基于質譜檢測轉基因生物外源蛋白質的消化穩(wěn)定性

毛　劼，孫　興，程娟獻，王心正，趙永強，王紅霞，何　昆，夏　晴*

（中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物醫(yī)學分析中心，北京 100850）

基于質譜檢測轉基因生物外源蛋白質的消化穩(wěn)定性

毛劼，孫興，程娟獻，王心正，趙永強，王紅霞，何昆，夏晴*

（中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物醫(yī)學分析中心，北京 100850）

基于無標記定量質譜檢測技術建立了一種新的轉基因生物外源蛋白質消化穩(wěn)定性評價方法。以牛β-乳球蛋白、牛血清白蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑為標準蛋白質，經模擬人體胃/腸消化液消化后進行凝膠電泳分離，切取目標蛋白質條帶進行酶切，提取肽段進行納升液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜分析?；贛ascot數(shù)據庫檢索鑒定目標蛋白質。計算各消化時間點蛋白質匹配肽段數(shù)與消化前蛋白質匹配肽段數(shù)的比值，當比值≤0.50時判斷為目標蛋白質在該時間段內已消化。將此方法應用于轉基因抗蟲水稻“華恢1號”外源蛋白Cry1Ab/1Ac的消化穩(wěn)定性分析，結果顯示在模擬胃液中消化2 min時，比值下降到0.50以下，在模擬腸液中消化15 s后比值下降到0.50以下，表明該蛋白在胃/腸消化液中具有消化不穩(wěn)定性。

轉基因生物；消化穩(wěn)定性；質譜；外源蛋白Cry1Ab/1Ac；無標記定量

轉基因生物為全球創(chuàng)造了巨大的經濟價值和環(huán)境效益［1-2］的同時，其食用安全性也成為了人們關注的焦點［3-4］。根據美國國家環(huán)境保護局提供的評價標準清單，對于轉基因生物外源蛋白的食用安全性評價主要包括四方面：消化穩(wěn)定性實驗［5-7］、與已知的致敏原和毒蛋白進行氨基酸序列同源性的比對、熱穩(wěn)定性實驗［8］以及實驗動物的毒理實驗［9-10］。依據中華人民共和國國家標準（農業(yè)部869號公告-2-2007《轉基因生物及其產品食用安全檢測 模擬胃腸液外源蛋白質消化穩(wěn)定性試驗方法》）［11］，消化穩(wěn)定性實驗主要采用蛋白印跡法（Western blotting）。由于胃/腸液成分復雜，蛋白降解片段各異，難以預測，基于Western blotting技術的外源蛋白質及其降解片段的識別依賴于高特異性識別的抗體，而在很多情況下難以獲得高質量的特異性抗體，由于非特異性識別信號的干擾，難以獲得關于待測蛋白消化性的正確判斷結果。而隨著轉基因技術的迅速發(fā)展，越來越多的優(yōu)質外源基因被克隆和應用，亟待一種方便、快捷并且不依賴于特定抗體的通用技術，實現(xiàn)轉基因外源蛋白質的消化穩(wěn)定性評價。

質譜（mass spectrometry，MS）技術具有高分辨、高靈敏度及高通量等優(yōu)點，其中無標記定量的圖譜計數(shù)法無需復雜的數(shù)據處理步驟，概念簡單、運算速率快、假陽性率低并且靈敏度高，在復雜樣本的蛋白質鑒定和定量分析中得到越來越廣泛的應用［12-13］。由于圖譜計數(shù)法是一種半定量的方法，通過比較兩個數(shù)據點間匹配肽段的鑒定圖譜數(shù)的比值即可獲得其變化關系。當兩個數(shù)據點匹配肽段的鑒定圖譜數(shù)的比值在0.50～2.00之間時，認為數(shù)據點之間沒有變化；當比值≤0.50時，認為與前一個數(shù)據點相比降低；而當比值≥2.00時，則認為與前一個數(shù)據點相比增高［14］。

蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是天然存在于土壤中的革蘭氏陽性菌，其在芽孢形成過程中可產生具有殺蟲活性的結晶蛋白質，即Bt毒蛋白，Bt毒蛋白經昆蟲腸道水解成多肽后，與其腸道特異受體位點結合，破壞細胞膜滲透壓的平衡導致細胞裂解，從而達到殺死昆蟲的目的［15-16］。該蛋白質按氨基酸序列的同源性可分為45 大類，313 種。目前，抗蟲轉基因水稻采用的Bt蛋白基因有cry1Ab、cry1Ac、cry1Ab/1Ac融合基因等［17］。轉基因抗蟲水稻“華恢1號”外源Bt蛋白為我國自主合成的Cry1Ab/1Ac融合蛋白質，分子質量為68 277 D，其表達產物可以專一、高效地抑制二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲。對于轉基因水稻表達的外源蛋白質Cry1Ab/1Ac消化穩(wěn)定性的研究一直是人們關注的焦點，而傳統(tǒng)的Western blotting方法對抗體要求高，且極易受非特異性識別信號的干擾，對于蛋白質消化穩(wěn)定性不能提供準確的判斷，給轉基因作物外源蛋白質的食用安全性評價帶來了一定的困難。本研究采用高分辨、高靈敏度以及高通量的質譜檢測技術，基于無標記定量方法成功建立了一種更為準確的判斷蛋白質消化穩(wěn)定性的分析方法。該方法可成功應用于轉基因水稻以及其他轉基因生物及食品中外源蛋白質消化穩(wěn)定性的研究。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

基因工程表達純化Cry1Ab/1Ac蛋白質由中國農業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室提供；胃蛋白酶、胰酶購自美國Sigma公司，胃蛋白酶活力為3 200～4 500 U/mg pro；胰酶可滿足以下反應體系要求：40 ℃、5 min內，將其質量25 倍的淀粉轉化為水溶性的碳水化合物；40 ℃、60 min內（pH 7.5）消化掉其質量25 倍的酪蛋白；37 ℃（pH 9.0），每毫克胰酶每分鐘能夠從橄欖油中至少水解生成2 μmol脂肪酸。

牛β-乳球蛋白（bovine β-lactoglobulin，BLG）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、大豆胰蛋白酶抑制劑（soybean trypsin inhibitor，STI）、NaHCO3、KH2PO4美國Sigma公司；鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司；蛋白質分子質量標準 美國Thermo公司；二硫蘇糖醇 美國Promega公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴酚藍、過硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、甘氨酸、丙烯酰胺美國A-Pharmacia公司；質譜純乙腈、質譜純甲醇、質譜純水 美國Fisher Scientific公司；質譜純甲酸、碘乙酰胺 美國Acros公司。

1.2儀器與設備

AB Triple TOF 5600+質譜儀（配有電噴霧離子源、納升級液相色譜Expert Nano LC 425及Analyst 2.0數(shù)據處理系統(tǒng)） 美國AB公司；NESLAB gp100恒溫水浴箱美國Neslab公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1蛋白質樣本模擬胃/腸消化液消化

參照中華人民共和國國家標準（農業(yè)部869號公告-2-2007）［11］提供的配方配制模擬人體胃/腸消化液。在模擬胃/腸消化液添加的待測蛋白質，質量濃度分別為2、5 g/L，在37 ℃分別進行0、15 s及2、30、60 min的消化反應，同時設不加待測蛋白質的消化液（胃蛋白酶/胰酶）對照組和不加胃蛋白酶/胰酶的待測蛋白質對照組。

