• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    抑制口腔變異鏈球菌的乳酸菌篩選及其抑菌機(jī)理

    2016-11-09 01:44:05郭夏蕾楊貞耐
    食品科學(xué) 2016年19期
    關(guān)鍵詞:菌膜鏈球菌乳酸菌

    郭夏蕾,張 健,楊貞耐*

    (北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

    抑制口腔變異鏈球菌的乳酸菌篩選及其抑菌機(jī)理

    郭夏蕾,張健,楊貞耐*

    (北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

    利用乳酸菌能抑制有害菌的特性,從實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌中篩選能抑制口腔變異鏈球菌的菌株,并測(cè)定了篩選菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC),以及其對(duì)變異鏈球菌菌膜形成和黏附性的影響,初步研究其抑菌機(jī)理。結(jié)果表明,有5 株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1對(duì)變異鏈球菌具有明顯的抑制作用。4 株變異鏈球菌指示菌中,變異鏈球菌(Streptococcus mutans)1.2499、1.2500對(duì)植物乳桿菌比較敏感。植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌的抑制作用比其他4株植物乳桿菌的作用更明顯,其MIC最低(1.25×107~2.50×107CFU/mL)。同時(shí),菌株K25對(duì)變異鏈球菌菌膜形成的抑制率較高,還顯著地降低變異鏈球菌的黏附率。對(duì)菌株K25抑菌機(jī)理的初步研究表明,其代謝過程中產(chǎn)生的乳酸和過氧化氫起到了主要的抑菌作用。

    變異鏈球菌;益生菌;植物乳桿菌;抑菌活性

    齲齒是一種常見的口腔疾病,對(duì)口腔健康危害很大。其原因是變異鏈球菌(Streptococcus mutans)與口腔中的碳水化合物共同作用,形成的有機(jī)酸(主要是乳酸)不斷地侵蝕包裹在牙齒外面的牙釉質(zhì),進(jìn)而使牙齒硬組織發(fā)生去礦化作用而形成齲齒[1]。變異鏈球菌的致病作用依賴于其對(duì)光滑牙面的黏附能力,一般來說,這種黏附作用主要通過兩個(gè)階段實(shí)現(xiàn)[2-4]:首先是變異鏈球菌通過氫鍵和疏水作用等蔗糖非依賴性黏附實(shí)現(xiàn)初始黏附;然后是經(jīng)蔗糖依賴性黏附,主要是水不溶性胞外多糖,使變異鏈球菌黏附到牙面上,該過程在變異鏈球菌定殖到牙面的過程中發(fā)揮主要作用。對(duì)于齲齒的治療通常是使用抗生素藥物,但長(zhǎng)期使用抗生素不僅會(huì)使口腔中微生物系統(tǒng)失衡,還會(huì)使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng),不利于口腔健康[5]。乳酸菌是一種有益于人體健康的重要微生物,同時(shí)也存在于人口腔中,對(duì)于維持口腔微生態(tài)平衡具有重要作用[6]。從乳酸菌中篩選有益于口腔健康的益生菌受到了研究者們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。

    隨著益生菌療法在防治胃腸道感染疾病方面的優(yōu)勢(shì)日益明顯,這種治療方式也逐漸應(yīng)用到口腔領(lǐng)域[7-8]。近年來,很多的研究表明,益生菌在保持口腔健康、預(yù)防口腔疾病等方面都起到了重要作用[9]。益生菌能夠在一定程度上抑制致齲菌的活性,尤其可減少變異鏈球菌的數(shù)量,大大減小了齲病的發(fā)生率[10]。此外,口腔中的乳桿菌還能夠抑制牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)等導(dǎo)致牙周炎的致病菌和中間普雷沃菌(Prevotella intermedia)的生長(zhǎng)[11]。所以,利用益生菌的抑菌特性來抑制口腔中有害菌,減少齲齒等口腔疾病的發(fā)生,同時(shí)不破壞口腔微生物平衡,是一種很好的預(yù)防和治療方法。

    本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌菌株中篩選出對(duì)口腔變異鏈球菌具有抑制作用的優(yōu)良菌株,并研究了乳酸菌對(duì)變異鏈球菌菌膜形成和黏附性的抑制作用,為進(jìn)一步利用乳酸菌的益生特性來預(yù)防與改善齲齒等口腔疾病提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    1.1.1菌種

    乳酸菌共96株,由北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室保藏,其中植物乳桿菌K25由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供??谇恢虏【儺愭溓蚓?.3771、1.2500、1.2499購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏所;變異鏈球菌10438購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

    1.1.2試劑與培養(yǎng)基

    甲醇、冰醋酸、結(jié)晶紫、乳酸、乙酸 北京化工廠;胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶 美國(guó)Sigma公司。

    MRS液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、蛋白胨10.00 g、牛肉膏10.00 g、酵母浸粉5.00 g、無水乙酸鈉5.00 g、檸檬酸鈉5.00 g、磷酸氫二鈉2.00 g、吐溫-80 1 mL、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸錳0.05 g,加水至1 000 mL,1 mol/L乙酸調(diào)至pH 6.6。121 ℃、102 kPa條件下滅菌15 min。

    BHI液體培養(yǎng)基:心提取物5.0 g、腦提取物12.5 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、NaCl 5.0 g、Na2HPO42.5 g、瓊脂15.0 g,蒸餾水定容至1.0 L,pH 7.4。121 ℃、102 kPa條件下滅菌15 min。

    1.2儀器與設(shè)備

    MLS-3750高壓蒸汽滅菌器 日本三洋公司;CR21GⅢ立式高速冷凍離心機(jī)、U-3900紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司;數(shù)顯pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;ELx800酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad儀器有限公司。

