)性胺/氨類化合物的統(tǒng)稱。大量研究證明，TVBN與菌落總數(shù)、感官評(píng)價(jià)有良好的相關(guān)性［23-25］，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重復(fù)性好，且對(duì)海產(chǎn)魚和淡水魚都適用，能很好地反映魚的腐敗程度，因此，TVBN產(chǎn)量因子就成為鑒定魚類特定腐敗菌腐敗能力最常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究以淡水魚白魚為研究對(duì)象，用TVBN產(chǎn)量因子作為腐敗菌腐敗能力的首選定量指標(biāo)。研究結(jié)果表明Morganella sp.wf-1和Morganella sp.wf-2有著較高的TVBN產(chǎn)量因子，分別達(dá)到了6.27×10-9mg TVBN/CFU和5.16×10-9mg TVBN/CFU（表3）。許振偉等［26］對(duì)冷藏淡水魚鯉魚和羅非魚腐敗希瓦氏菌、惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌的TVBN產(chǎn)量因子進(jìn)行了分析，鯉魚接種腐敗希瓦氏菌和惡臭假單胞菌的TVBN產(chǎn)量因子分別為9.28×10-9mg TVBN/CFU和1.81×10-8mg TVBN/CFU，羅非魚接種腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的TVBN產(chǎn)量因子分別為9.1 0×1 0-9m g T V B N/C F U和1.67×10-8mg TVBN/CFU。結(jié)合本研究結(jié)果表明，不同腐敗菌在不同條件下的TVBN產(chǎn)量因子相差很大，這必然會(huì)造成不同的腐敗菌導(dǎo)致魚類產(chǎn)品腐敗的速度不同，因此有必要對(duì)不同的腐敗菌在不同條件下的腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)量因子進(jìn)行分析，從而提出有針對(duì)性的抑制手段。

動(dòng)物肌肉pH值的變化與其新鮮度有著密切的關(guān)系，可以作為判斷新鮮度及品質(zhì)的參考標(biāo)準(zhǔn)。通常，水產(chǎn)動(dòng)物停止呼吸后，體內(nèi)的糖原、ATP和磷酸肌酸等被降解，生成乳酸等酸性物質(zhì)，使得肌肉pH值下降，下降程度與肌肉中糖原、ATP和磷酸肌酸等的含量有關(guān)。隨后在內(nèi)源酶和微生物的共同作用下，魚體內(nèi)的氨基酸、蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)被分解為氨、生物胺、吲哚、三甲胺等堿性物質(zhì)，使得肌肉pH值上升［27］。但是宰前經(jīng)過激烈掙扎的鱈魚，由于糖原等大量消耗而含量較低，使得其宰后沒有乳酸積累，而沒有出現(xiàn)pH值先下降后上升的過程，而是持續(xù)上升［28］。本研究所用白魚采用迅速錘暈的宰殺方式，因此，肌肉中的糖原含量較高，宰后白魚肌肉pH值有一個(gè)明顯的先下降后上升的過程。

Hozbor等［29］的研究結(jié)果表明，假單胞菌和明亮發(fā)光桿菌一直是鮮活海產(chǎn)三文魚在有氧貯藏條件下的SSO，優(yōu)勢(shì)SSO為明亮發(fā)光桿菌，其次是氣單胞菌屬，且其研究結(jié)果證明TVB-N含量與SSO菌落數(shù)具有良好的相關(guān)性。Hovda等［30］對(duì)氣調(diào)包裝的鱈魚進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在不同的氣調(diào)包裝條件下SSO不同。郭全友等［31］對(duì)新鮮大黃魚冷藏期間的菌相變化研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏初期大黃魚細(xì)菌菌相復(fù)雜，種類繁多，優(yōu)勢(shì)菌種有氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、摩氏桿菌屬和腸桿菌科細(xì)菌，而隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，微生物種類逐漸變少，最終確定冷藏大黃魚的SSO為腐敗希瓦氏菌。而本研究結(jié)果表明Morganella sp.wf-1為常溫條件下導(dǎo)致白魚腐敗的SSO。這說明導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的SSO具有多樣性的特點(diǎn)，而這與不同魚種生存的水域、捕撈時(shí)節(jié)、運(yùn)輸條件、貯藏條件等有關(guān)。

4　結(jié) 論

經(jīng)過對(duì)CK和接種Morganella sp.wf-1、Morganella sp.wf-2、Proteus sp.wf-1、Proteus sp.wf-2、Proteus sp.wf-3和Staphylococcus sp.wf-1無菌白魚魚塊感官評(píng)定、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性、TVBN產(chǎn)量因子、pH值的分析，最終確定Morganella sp.wf-1為常溫條件下白魚的SSO。本研究結(jié)果為研究白魚特定腐敗菌的靶向抑制方法，延長(zhǎng)白魚的保質(zhì)期提供了一定的理論依據(jù)。

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Identification of Specific Spoilage Organisms in Whitefish at Room Temperature

XIA Xiudong1， LIU Xiaoli1， WANG Ying1， LI Ying1， HUANG Zisu1， JIA Yangyang1， DONG Mingsheng2， ZHOU Jianzhong1，*
（1. Institute of Agricultural Product Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China；2. College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Sensory quality， total volatile base nitrogen （TVBN） value， the growth of spoilage bacteria and pH in sterile whitefi sh blocks （as control， CK） and those inoculated with different spoilage bacteria were analyzed， and growth kinetic parameters of spoilage bacteria and the yield factor for TVBN production （YTVBN/CFU） were used for quantitative measurements of microbial spoilage to identify the specifi c spoilage organism （SSO） of whitefi sh at room temperature. The results showed that the whitefi sh blocks inoculated with Morganella sp.wf-1 reached the limit （15.16 h） of sensory acceptability earlier than CK and whitefi sh inoculated with Staphylococcus sp.wf-1， Morganella sp.wf-1， Morganella sp.wf-2， Proteus sp.wf-1，Proteus sp.wf-2 and Proteus sp.wf-3， and TVBN value and total bacterial count were 29.98 mg/100 g and 7.53 （lg（CFU/g））at this time point， respectively. The analysis of growth kinetic parameters and YTVBN/CFUfor these spoilage organisms showed that Morganella sp.wf-1 had the shortest lag phase of growth， maximum specifi c growth rate and YTVBN/CFU， which were 2.60 h，0.304 6 h-1and 6.27 × 10-9mg TVBN/CFU， respectively. The pH value tended to fi rst decline and then rise for CK and all whitefi sh blocks inoculated with different spoilage bacteria. Notably， pH of whitefi sh blocks inoculated with Morganella sp. wf-1 and Morganella sp.wf-2 was much higher than that of CK and whitefi sh meat inoculated with other spoilage organisms at 8-48 h time points. In conclusion， Morganella sp.wf-1 was the SSO in whitefi sh at room temperature also taking into account the concept of SSO.

whitefish； specific spoilage organism； total volatile base nitrogen （TVBN）； growth kinetic parameters；Morganella sp.

10.7506/spkx1002-6630-201619031

TS201.3

A

1002-6630（2016）19-0183-07

夏秀東， 劉小莉， 王英， 等. 常溫條件下白魚中特定腐敗菌的鑒定［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 183-189. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619031. http：//www.spkx.net.cn

XIA Xiudong， LIU Xiaoli， WANG Ying， et al. Identification of specific spoilage organisms in whitefish at room temperature［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 183-189. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619031. http：//www.spkx.net.cn

2015-11-17

江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目（Y2015-29）

夏秀東（1985—），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：86084056@163.com

周劍忠（1965—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zjzluck@126.com