1.3.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及膠內酶切

將各處理組及對照組蛋白樣品進行電泳分離，根據分子質量切取蛋白條帶進行膠內酶切，提取肽段并干燥。

1.3.3質譜檢測

肽段提取樣本上樣后進行納升液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜（nano liquid chromatography-electronic spray ionmass spectrum/mass spectrum，Nano LC-ESI-MS/MS）分析，正離子檢測，源溫度150 ℃，霧化氣流速為6 L/min，氣簾氣流速為25 L/min，電噴霧針電壓為2 300 V。蛋白鑒定采用數(shù)據依賴采集模式，每個一級掃描后進行20 個MS/MS掃描。納升級液相色譜分離用富集柱和分析柱聯(lián)用方式。捕獲柱為Chrom XP C18（350 μm×0.5 mm，3 μm，120 ?），分析柱為3C18-CL-120（75 μm×150 mm，3 μm，120 ?）。流動相A為含0.1%甲酸的超純水，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈。進樣速率為7 μL/min，進樣時間3 min。分析柱流速為300 nL/min，總分析時間為60 min。流動相B在2～40 min內由5%線性升至40%，1 min內升至80%，保留5 min，再在1 min內回到5%，平衡13 min。每兩個樣品之間加一個自動校正樣品，以保證測定結果的準確度。

1.3.4質譜無標記定量測定

Mascot數(shù)據庫檢索設置如下條件：儀器類型為ESI-QUAD-TOF；檢索類型為MS/MS二級離子檢索；酶為胰蛋白酶；固定修飾為烷基化；可變修飾為乙?；?、去氨基化、氧化；分子質量為單同位素質量；肽段容差為2×10-5D；碎片容差為±0.2 D；允許最大的未被酶切位點數(shù)為2。通過Mascot數(shù)據庫檢索、定量所鑒定目標蛋白質的匹配肽段數(shù)，根據各消化時間點蛋白質匹配肽段數(shù)與消化前匹配肽段數(shù)的比值來判斷目標蛋白質的消化穩(wěn)定性。

2　結果與分析

2.1標準蛋白的消化穩(wěn)定性

在農業(yè)部869號公告-2-2007中，BLG作為對照蛋白，在模擬胃液中穩(wěn)定，60 min內不能被消化，而在模擬腸液中不穩(wěn)定，15 s內被消化；BSA在模擬胃液中不穩(wěn)定，15 s內被消化，而STI在模擬腸液中穩(wěn)定，60 min內不能被消化。本研究采用BLG、BSA和STI建立了基于質譜檢測轉基因外源蛋白質的消化穩(wěn)定性分析方法。這3 種蛋白質在模擬胃液消化實驗和模擬腸液消化實驗中的SDS-PAGE結果如圖1～4所示，得到的質譜數(shù)據見表1～4，每個蛋白質樣品重復進行兩次實驗，表中數(shù)據為兩次實驗的平均值，其中消化后匹配肽段數(shù)與消化前匹配肽段數(shù)的比值用表示。

圖1　模擬胃液消化的BLG蛋白SDS-PAGE圖Fig.1　SDS-PAGE analysis of BLG in stimulated gastric fluid

表1　模擬胃液消化BLG的質譜檢測結果Table1　MS analysis of BLG in stimulated gastric fluid

如圖1所示，在模擬胃液中消化的各個時間點，BLG的蛋白質條帶均保持和消化前相同的強度，無減弱趨勢，證明模擬胃液消化BLG的實驗體系有效。切取各消化時間段的BLG條帶進行酶切提取及質譜分析，通過Mascot數(shù)據庫檢索、定量所鑒定目標蛋白質的匹配肽段數(shù)。根據各消化時間點蛋白質匹配肽段數(shù)與消化前匹配肽段數(shù)的比值來判斷目標蛋白質的可消化性，若比值≤0.50則判斷為目標蛋白質在該時間點已消化，若0.50＜比值＜2則判斷其在該時間點和該溫度條件下未被消化。如表1所示，比值在所有時間點均大于0.50且小于2，表明BLG對胃消化液穩(wěn)定，與其已知的胃液消化特性相符。

圖2　模擬腸液消化的BLG蛋白SDS-PAGE圖Fig.2　SDS-PAGE analysis of BLG in stimulated intestinal fluid

表2　模擬腸液消化BLG的質譜檢測Table2　MS analysis of BLG in stimulated intestinal fluid

如圖2所示，在模擬腸液中消化的各個時間段中，BLG的蛋白質條帶在15 s時就已消失，證明模擬腸液消化BLG的實驗體系有效。由表2質譜分析數(shù)據可知，BLG在模擬腸液消化15 s時，比值就下降至0.50以下，由此可判斷BLG在模擬腸液中15 s內就已消化，為對腸液消化不穩(wěn)定蛋白質，與其已知的腸液消化特性相符。