    1.3方法

    1.3.1抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)的乳酸菌篩選

    采用牛津杯法篩選出可以抑制變異鏈球菌的乳酸菌,具體操作參考Bosch等[12]的實(shí)驗(yàn)方法。將1.5 g/100 mL的BHI瓊脂培養(yǎng)基倒入平板中,待凝固后分別取20 μL變異鏈球菌10438、1.2499、1.3771、1.2500菌液涂布于平板上,然后將牛津杯固定在平板上,取100 μL提前活化好的乳酸菌的上清液加入到牛津杯中,將平板放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。測(cè)量抑菌圈的直徑,最終抑菌圈的大小可以反映菌株對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)抑制作用的強(qiáng)弱[13-14]。抑菌效果按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定:無抑菌圈,代表無抑制作用(-);抑菌圈直徑0~3 mm,代表抑菌效果弱(+);抑菌圈直徑3~6 mm,代表抑菌效果良好(++);抑菌圈直徑>6 mm,代表抑菌效果強(qiáng)(+++)[10]。

    1.3.2植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)過程的影響

    將篩選到的植物乳桿菌菌株按體積分?jǐn)?shù)3%接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)16 h后10 000r/min離心 15 min得上清液,分別測(cè)定不同植物乳桿菌培養(yǎng)上清液對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響。每株變異鏈球菌按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種于5 mL BHI液體培養(yǎng)基中,分別添加5 mL植物乳桿菌培養(yǎng)上清液,37 ℃培養(yǎng)48 h,每4 h取出一定量培養(yǎng)液,在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度(OD)值。每組設(shè)置3 個(gè)平行,繪制變異鏈球菌的生長(zhǎng)曲線。以不添加植物乳桿菌上清液的變異鏈球菌的生長(zhǎng)曲線為對(duì)照。

    1.3.3植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度的測(cè)定

    用紫外分光光度計(jì)將篩選出的抑菌效果較好的植物乳桿菌菌株的上清液,調(diào)整到1.00×108CFU/mL,分別稀釋至菌液濃度5.00×107、2.50×107、1.25×107、6.25×106、3.12×106CFU /mL,分別對(duì)變異鏈球菌做抑菌實(shí)驗(yàn),方法見1.3.1節(jié)牛津杯法。最小抑菌濃度以有抑菌圈的最小濃度為準(zhǔn)。

    1.3.4植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌菌膜形成的抑制作用

    利用BHI液體培養(yǎng)基將活化好的變異鏈球菌的菌液濃度調(diào)整到1.0×108CFU/mL,將植物乳桿菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1活化后, 5 000 r/min離心5 min,用濾膜(0.22 μm)過濾,得到上清液,取100 μL菌液與100 μL上清液混合均勻,加入到96 孔微量板中,以只添加MRS液體培養(yǎng)基的孔為陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h后,棄掉孔中培養(yǎng)液,加入200 μL PBS,將每孔清洗3 次,清洗時(shí)需不斷強(qiáng)烈振動(dòng)以除去未黏附的細(xì)菌。棄掉PBS,每孔加入200 μL 95%甲醇,固定15 min,棄掉甲醇后,置于室溫下自然干燥。再在每孔加入200 μL 2%的結(jié)晶紫,革蘭氏染色5 min,用去離子水沖洗,去掉多余的染料,室溫條件下自然干燥。每孔再加入160 μL 體積分?jǐn)?shù)33%的冰醋酸,重新將黏附在細(xì)菌上的染料溶解下來。從每孔取125 μL可溶性染料轉(zhuǎn)移到新的96 孔板中,在630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值[15]。菌膜抑制率計(jì)算見公式(1)。

    1.3.5植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌黏附性的影響

    參照文獻(xiàn)[16]中的方法進(jìn)行細(xì)菌的黏附性實(shí)驗(yàn)。將試管與水平面呈30° 角放置并固定,每組設(shè)3 個(gè)平行管,每個(gè)試管分別加3 mL植物乳桿菌上清液和3 mL變異鏈球菌菌懸液,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。取出試管,分別收集試管中緊密黏附、松散黏附和非黏附于試管壁的細(xì)菌,收集方法參考周智等[17]的方法。以只添加MRS培養(yǎng)基的孔為對(duì)照。將收集好的菌懸液分別加入96 孔微量板中,每孔加200 μL,用PBS調(diào)零,用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔630 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按公式(2)計(jì)算細(xì)菌黏附率,其中緊密黏附菌懸液的吸光度記為A緊,非黏附和松散黏附菌懸液的吸光度記為A非+松。

    1.3.6植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌抑菌機(jī)理的分析

    1.3.6.1乳酸對(duì)變異鏈球菌的影響

    用乳酸溶液調(diào)MRS液體培養(yǎng)基直至與植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液相同的pH值(pH 4.04),釆用牛津杯法分別做植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液和乳酸培養(yǎng)液對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.2500的抑菌實(shí)驗(yàn),靜置24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)組為用乳酸調(diào)節(jié)的上清液,對(duì)照組為植物乳桿菌K25培養(yǎng)物上清液。

    1.3.6.2過氧化氫酶對(duì)變異鏈球菌的影響

    在植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液中分別加入適量過氧化氫酶,使過氧化氫酶的最終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,于28 ℃恒溫水浴2 h 后取出,靜置24 h后用牛津杯法測(cè)定過氧化氫酶對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.2500抑菌圈的大小,對(duì)照組為不加過氧化氫酶的植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液。

