五味沙棘散提高電離輻射后小鼠存活率及保護(hù)細(xì)胞增殖的效果觀察＊

阿古拉，張少麟，李富玉

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

五味沙棘散提高電離輻射后小鼠存活率及保護(hù)細(xì)胞增殖的效果觀察＊

阿古拉，張少麟，李富玉

目的探索驗(yàn)證和開發(fā)新型輻射防護(hù)藥物五味沙棘散的電子輻射防護(hù)效果。方法綜合采用小鼠30 d活存率實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，闡明五味沙棘散的輻射防護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果五味沙棘散組明顯優(yōu)于模型組，其中高劑量組可以顯著延長輻射后死亡小鼠平均存活天數(shù)。五味沙棘散5 μg/ml可以明顯提高輻射后V79細(xì)胞增殖能力，與4 Gy組比較，細(xì)胞吸光度分別從0.59、0.86、1.17提高到0.69、1.08、1.95，差異非常顯著（P＜0.01）。五味沙棘散可以通過緩解G2期阻滯，增加G1期比例，保護(hù)V79細(xì)胞免于輻射誘導(dǎo)的DNA損傷發(fā)揮輻射防護(hù)作用。結(jié)論蒙藥五味沙棘散具有很好的電離輻射防護(hù)作用。

五味沙棘散；電離輻射防護(hù)；小鼠；V79細(xì)胞

DOI:10.14172/j.issn1671-4008.2016.10.018

電離輻射（如X線、中子、質(zhì)子、α或β粒子、γ射線）可直接或間接反應(yīng)非特異性地作用于機(jī)體，引起從細(xì)胞損傷到整個(gè)機(jī)體功能異常和器質(zhì)性改變甚至死亡。輻射損傷的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)主要是引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞死亡；而細(xì)胞死亡方式包括細(xì)胞凋亡（apoptosis）和細(xì)胞脹亡（oncosis），其所致的結(jié)果則為細(xì)胞壞死（necrosis）。五味沙棘散，由沙棘、甘草、木香、梔子等藥物組成，具有清熱祛痰，止咳定喘功效。用于肺熱久嗽，喘促痰多，胸中滿悶，胸脅作痛；慢性支氣管炎等病癥，是蒙古族醫(yī)藥驗(yàn)方。經(jīng)對方藥的前期研究結(jié)果表明有很好的輻射防護(hù)作用。為探究其防護(hù)原理，筆者進(jìn)行了五味沙棘散對小鼠提高30 d存活率及保護(hù)細(xì)胞的增殖等實(shí)驗(yàn)研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料藥品試劑為五味沙棘散由庫倫蒙藥廠提供，批號120935。實(shí)驗(yàn)動物為雄性小鼠40只，體重（20±2）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供［動物合格證號SCXK-（軍）2007-004］。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度（21±2）℃，相對濕度（50±10）%，12 h燈光12 h黑暗。實(shí)驗(yàn)儀器為倒置顯微鏡 （CKX 41 Olympas公司，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所九室提供）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、照射及給藥取對數(shù)生長期V79細(xì)胞，分別以細(xì)胞密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液接種96孔板，100 μl/孔，重復(fù)3孔；五味沙棘散處理液分別稀釋成不同濃度在照射60COγ射線4 Gy前24 h處理V79細(xì)胞，劑量率為2.35～2.49 Gy/min，以假照射組為對照，照射后立即換液，分別在不同時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞增殖。

2　結(jié)果

2.1五味沙棘散對輻射后BALB/c小鼠30 d存活率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輻射后模型組（6 Gy）小鼠體重明顯減輕，皮毛干枯，精神萎靡，行動遲緩，團(tuán)縮拱背，視力障礙；照射前分別給予五味沙棘散的各組小鼠的上述體征均有所改善，延長了輻射后小鼠的平均存活天數(shù)。五味沙棘散組明顯優(yōu)于模型組，其中高劑量組可以顯著延長輻射后死亡小鼠平均存活天數(shù)。見圖1。

圖 1　五味沙棘散對輻射后BALB/c小鼠30 d存活率的影響

2.2五味沙棘散對輻射后V79細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示隨照射后時(shí)間的延長，與同時(shí)間點(diǎn)正常組細(xì)胞吸光度相比，4 Gy組細(xì)胞活力顯著降低 （P＜0.01）；而五味沙棘散5 μg/ml可以明顯提高輻射后V79細(xì)胞增殖能力，與4 Gy組比較，細(xì)胞吸光度分別從0.59、0.86、1.17提高到0.69、1.08、1.95，差異極顯著（P＜0.01）。見圖2。

圖 2　五味沙棘散對輻射后V79細(xì)胞增殖的影響

2.3五味沙棘散對輻射后V79細(xì)胞周期的影響V79細(xì)胞經(jīng)60CO γ射線4 Gy照射后發(fā)生G2期阻滯，12、24 h時(shí)分別達(dá)到72.20%、51.36%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示溶劑DMSO含量在0.05%時(shí)對輻射后V79細(xì)胞周期無明顯影響，五味沙棘散5 μg/ml在照射前24 h處理V79細(xì)胞，與4 Gy組比較，12、24 h時(shí)，G1期細(xì)胞比例分別由11.55%、29.01%增加到24.99%、43.15%；G2期細(xì)胞比例分別由73.10%、51.58%降低到60.91%、35.83%，提示五味沙棘散可以通過緩解G2期阻滯，增加G1期比例，保護(hù)V79細(xì)胞免于輻射誘導(dǎo)的DNA損傷發(fā)揮輻射防護(hù)作用。見圖3。