圖3　模擬胃液消化的BSA蛋白SDS-PAGE圖Fig.3　SDS-PAGE analysis of BSA in stimulated gastric fluid

表3　模擬胃液消化BSA的質譜檢測Table3　MS analysis of BSA in stimulated gastric fluid

如圖3所示，BSA在模擬胃液中消化15 s時蛋白質條帶就已消失，且比值下降至0.50以下（表3），證明模擬胃液消化BSA的實驗體系有效，BSA為對胃消化液不穩(wěn)定蛋白質，與其已知的胃液消化特性相符。

圖4　模擬腸液消化的STI蛋白SDS-PAGE 圖Fig.4　SDS-PAGE analysis of STI in stimulated intestinal fluid

表4　模擬腸液消化STI的質譜檢測Table4　MS analysis of STI in stimulated intestinal fluid

如圖4所示，在模擬腸液中消化的各個時間段中，STI蛋白質條帶的強度沒有減弱，且比值在所有時間點都大于0.50且小于2（表4），證明模擬腸液消化STI的實驗體系有效，STI對腸消化液穩(wěn)定，與其已知的腸液消化特性相符。

2.2試樣蛋白的消化穩(wěn)定性結果表述

現(xiàn)行的國家標準是在實驗體系工作正常的情況下，根據SDS-PAGE圖譜和Western blotting圖譜中試樣蛋白質條帶及其可見降解片段消失的時間來判斷蛋白質的可消化性。本研究依據BLG、BSA和STI在國家標準方法中的消化穩(wěn)定性結果，建立了基于質譜檢測試樣蛋白質的消化穩(wěn)定性結果表述方法如下。

在實驗體系工作正常的情況下，根據SDS-PAGE蛋白條帶酶切后的質譜檢測所獲得匹配肽段數(shù)，計算各消化時間點蛋白質匹配肽段數(shù)與消化前蛋白質匹配肽段數(shù)的比值，當0.50＜比值＜2時判斷為目標蛋白質在該時間段內未消化，當比值≤0.50時判斷為目標蛋白質在該時間段內已消化，當比值≥2時實驗結果無效。試樣蛋白質在模擬胃液和模擬腸液中的可消化性分別表述為：

試樣蛋白質在0～15 s內，消化后與消化前蛋白質匹配肽段數(shù)的比值≤0.50，則表明已消化，表述為該蛋白質在模擬胃/腸液中極易消化。

試樣蛋白質在15 s～2 min內，消化后與消化前蛋白質匹配肽段數(shù)的比值≤0.50，則表明已消化，表述為該蛋白質在模擬胃/腸液中易消化。

試樣蛋白質在2～30 min內，消化后與消化前蛋白質匹配肽段數(shù)的比值≤0.50，則表明已消化，表述為該蛋白質在模擬胃/腸液中可消化。

試樣蛋白質在30～60 min內，消化后與消化前蛋白質匹配肽段數(shù)的比值≤0.50，則表明已消化，表述為該蛋白質在模擬胃/腸液中難消化。

試樣蛋白質于60 min時，消化后與消化前蛋白質匹配肽段數(shù)的比值仍＞0.50，則表明仍不能被消化，表述為該蛋白質在模擬胃/腸液中極難消化。

2.3應用于Cry1Ab/1Ac的消化穩(wěn)定性實驗結果

將轉基因水稻“華恢1號”外源蛋白質Cry1Ab/1Ac進行模擬胃消化液消化處理，然后進行SDS-PAGE分離（圖5），切取各消化時間段的Cry1Ab/1Ac蛋白質條帶進行酶切提取及質譜分析，通過Mascot數(shù)據庫檢索、定量所鑒定蛋白質的匹配肽段數(shù)，從而得到各時間點Cry1Ab/1Ac蛋白質匹配肽段數(shù)與消化前蛋白質匹配肽段數(shù)的比值。Cry1Ab/1Ac在模擬胃液中的可消化性見表5。在模擬胃液中消化15 s時，比值仍＞0.50；消化2 min時，比值下降到0.50以下；消化30 min和消化60 min時，比值均在0.50以下。說明轉基因水稻外源蛋白質Cry1Ab/1Ac在2 min內可被消化，在模擬胃液中的消化特性為易消化。