    1.3.6.3蛋白酶對(duì)變異鏈球菌的影響

    在植物乳桿菌K25的培養(yǎng)上清液中加入一定量胃蛋白酶和胰蛋白酶,使蛋白酶最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL,于28 ℃恒溫水浴2 h后取出,靜置24 h后牛津杯法測(cè)定對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.2500的抑菌圈大小,對(duì)照組為未經(jīng)蛋白酶處理的植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液。

    1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,Turkey檢驗(yàn)方法用于比較各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異的顯著性。P>0.05表示差異不著性,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1對(duì)變異鏈球菌具有抑制作用的乳酸菌的篩選

    從實(shí)驗(yàn)室保藏的96 株乳酸菌中篩選到對(duì)變異鏈球菌具有一定抑制作用的7 株植物乳桿菌。由表1可知,不同的植物乳桿菌對(duì)4 株變異鏈球菌的抑菌活性不同,其中菌株K25對(duì)4 株變異鏈球菌都有明顯的抑菌活性,且對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.3771、10438 這3 株變異鏈球菌的抑菌圈都達(dá)到了13.00 mm以上,抑菌圈最大可達(dá)16.30 mm,因此表明植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果比較好。另外4 株植物乳桿菌SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1也具有較明顯的抑菌效果,抑菌圈最大也可達(dá)到12.50 mm。植物乳桿菌QH25-1和QH35-3-2對(duì)變異鏈球菌抑制作用相對(duì)較弱。

    表1 7 株植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果Table1 Inhibitory effect of seven L. plantarum strains on Streptococcus mutans

    2.2植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響

    植物乳桿菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1對(duì)變異鏈球菌1.2499、1.2500、1.3771、10438生長(zhǎng)過程的影響如圖1所示。在變異鏈球菌培養(yǎng)過程中添加上述植物乳桿菌培養(yǎng)上清液,可使4 株變異鏈球菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制,其培養(yǎng)基OD值均低于對(duì)照組的OD值。由圖1還可知,添加上述植物乳桿菌培養(yǎng)上清液,可不同程度地延緩變異鏈球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,從而使變異鏈球菌的增殖速率減慢;不同的植物乳桿菌菌株對(duì)同一株變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響不同,同一株植物乳桿菌對(duì)不同的變異鏈球菌菌株生長(zhǎng)的影響也不同。同時(shí),添加植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液,使4 株變異鏈球菌的生長(zhǎng)曲線均處于最低水平,說明植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌的抑制活性最強(qiáng),與上述基于牛津杯固體培養(yǎng)基抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

    圖1 植物乳桿菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1對(duì)變異鏈球菌1.2499(A)、1.2500(B)、1.3771(C)、10438(D)生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum K25, SKT109, YW3-2,YW5-1, YW1-1 on the growth of Streptococcus mutans 1.2499 (A),1.2500 (B), 1.3771 (C) and 10438 (D)

    2.3植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度

    植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度可以在某種程度上反映變異鏈球菌對(duì)植物乳桿菌的敏感性,同時(shí)也反映植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果;抑菌濃度越低,說明變異鏈球菌對(duì)植物乳桿菌越敏感,植物乳桿菌的抑菌作用越強(qiáng)[18-19]。由圖2可知,植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌1.2499的最小抑菌濃度為1.25×107CFU/mL,對(duì)1.3771、1.2500和10438菌株的最小抑菌濃度為2.5×107CFU/mL。而植物乳桿菌SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1對(duì)4 株變異鏈球菌的最小抑菌濃度相對(duì)較高,在5.0×107~1.0×108CFU/mL之間。5 株植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌1.2499和1.2500的最小抑菌濃度為1.25×107CFU/mL和2.5×107CFU/mL,低于對(duì)其他2 株變異鏈球菌的最小抑菌濃度,表明此2 株變異鏈球菌對(duì)本實(shí)驗(yàn)的植物乳桿菌的抑制作用更敏感。

    圖2 植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度Fig.2 Minimum inhibitory concentration of Lactobacillus plantarum against Streptococcus mutans

    2.4植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌菌膜形成的抑制作用

    圖3 植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌菌膜形成的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum on the biofilm formation of Streptococcus mutans

    由圖3可知,5 株植物乳桿菌對(duì)4 株變異鏈球菌的菌膜形成具有不同程度的抑制作用,但都對(duì)變異鏈球菌1.2499具有最高的抑制率,達(dá)到60%以上,其次是變異鏈球菌1.2500,抑制率略高于40%,說明這2 株變異鏈球菌對(duì)植物乳桿菌比較敏感。對(duì)于變異鏈球菌1.3771和10438,植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌1.3771的抑制活性較明顯(抑制率為51.1%),而其他4 株植物乳桿菌對(duì)菌株1.3771和10438菌膜形成的抑制率較低。此外,植物乳桿菌K25對(duì)變異鏈球菌1.2500和10438的菌膜形成抑制率也略高于其他4 株菌。菌膜的形成能提高致病菌對(duì)抗生素的抗性,繼而可能誘導(dǎo)感染疾?。?5]。因此,本研究篩選的5 株植物乳桿菌對(duì)于通過抑制變異鏈球菌的菌膜形成,降低口腔齲齒病的發(fā)生幾率具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