圖 3　五味沙棘散對輻射后V79細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

3　討論

電離輻射使組織和細(xì)胞中產(chǎn)生大量ROS，通過直接和間接作用損傷生物大分子（如DNA，蛋白質(zhì)，脂類等），引起細(xì)胞死亡和機(jī)體功能喪失［1］。早期人們一直在努力尋找新的輻射防護(hù)藥，包括巰基類、維生素類、氨基酸類和抗氧化類等［2-4］?，F(xiàn)在人們又將注意力轉(zhuǎn)移到了低毒、高效的天然化合物上。因此中草藥及民族藥物中含有的某些化合物可以通過清除輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的過多自由基而發(fā)揮輻射保護(hù)作用［5］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明五味沙棘散促進(jìn)照射后小鼠造血系統(tǒng)恢復(fù)，提高免疫力和抗氧化能力而表現(xiàn)出一定的抗輻射作用。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明五味沙棘散可延長輻射后小鼠的平均存活天數(shù)；可提高輻射后V79細(xì)胞增殖能力；保護(hù)V79細(xì)胞免于輻射誘導(dǎo)的DNA發(fā)揮輻射防護(hù)作用。提示五味沙棘散中某些天然化合物能夠降低輻射誘導(dǎo)的機(jī)體損傷。

［1］Karbownik M，Reiter RJ.Antioxidative effects of melatonin in protection against cellular damage caused by ionizing radiation［J］.Proc Soc Exp Biol Med，2000，225（1）：9-22.

［2］Patt HM，Tyree EB，Straube RL，et al.Cysteine protection against X-irradiation［J］.Science，1949，110（2）：213-214.

［3］Durakovic A.Radioprotective agents in medicine［J］.Arh Hig Rada Toksikol，1993，44（3）：331-354.

［4］Pezeshk A.The effects of ionizing radiation on DNA：the role of thiols as radioprotectors［J］.Life Sci，2004，74（20）：2423-2429.

［5］Arora R，Gupta D，Chawla R，et al.Radioprotection by plant products：present status and future prospects［J］.Phytother Res，2005，19（1）：1-22.

［2016-04-14收稿，2016-05-13修回］［本文編輯：劉一洋］

Efficacy observation on Wuwei Shaji San enhancing the survival rate of mice underwent ionizing radiation，and protecting cell proliferation

Ahula，ZHANG Shao-lin，LI Fu-yu.Dept.of TCM，Qingdao First Sanatorium of Jinan Military Region，Qingdao，Shandong 266071，China

ObjectiveTo discover，validate and evaluate the new ionizing radiation protection effects of the new drug Wuwei Shaji San.MethodsBy using a combination of experiments，30 days'survival ratio experiment，cell proliferation experiment，and cell cycle flow cytometry experiment to clarify the ionizing radiation protection mechanisms of Wuwei Shaji San.ResultsThe ionizing radiation protection effects of Wuwei Shaji San was significantly better than the model group.And the high dose drug group showed significant extension of the average survival days of mice after ionizing radiation.Wuwei Shaji San（5 μg/ml）significantly increased the proliferation of V79 cell after radiation，the cell absorbance was increased from 0.59，0.86 and 1.17 to 0.69，1.08 and 1.95，which had a very significant difference compared with 4Gy control group（P＜0.01）.Wuwei Shaji San had an ionizing radiation protection effect through the remission of cell G2arrest，incensement of G1proportion on V79 cell from ionizing radiation induced cell DNA damage.ConclusionThe Mongolian drug Wuwei Shaji San has a good ionizing radiation protection effect.

Shaji Wuwei San；Ionizing radiation protection；Mice；V79 Cell

R285.5

A

青島市科研立項(xiàng)課題（13-1-3-55-nsh）

266071山東青島，濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院中醫(yī)科（阿古拉，張少麟，李富玉）

1.2.2五味沙棘散不同提取部位對輻射后BALB/c小鼠30 d存活率實(shí)驗(yàn)按體重隨機(jī)分為模型組（6 Gy）、陽性對照組（E523 5 mg/kg）、五味沙棘散低劑量組（100 mg/kg）和高劑量組（500 mg/kg），每組10只，每天定時(shí)灌胃蒸餾水或不同濃度藥物。除E523組照射60CO γ射線6 Gy前24 h灌胃一次外，其他三組小鼠均于灌胃第7天全身照射6 Gy一次，之后每天定時(shí)觀察、稱重、記錄各組動物死亡數(shù)。

1.2.3五味沙棘散對輻射后V79細(xì)胞增殖的影響照射4 Gy前24 h五味沙棘散（預(yù)處理）0.2～5 μg/ml處理V79細(xì)胞，照射后分別在24、48、72 h用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期待V79細(xì)胞匯合后，加入五味沙棘散（預(yù)處理）5 μg/ml共同孵育24 h后，在室溫條件下接受60CO γ射線4 Gy照射。分別在照射后12、24 h胰酶消化收集細(xì)胞，1000 rpm離心10 min，去上清，沉淀用預(yù)冷的70%乙醇重懸，-20℃固定過夜。離心去除固定液，PBS洗2次，棄上清，加1 mg/ml的RNase A 100 μl，37℃水浴30 min，加50 μg/ml的PI染液400 μl，20 min后上機(jī)檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。細(xì)胞周期數(shù)值用百分率表示，其余數(shù)據(jù)用（±s）。數(shù)據(jù)處理用OriginPro 7.5統(tǒng)計(jì)軟件。