圖5　轉基因生物外源蛋白Cry1Ab/1Ac在模擬胃液中消化的SDS-PAGE圖PAGEFig.5　SDS-PAGE analysis of Cry1Ab/1Ac in stimulated gastric fluid

表5　模擬胃液消化轉基因水稻外源蛋白質Cry1Ab/1Ac的質譜檢測結果Table5　MS analysis of Cry1Ab/1Ac in stimulated gastric fluid

將Cry1Ab/1Ac進行模擬腸消化液消化處理，然后進行SDS-PAGE分離（圖6），切取各消化時間段的Cry1Ab/1Ac蛋白質條帶進行酶切提取及質譜分析，通過Mascot數(shù)據庫檢索、定量所鑒定蛋白質的匹配肽段數(shù)，計算得到各時間點Cry1Ab/1Ac蛋白質匹配肽段數(shù)與消化前匹配肽段數(shù)的比值。Cry1Ab/1Ac在模擬腸液中消化情況總結列于表6，Cry1Ab/1Ac在模擬腸液中消化15 s內比值下降至0.50以下，并且其余各消化時間點的比值均≤0.50。需要指出的是，雖然表6中比值呈先下降又上升的趨勢，但均≤0.50，因此仍為已消化。以上實驗結果說明Cry1Ab/1Ac在15 s內可被消化，在模擬腸液中的消化特性判斷為極易消化。

圖6　轉基因生物外源蛋白Cry1Ab/1Ac在模擬腸液中消化的SDS-PAGE圖Fig.6　SDS-PAGE analysis of Cry1Ab/1Ac in stimulated intestinal fluid

表6　模擬腸液消化轉基因水稻外源蛋白質Cry1Ab/1Ac的質譜檢測Table6　MS analysis of Cry1Ab/1Ac in stimulated intestinal fluid

3　結 論

蛋白質的消化穩(wěn)定性是指外源蛋白在進入人體胃/腸消化系統(tǒng)后的降解程度，一般利用人工模擬胃液和腸液在體外進行實驗。Astwood［18］首次將體外胃蛋白酶消化實驗應用于食物致敏原的消化穩(wěn)定性評價之后，消化穩(wěn)定性實驗就成為轉基因作物外源蛋白質食用安全性評價的重要內容之一。Taylor等［19-20］的實驗表明，若一種蛋白質在模擬胃液或腸液中能迅速被消化，可認為其對機體產生致敏作用的概率很小。傳統(tǒng)判定蛋白質消化穩(wěn)定性的Western blotting方法，需要制備針對外源蛋白質高度特異的抗體，且極易受胃/腸消化液內蛋白質及其降解片段等產生的非特異性識別信號的干擾，常常難以準確地判斷蛋白質的消化穩(wěn)定性。

質譜技術因其具有高分辨、高靈敏度以及高通量等優(yōu)點，是蛋白質定性及定量研究的重要手段。基于質譜的定量分析包括穩(wěn)定同位素標記（stable isotopic labeling）和無標記（label-free）兩種方法［21］。圖譜計數(shù)法首次由Liu Hongbin等［22］提出，是無標記定量方法之一，該方法把蛋白質中肽段的鑒定圖譜總數(shù)作為定量指標來定量蛋白質，通過SEQUEST和Mascot等軟件進行數(shù)據庫檢索、定性及定量分析［23-24］。圖譜計數(shù)法作為一種快速的半定量方法，無需復雜的數(shù)據處理步驟，只需統(tǒng)計匹配肽段的鑒定圖譜數(shù)，具有概念簡單、運算速率快、假陽性率低以及能夠高靈敏度地反映蛋白質表達水平等特點，得到了越來越廣泛的應用［12-13］。