    2.5植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌黏附性的影響

    5 株植物乳桿菌對(duì)4 株變異鏈球菌在光滑面上的黏附性的影響如圖4所示,對(duì)于同一株變異鏈球菌,加入不同的植物乳桿菌培養(yǎng)上清液之后,其黏附率不同。而同一株植物乳桿菌對(duì)不同的變異鏈球菌的黏附率的影響也不同。但對(duì)于4株變異鏈球菌在添加了所有的植物乳桿菌培養(yǎng)上清液之后都比未添加時(shí)的黏附率低,說明5 株植物乳桿菌都降低了4 株變異鏈球菌的在光滑面上的黏附率。對(duì)于變異鏈球菌1.2499,對(duì)照組的黏附率為47.46%,在添加植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液后,其黏附率下降為24.6%,比其他4 株植物乳桿菌對(duì)其抑制率要低,說明菌株K25對(duì)變異鏈球菌1.2499黏附的抑制效果最好。同樣,對(duì)于其他3 株變異鏈球菌,在添加了菌株K25之后,其黏附率也低于其他4 株植物乳桿菌的黏附率,分別為15.64%、8.36%和7.02%,所以,植物乳桿菌K25對(duì)4 株變異鏈球菌黏附的抑制作用都強(qiáng)于其他4 株植物乳桿菌。據(jù)報(bào)道,口腔變異鏈球菌必須首先附著于人體牙齒表面,才能造成對(duì)人體牙齒的危害,導(dǎo)致齲病的發(fā)生[20]。因此,本實(shí)驗(yàn)篩選獲得的植物乳桿菌,尤其是菌株K25,對(duì)于降低變異鏈球菌在牙齒表明的黏附,防止齲病具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

    圖4 植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌黏附性的影響Fig.4 Effect of L. plantarum on the adhesion ability of Streptococcus mutans

    2.6植物乳桿菌對(duì)變異鏈球菌抑菌機(jī)理的分析

    以對(duì)變異鏈球菌具有明顯抑制活性的植物乳桿菌K25為例,對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行分析。

    2.6.1乳酸對(duì)變異鏈球菌的影響

    由表2可知,菌株K25培養(yǎng)上清液對(duì)變異鏈球菌1.2499和1.2500的抑制作用略高于對(duì)照組樣品,但二者差異不顯著(P>0.05)。因此,植物乳桿菌K25的抑菌作用與其產(chǎn)生的乳酸有關(guān),同時(shí)還存在其他的抑菌因素。

    表2 植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液(或培養(yǎng)基)的不同處理方式對(duì)變異鏈球菌的抑制作用Table2 Effect of different treatments for medium and culture supernatant of L. plantarum on its inhibition against Streptococcus mutans

    2.6.2過氧化氫酶對(duì)變異鏈球菌的影響

    比較添加和不添加(對(duì)照組)過氧化氫酶的植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液對(duì)變異鏈球菌1.2499和1.2500的抑制作用(表2)可知,對(duì)照組的抑菌圈直徑分別為(15.50±0.93)mm和(14.76±1.06)mm,而實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈直徑分別為(12.65±0.78)mm和(12.15±0.83)mm,對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的抑菌圈大小有顯著性差異(P<0.05)。因此可以推測(cè),過氧化氫對(duì)菌株K25的抑菌作用起到了重要的貢獻(xiàn)。

    2.6.3蛋白酶對(duì)變異鏈球菌的影響

    比較添加和不添加(對(duì)照組)蛋白酶的植物乳桿菌K25培養(yǎng)上清液對(duì)2株變異鏈球菌的抑菌作用(表2)。結(jié)果表明,對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組抑菌圈直徑無顯著差異(P>0.05)??梢酝茰y(cè),菌株K25沒有產(chǎn)生對(duì)變異鏈球菌具有明顯抑制作用的蛋白質(zhì)類細(xì)菌素。

    3 討 論

    近年來,有關(guān)益生菌對(duì)人體健康的有益作用及在疾病預(yù)防方面的研究應(yīng)用越來越多[21]。有研究者發(fā)現(xiàn),人體口腔中的益生菌可以抑制口腔致病菌的黏附和定殖,對(duì)于保持口腔微生態(tài)的平衡及齲齒等口腔疾病的預(yù)防具有重要作用[22-24]。目前報(bào)道的益生菌主要包括乳桿菌和雙歧桿菌兩大類[9]。本研究篩選到7 株對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)、黏附和菌膜形成具有明顯抑制作用的植物乳桿菌,尤其是菌株K25曾被報(bào)道具有良好的益生特性[25],其在口腔疾病預(yù)防方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

    變異鏈球菌具有較強(qiáng)的耐酸能力,通常乳酸菌對(duì)變異鏈球菌的抑制作用弱于對(duì)其他常見口腔致病菌的抑制,表現(xiàn)為前者具有更小的抑菌圈[11,26]。由于變異鏈球菌具有較強(qiáng)的菌體聚集能力,因此,在采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)將變異鏈球菌均勻涂布于固體培養(yǎng)基上,以便獲得邊緣清晰的抑菌圈。據(jù)報(bào)道,乳酸菌對(duì)變異鏈球菌的抑制作用與其在生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的各種初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物,如乳酸、過氧化氫和一些細(xì)菌素等密切相關(guān)[27]。本研究的抑菌實(shí)驗(yàn)表明,植物乳桿菌K25的抑菌作用主要?dú)w因于其代謝過程中產(chǎn)生的乳酸和過氧化氫。

    變異鏈球菌作為齲齒的主要病原細(xì)菌,它能使糖轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)雜的多糖類,產(chǎn)生黏稠性多糖物質(zhì)附著于牙齒表面從而形成牙斑,并有利于變異鏈球菌黏附定殖到牙面上發(fā)揮其致病作用[28]。本研究的黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,植物乳桿菌能有效地降低變異鏈球菌1.2499、1.2500等致病菌的黏附率,可以阻斷變異鏈球菌黏附到牙齒表面的過程,進(jìn)而減少牙斑的生成。

    變異鏈球菌黏附于口腔牙面之后會(huì)產(chǎn)生菌膜,生成的菌膜又進(jìn)一步促進(jìn)其在牙面上的黏附,菌膜還起到保護(hù)菌體不被酸、堿、抗生素等殺死的作用。本研究的菌膜抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,植物乳桿菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1都可以抑制變異鏈球菌菌膜的形成,從而減少變異鏈球菌在牙齒上的定殖黏附,使變異鏈球菌更容易被口腔或者人體中的抑菌和殺菌物質(zhì)抑制或直接將其殺死,減少齲病的發(fā)生,保護(hù)口腔健康。

    [1] DEWITTE S N, BEKVALAC J. Oral health and frailty in the medieval English cemetery of St Mary Graces[J]. American Journal of Physical Anthropology, 2010, 142(3): 341-354. DOI:10.1002/ajpa.21228.

    [2] BANAS J A. Virulence properties of Streptococcus mutans[J]. Frontiers in Bioscience, 2004, 9: 1267-1277. DOI:10.2741/1305.

    [3] SELA M N, STEINBERG D, SEGAL R. Inhibition of the activity of glucosyltransferase from Streptococcus mutans by glycyrrhizin[J]. Oral Microbiology and Immunology, 1987, 2(3): 125-128. DOI:10.1111/ j.1399-302X.1987.tb00275.x.

    [4] 楊隆強(qiáng), 周喬, 劉敏川. 變異鏈球菌黏附機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 38(2): 229-233. DOI:10.3969/ j.issn.1673-5749.2011.02.028.

    [5] 馬旭東, 楊景云. 口腔微生態(tài)失衡導(dǎo)致口腔異味的研究[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2008, 20(5): 480-482. DOI:10.3969/j.issn.1005-376X.2008.05.020.

    [6] TAHMOURESPOUR A. Probiotics and the reduction of dental caries risk[M]//LI Mingyu. Contemporary Approach to Dental Caries. Rijeka: InTech, 2012: 271-288.

    [7] VRESE M D, SCHREZENMEIR J. Probiotics, prebiotics and synbiotics[J]. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,2008, 111: 1-66. DOI:10.1007/10_2008_097.

    [8] MEURMAN J H. Probiotics: do they have a role in oral medicine and dentistry?[J]. European Journal of Oral Sciences, 2005, 113(3): 188-196. DOI:10.1111/j.1600-0722.2005.00191.x.

    [9] 王勝朝, 許浩坤. 口腔益生菌防齲作用與應(yīng)用[J]. 中國(guó)實(shí)用口腔科雜志, 2012, 5(10): 587-591.

    [10] ?AGLAR E, CILDIR S K, ERGENELI S, et al. Salivary mutans streptococci and lactobacilli levels after ingestion of the probiotic bacterium Lactobacillus reuteri ATCC 55730 by straws or tablets[J]. Acta Odontologica Scandinavica, 2006, 64(5): 314-318. DOI:10.1080/00016350600801709.

    [11] K?LL-KLAIS P, M?NDAR R, LEIBUR E, et al. Oral lactobacilli in chronic periodontitis and periodontal health: species composition and antimicrobial activity[J]. Oral Microbiology and Immunology, 2005,20(6): 354-361. DOI:10.1111/j.1399-302X.2005.00239.x.

    [12] BOSCH M, NART J, AUDIVERT S, et al. Isolation and characterization of probiotic strains for improving oral health[J]. Archives of Oral Biology, 2012, 57(5): 539-549. DOI:10.1016/ j.archoralbio.2011.10.006.

    [13] KOO O K, EGGLETON M, O’BRYAN C A, et al. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against Listeria monocytogenes on frankfurters formulated with and without lactate/diacetate[J]. Meat Science, 2012, 92(4): 533-537. DOI:10.1016/j.meatsci.2012.05.023.

    [14] TAGG J R, MCGIVEN A R. Assay system for bacteriocins[J]. Applied Microbiology, 1971, 21(5): 943.

    [15] LI Wei, JI Juan, RUI Xin, et al. Production of exopolysaccharides by Lactobacillus helveticus MB2-1 and its functional characteristics in vitro[J]. LWT-Food Science and Technology, 2014, 59(2): 732-739. DOI:10.1016/j.lwt.2014.06.063.

    [16] 黃萍, 萬呼春, 田婷玉, 等. 甘草水煎劑對(duì)變異鏈球菌黏附影響的體外實(shí)驗(yàn)[J]. 國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 40(3): 285-287. DOI:10.7518/ gjkq.2013.03.002.

    [17] 周智, 陳惠珍, 范旭, 等. 殼寡聚糖對(duì)變形鏈球菌黏附的影響[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志, 2005, 15(7): 376-378. DOI:10.3969/ j.issn.1005-2593.2005.07.005.

    [18] 鄧霜, 姜新宇, 周日寶, 等. 炎寧膠囊的體外抑菌試驗(yàn)研究[J]. 湖南中醫(yī)雜志, 2015, 31(8): 159-160.

    [19] 李耘, 呂媛, 劉健, 等. 頭孢卡品體外抗菌作用研究[J].中國(guó)抗生素雜志, 2013, 38(2): 135-145. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2013.02.011.[20] 王露霏, 陸峻君. 益生菌產(chǎn)品種類及其對(duì)口腔生態(tài)的影響[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2010, 22(3): 250-254. DOI:10.13381/j.cnki. cjm.2010.03.028.

    [21] 劉虹, 翦祎, 張化朋, 等. 口腔益生菌在口腔疾病防治上的研究及應(yīng)用[J]. 藥學(xué)研究, 2015, 34(6): 357-360. DOI:10.13506/j.cnki. jpr.2015.06.015.