本研究基于BLG、BSA和STI成功建立了基于質譜檢測的蛋白質消化穩(wěn)定性實驗方法，并且將該方法應用于轉基因抗蟲水稻表達外源蛋白質Cry1Ab/1Ac的消化穩(wěn)定性評價中。通過Mascot數(shù)據庫檢索、定量所鑒定目標蛋白質的匹配肽段數(shù)，根據各消化時間點蛋白質匹配肽段數(shù)與無消化液組匹配肽段數(shù)的比值來判斷目標蛋白質的消化穩(wěn)定性，若比值≤0.50則判斷為目標蛋白質在該時間段內已消化。Cry1Ab/1Ac在模擬胃液中消化2 min時比值下降至0.50以下，為易消化；Cry1Ab/1Ac在模擬腸液中15 s內比值下降至0.50以下，為極易消化，表明該外源蛋白質在模擬胃/腸消化液中不具有消化穩(wěn)定性。該結果與基于SDS-PAGE以及用傳統(tǒng)免疫印跡方法獲得的實驗結果相符［6-7，25］。本研究成功建立了一種基于質譜無標記定量的判斷轉基因水稻和其他轉基因生物及食品中外源蛋白質的消化穩(wěn)定性的分析方法。目前我國質譜技術及儀器已越來越普及，并且值得注意的是，該技術具有無需依賴特異性抗體的優(yōu)點，因此基于質譜無標記定量方法的轉基因生物外源蛋白質消化穩(wěn)定性的檢測方法具有很強的實用性和推廣性。

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Mass Spectrometry-Based Analysis of Digestive Stability of Target Protein in Genetically Modified Organism

MAO Jie， SUN Xing， CHENG Juanxian， WANG Xinzheng， ZHAO Yongqiang， WANG Hongxia， HE Kun， XIA Qing*
（National Center of Biomedical Analysis， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）

Digestive stability analysis of exogenous protein is one of the important indexes of genetically modified organisms（GMO） safety assessment. In the present study， we established a novel assessment assay for protein digestive stability based on label-free quantification of mass spectrometry using bovine β-lacto globulin （BLG）， bovine serum albumin （BSA） and soybean trypsin inhibitor （STI） as standard proteins. Protein samples were treated with simulated gastric/intestinal fluids（SGF/SIF）， and then separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The target bands were then cut out and trypsinized. The extracted peptides were analyzed by nano liquid chromatography-electronic spray ion-mass spectrum/mass spectrum and identified by Mascot software. By calculating the ratio between the matched peptide numbers of the target protein before and after SGF/SIF treatment， the digestibility of the target protein was estimated. When the ratio was lower than 0.50， the target protein was considered digestible. This newly developed assay was applied to Cry1Ab/1Ac，the exogenous protein of the genetically modified rice ‘Huahui No. 1’. The results showed that the ratio was lower than 0.50 after digestion in SGF for 2 minutes， while it decreased to less than 0.50 after digestion in SIF for 15 seconds， indicating that it is very liable to be digested. Our study provides a novel MS-based method for digestive stability analysis of target proteins from genetically modified organisms， which is easy to operate with no need for specific antibody.

genetically modified organisms； digestive stability； mass spectrometry； exogenous protein Cry1Ab/1Ac；lable-free quantification

10.7506/spkx1002-6630-201619011

TS207.3

A

1002-6630（2016）19-0064-06

毛劼， 孫興， 程娟獻， 等. 基于質譜檢測轉基因生物外源蛋白質的消化穩(wěn)定性［J］. 食品科學， 2016， 37（19）： 64-69. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619011. http：//www.spkx.net.cn

MAO Jie， SUN Xing， CHENG Juanxian， et al. Mass spectrometry-based analysis of digestive stability of target protein in genetically modified organism［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 64-69. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619011. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-02

國家科技重大專項（2014ZX08011007；2016ZX08011007）；國家重大科學儀器設備開發(fā)專項（2012YQ180117）

毛劼（1987—），女，碩士研究生，研究方向為分析化學。E-mail：maojie@proteomics.cn

夏晴（1973—），女，研究員，博士，研究方向為腫瘤轉化醫(yī)學、轉基因食品安全評價。E-mail：qxia@ncba.ac.cn