    [22] MADHWANI T, MCBAIN A J. Bacteriological effects of a Lactobacillus reuteri probiotic on in vitro oral biofilms[J]. Archives of Oral Biology, 2011, 56(11): 1264-1273. DOI:10.1016/ j.archoralbio.2011.04.004.

    [23] SHIMAZAKI Y, SHIROTA T, UCHIDA K, et al. Intake of dairy products and periodontal disease: the Hisayama study[J]. Journal of Periodontology, 2008, 79(1): 131-137. DOI:10.1902/jop.2008.070202.

    [24] 王丹, 馬國(guó)武. 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)于固定矯治患者牙周指數(shù)和齦下菌群的敏感性研究[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2008, 20(2): 166-168. DOI:10.3969/j.issn.1005-376X.2008.02.024.

    [25] 李常營(yíng). 植物乳桿菌K25的益生特性及在干酪中的應(yīng)用研究[D]. 長(zhǎng)春: 長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué), 2011: 5-9.

    [26] 彭悅, 孟祥晨, 朱德全, 等. 對(duì)口腔變異鏈球菌具有抑制作用的乳桿菌的篩選[J]. 食品科技, 2014, 39(7): 6-10. DOI:10.13684/j.cnki. spkj.2014.07.002.

    [27] VUOTTO C, LONGO F, DONELLI G. Probiotics to counteract biofilm-associated infections: promising and conflicting data[J]. International Journal of Oral Science, 2014, 6(4): 189-194. DOI:10.1038/ijos.2014.52.

    [28] 姚軍, 張佳麗. 赤蘚糖醇對(duì)變異鏈球菌作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 30(1): 22-24. DOI:10.3969/ j.issn.1000-1182.2012.01.005.

    Screening of Lactic Acid Bacteria for Inhibiting Oral Streptococcus mutans and Preliminary Study of Antibacterial Mechanism

    GUO Xialei, ZHANG Jian, YANG Zhennai*
    (Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

    Considering that lactic acid bacteria (LAB) that can inhibit harmful bacteria, LAB strains stored in our laboratory were screened for inhibiting oral Streptococcus mutans. The screened strains were measured for minimum inhibitory concentration (MIC) and inhibitory effect on biofilm formation adhesion properties of S. mutans, and the underlying mechanism was preliminarily studied as well. The results showed that 5 Lactobacillus plantarum strains including K25,SKT109, YW3-2, YW5-1 and YW1-1 exhibited clear inhibition against S. mutans. Among 4 indicator S. mutans strains,1.2499 and 1.2500 were more sensitive to L. plantarum. L. plantarum K25 showed stronger inhibition than 4 other strains against S. mutans. The MIC value (1.25 × 107-2.50 × 107CFU/mL) of strain K25 was the lowest, the inhibition rate on biofi lm formation of S. mutans was signifi cantly higher, and the inhibitory effect on the adhesion ability of S. mutans was clear. Preliminary studies on the antibacterial mechanism of L. plantarum K25 indicated that lactic acid and hydrogen peroxide produced by the strain played major roles in this activity.

    Streptococcus mutans; probiotic; Lactobacillus plantarum; inhibitory activity

    10.7506/spkx1002-6630-201619020

    TS201.3

    A

    1002-6630(2016)19-0117-06

    郭夏蕾, 張健, 楊貞耐. 抑制口腔變異鏈球菌的乳酸菌篩選及其抑菌機(jī)理[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(19): 117-122. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619020. http://www.spkx.net.cn

    GUO Xialei, ZHANG Jian, YANG Zhennai. Screening of lactic acid bacteria for inhibiting oral Streptococcus mutans and preliminary study of antibacterial mechanism[J]. Food Science, 2016, 37(19): 117-122. (in Chinese with English abstract)

    DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619020. http://www.spkx.net.cn

    2015-12-15

    國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31571857)

    郭夏蕾(1991—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。E-mail:610850207@qq.com

    楊貞耐(1965—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)及加工技術(shù)。E-mail:yangzhennai@th.btbu.edu.cn

    猜你喜歡
    菌膜鏈球菌乳酸菌
    活性氧與蠟樣芽孢桿菌菌膜形成的相關(guān)性
    禽用乳酸菌SR1的分離鑒定
    鏈球菌感染與銀屑病相關(guān)性探究
    食品環(huán)境中單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成、轉(zhuǎn)移及防控措施研究進(jìn)展
    四種不同接觸表面蠟樣芽孢桿菌菌膜形成的影響
    肺炎鏈球菌表面蛋白A的制備與鑒定
    乳酸菌成乳品市場(chǎng)新寵 年增速近40%
    乳飲品中耐胃酸乳酸菌的分離鑒定與篩選
    假性動(dòng)脈瘤患者感染厭氧消化鏈球菌的鑒定
    產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及誘變育種
    三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成年免费大片在线观看| 国产成人欧美在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 特级一级黄色大片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产成人福利小说| av视频在线观看入口| 亚洲人成电影免费在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 老汉色∧v一级毛片| av欧美777| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一进一出抽搐动态| 免费在线观看日本一区| 国产精品综合久久久久久久免费| 男女床上黄色一级片免费看| 久久午夜亚洲精品久久| 一级毛片女人18水好多| 全区人妻精品视频| 草草在线视频免费看| 日日干狠狠操夜夜爽| 一级作爱视频免费观看| 免费看十八禁软件| 日本黄色视频三级网站网址| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久热在线av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 午夜免费成人在线视频| 欧美三级亚洲精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美日本视频| 亚洲午夜理论影院| 亚洲av成人精品一区久久| svipshipincom国产片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 九九在线视频观看精品| 欧美日韩综合久久久久久 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品免费久久久久久久清纯| 91av网站免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品野战在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 香蕉丝袜av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩欧美在线乱码| 午夜福利18| 亚洲av免费在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 日本黄色片子视频| xxx96com| 久久久久久人人人人人| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 操出白浆在线播放| 欧美日韩国产亚洲二区| 99re在线观看精品视频| 日本 欧美在线| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩精品中文字幕看吧| 五月伊人婷婷丁香| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美黄色淫秽网站| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 少妇的丰满在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美日韩乱码在线| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品亚洲一级av第二区| АⅤ资源中文在线天堂| 操出白浆在线播放| 一区二区三区国产精品乱码| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品久久久久久久末码| 国内精品久久久久精免费| 精品国产亚洲在线| 亚洲国产欧美人成| 久久久国产成人精品二区| 老司机深夜福利视频在线观看| 在线视频色国产色| 久久亚洲真实| 99精品在免费线老司机午夜| 男女午夜视频在线观看| 免费搜索国产男女视频| 两个人看的免费小视频| 日韩精品青青久久久久久| 色综合站精品国产| 免费看日本二区| 日本熟妇午夜| 国产91精品成人一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲在线自拍视频| 亚洲美女黄片视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品电影一区二区三区| 日韩免费av在线播放| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 99热6这里只有精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久天堂一区二区三区四区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中文字幕久久专区| 久久人人精品亚洲av| 黄频高清免费视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲人与动物交配视频| 中文资源天堂在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| www.www免费av| 最近最新中文字幕大全电影3| 人妻夜夜爽99麻豆av| 天堂√8在线中文| 女警被强在线播放| 99国产精品一区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 我要搜黄色片| 偷拍熟女少妇极品色| 9191精品国产免费久久| 成年版毛片免费区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久精品影院6| 国产精品 国内视频| 精品无人区乱码1区二区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 精华霜和精华液先用哪个| 中文字幕熟女人妻在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 男女床上黄色一级片免费看| 宅男免费午夜| 我要搜黄色片| 久久久久久久精品吃奶| 又大又爽又粗| 精品日产1卡2卡| 国产激情偷乱视频一区二区| 麻豆成人av在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 十八禁人妻一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品98久久久久久宅男小说| 99视频精品全部免费 在线 | 中文亚洲av片在线观看爽| 两人在一起打扑克的视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 中文亚洲av片在线观看爽| 深夜精品福利| 午夜精品在线福利| 欧美中文日本在线观看视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产高潮美女av| 国产精品一及| 国产亚洲av嫩草精品影院| 黑人欧美特级aaaaaa片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品av视频在线免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久香蕉国产精品| 一本一本综合久久| 99久国产av精品| 国产激情欧美一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 成人特级av手机在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品永久免费网站| 欧美日韩黄片免| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| av片东京热男人的天堂| 99国产精品99久久久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av在线天堂中文字幕| 日韩av在线大香蕉| 久久久久久久午夜电影| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | xxx96com| 麻豆成人av在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲av免费在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美3d第一页| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 一级毛片高清免费大全| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 五月玫瑰六月丁香| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久香蕉精品热| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日本三级黄在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 国产高清视频在线播放一区| av欧美777| 最近最新中文字幕大全免费视频| 色视频www国产| 日韩精品中文字幕看吧| 日本黄大片高清| 香蕉av资源在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 三级毛片av免费| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产亚洲av高清不卡| 一区福利在线观看| а√天堂www在线а√下载| 精品欧美国产一区二区三| 最新美女视频免费是黄的| 国产成+人综合+亚洲专区| 熟女电影av网| 九九热线精品视视频播放| 无人区码免费观看不卡| 国产久久久一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 深夜精品福利| 一级作爱视频免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 黄色日韩在线| 国产一区在线观看成人免费| 在线免费观看的www视频| 久久精品91无色码中文字幕| 国产单亲对白刺激| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| av天堂在线播放| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 午夜免费成人在线视频| 91av网站免费观看| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲18禁久久av| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 最新美女视频免费是黄的| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产不卡一卡二| 国产成人影院久久av| 级片在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 美女黄网站色视频| 欧美乱妇无乱码| 香蕉久久夜色| 国产高清激情床上av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品久久久久久成人av| 黄色日韩在线| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲片人在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 国内精品美女久久久久久| 色吧在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 天堂网av新在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | www日本黄色视频网| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人性生交大片免费视频hd| 级片在线观看| 不卡一级毛片| 日韩三级视频一区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| xxxwww97欧美| 国产熟女xx| 国产高清激情床上av| 欧美zozozo另类| 亚洲男人的天堂狠狠| 不卡av一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 淫秽高清视频在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 免费观看精品视频网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产精品999在线| 亚洲国产精品成人综合色| 成人三级做爰电影| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产91精品成人一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 日本在线视频免费播放| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| av欧美777| 欧美在线一区亚洲| 黑人欧美特级aaaaaa片| 男人舔奶头视频| 亚洲av熟女| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲专区中文字幕在线| 日本免费a在线| 99久国产av精品| 久久国产精品影院| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 午夜激情福利司机影院| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜免费观看网址| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 2021天堂中文幕一二区在线观| cao死你这个sao货| 两个人看的免费小视频| 久久精品人妻少妇| 国产成人精品无人区| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品免费一区二区三区在线| 免费搜索国产男女视频| 亚洲avbb在线观看| 小说图片视频综合网站| 精华霜和精华液先用哪个| 国产成人精品无人区| 高清在线国产一区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美色视频一区免费| 制服人妻中文乱码| 国产亚洲av高清不卡| 九九热线精品视视频播放| 99久久综合精品五月天人人| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产单亲对白刺激| 熟女电影av网| 最近视频中文字幕2019在线8| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美日韩乱码在线| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲国产精品999在线| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品美女久久av网站| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费看日本二区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲黑人精品在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 麻豆成人午夜福利视频| 波多野结衣巨乳人妻| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲天堂国产精品一区在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一个人免费在线观看的高清视频| 色av中文字幕| 国产爱豆传媒在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜福利视频1000在线观看| 久久精品国产综合久久久| 丰满的人妻完整版| 香蕉国产在线看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美又色又爽又黄视频| 黄色视频,在线免费观看| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲真实伦在线观看| 国产成人影院久久av| 精品福利观看| 香蕉久久夜色| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品一区二区免费欧美| 久久亚洲精品不卡| 国产成人av教育| 免费av不卡在线播放| 综合色av麻豆| 91老司机精品| 色吧在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 一个人看的www免费观看视频| 久久久久久久久久黄片| 成年免费大片在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美在线一区亚洲| 可以在线观看毛片的网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产成人福利小说| 老司机午夜十八禁免费视频| 一个人看的www免费观看视频| 国产成人福利小说| 午夜成年电影在线免费观看| 我的老师免费观看完整版| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久久久久久久免费视频了| 免费在线观看影片大全网站| 免费大片18禁| netflix在线观看网站| 国产一区二区在线av高清观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 搡老岳熟女国产| 成人av在线播放网站| 曰老女人黄片| 久久精品综合一区二区三区| 99热这里只有精品一区 | www日本黄色视频网| 免费观看的影片在线观看| 亚洲国产欧美网| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日本一二三区视频观看| 国产午夜精品论理片| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人性生交大片免费视频hd| 在线观看舔阴道视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 黄色丝袜av网址大全| 在线视频色国产色| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲国产精品合色在线| 国产成人精品无人区| 国产日本99.免费观看| 亚洲美女黄片视频| e午夜精品久久久久久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品 欧美亚洲| 日韩欧美三级三区| 国产1区2区3区精品| 露出奶头的视频| 国产午夜精品论理片| а√天堂www在线а√下载| 老司机在亚洲福利影院| 午夜精品在线福利| 亚洲 国产 在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久中文看片网| 久久久久久久久免费视频了| 90打野战视频偷拍视频| 日韩国内少妇激情av| 天天躁日日操中文字幕| 欧美日韩黄片免| 黄色片一级片一级黄色片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 免费看日本二区| 国产免费av片在线观看野外av| 制服人妻中文乱码| 19禁男女啪啪无遮挡网站| netflix在线观看网站| 国产成人精品久久二区二区91| 网址你懂的国产日韩在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久久人人人人人| 成年女人毛片免费观看观看9| 村上凉子中文字幕在线| 成年免费大片在线观看| 国产野战对白在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产成+人综合+亚洲专区| 长腿黑丝高跟| 亚洲一区高清亚洲精品| 一级黄色大片毛片| 男女午夜视频在线观看| 嫩草影院入口| 国产精品国产高清国产av| 久久精品综合一区二区三区| 观看免费一级毛片| 日本 av在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品一区av在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美色视频一区免费| 脱女人内裤的视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久中文看片网| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲精品色激情综合| 国内精品久久久久精免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久人妻av系列| 哪里可以看免费的av片| 看片在线看免费视频| 99在线人妻在线中文字幕| 99精品在免费线老司机午夜| 免费高清视频大片| 日本在线视频免费播放| 免费av毛片视频| 级片在线观看| 亚洲,欧美精品.| 久久久精品大字幕| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久热在线av| 色噜噜av男人的天堂激情| svipshipincom国产片| avwww免费| 国产精品 欧美亚洲| 日韩欧美三级三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人一区二区视频在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 韩国av一区二区三区四区| 免费大片18禁| 国产精品99久久久久久久久| 51午夜福利影视在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久久久大精品| 中文资源天堂在线| 不卡av一区二区三区| 我要搜黄色片| 国产欧美日韩精品一区二区| 88av欧美| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久久人人人人人| 国产成人aa在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美三级亚洲精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品久久久久久久电影 | 国产91精品成人一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜免费成人在线视频| 欧美一级毛片孕妇| 天堂动漫精品| 又黄又粗又硬又大视频| 免费观看的影片在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 白带黄色成豆腐渣| 美女 人体艺术 gogo| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 波多野结衣高清作品| 天天一区二区日本电影三级| 十八禁人妻一区二区| 午夜福利18| 久久久精品大字幕| 成人午夜高清在线视频| 18禁观看日本| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲无线在线观看| 欧美日韩精品网址| 午夜激情福利司机影院| 1024香蕉在线观看| 色综合婷婷激情| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲 国产 在线| av黄色大香蕉| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产一区二区三区视频了| 老司机福利观看| 久久久久久久午夜电影| 婷婷精品国产亚洲av| 可以在线观看的亚洲视频| 热99在线观看视频| 麻豆一二三区av精品| 久久久久国内视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲七黄色美女视频| 18禁观看日本| 一本精品99久久精品77| 久久中文字幕一级| 国产一区二区三区视频了| 亚洲avbb在线观看| 嫩草影院精品99| 亚洲精品在线美女| 91麻豆av在线| 国产三级黄色录像| 九九在线视频观看精品| 久久久国产成人精品二区| 变态另类丝袜制服| 在线a可以看的网站| 女人被狂操c到高潮| 黄片小视频在线播放| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲国产色片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 中文字幕久久专区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲美女视频黄频| 国产亚洲精品一区二区www| 久9热在线精品视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲成av人片在线播放无| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩欧美精品v在线| 国产精品野战在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产激情欧美一区二区| 精品久久久久久久末码| 欧美+亚洲+日韩+国产|