磁環(huán)法快速重建肝上下腔靜脈大鼠肝移植模型

史源，楊濤，張全勝，張威，劉蕾，鄧永林，鄭虹，潘澄，沈中陽（天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 300192）

目前大鼠原位肝臟移植模型（OLT）已經(jīng)被廣泛用于器官保存、移植病理、移植生理以及移植免疫方面的研究。該技術(shù)最早誕生于1973年，Lee等[1]學(xué)者首先采用手工縫合技術(shù)建立大鼠肝移植模型，但是，由于該方法需要一定的外科基礎(chǔ)而且無肝期較長(zhǎng)，因此，難以得到推廣。1979年，Kamada和Calne[2]采用“雙袖套法”快速重建門靜脈以及肝下下腔靜脈，由此將無肝期縮短到15～20分鐘，術(shù)后存活率提高到70%以上，這種方法得到了廣泛認(rèn)可，成為經(jīng)典技術(shù)[3]。但是，這種技術(shù)仍然需要縫合肝上下腔靜脈（SHVC），需要一定的外科基礎(chǔ)，掌握袖套技術(shù)也需要一定的時(shí)間。1980年，Miyata等[4]提出“三袖套法”，即在Kamada技術(shù)的基礎(chǔ)上再用Cuff鞘重建SHVC[4]，然而，這種方法影響SHVC的通暢，容易造成扭曲以及錯(cuò)位，因此難以得到推廣。Tschimoto等[5-6]采用內(nèi)膜化的Cuff鞘進(jìn)行SHVC的重建，但是這種技術(shù)操作復(fù)雜，成功率低，而且難以單人操作。隨著臨床肝移植的迅速發(fā)展，相關(guān)基礎(chǔ)研究亦隨之廣泛展開，如何縮短無肝期，降低手術(shù)難度，提高大鼠肝移植模型術(shù)后存活率亦成為研究熱點(diǎn)[7-8]。

磁性壓榨技術(shù)利用磁體在相鄰臟器或血管間產(chǎn)生持續(xù)、漸進(jìn)性的壓迫，從而造成受壓榨區(qū)域逐漸缺血壞死，周圍組織逐漸愈合，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于膽道狹窄疏通、冠脈搭橋、微創(chuàng)消化道重建等領(lǐng)域。筆者對(duì)此技術(shù)研究10余年，在前期磁環(huán)法犬肝移植模型的基礎(chǔ)上[9]，成功采用鈦涂層微型磁環(huán)進(jìn)行了大鼠SHVC快速重建。

1 材料與方法

1.1 磁環(huán)設(shè)計(jì)加工：磁環(huán)制作材料為釹鐵硼，該材料廣泛用于口腔矯形、消化道磁壓榨重建等領(lǐng)域[10-12]，具有磁力強(qiáng)、組織相容性好等優(yōu)點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)的肝上磁環(huán)為橢圓形，如圖1所示，重量為0.15 g，采用線切割技術(shù)加工，氧化鈦噴涂技術(shù)覆蓋鈦涂層。采用碘伏浸泡消毒。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選用120只雄性成年Wistar大鼠，體重為230～280 g，供、受體各半，隨機(jī)分為兩組：磁環(huán)組（n＝30），采用磁環(huán)法重建SHVC，雙袖套法重建門靜脈及肝下下腔靜脈；縫合組：（n＝30），SHVC采用手工縫合，雙袖套法重建門靜脈及肝下下腔靜脈。

圖1 大鼠肝上磁環(huán)設(shè)計(jì)圖

1.3 手術(shù)過程：所有動(dòng)物術(shù)前禁食24小時(shí)，禁水8小時(shí)。采用七氟烷吸入麻醉。供體手術(shù)方式參照Kamada雙袖套法[2]，正中切口入腹，硬膜外麻醉導(dǎo)管插入膽道，肝素化5分鐘，門靜脈插管后進(jìn)行單純門靜脈灌注，采用低溫器官保存液20 cm高度進(jìn)行灌注，保留供體膈肌環(huán)。供肝修整過程中，利用SHVC周圍膈肌環(huán)進(jìn)行牽引，利用膈肌環(huán)彈性外翻套環(huán)，縫線收緊固定，如圖2a～c所示。門靜脈及肝下下腔靜脈重建參照Kamada雙袖套法[2]進(jìn)行肝動(dòng)脈結(jié)扎。

受體采用正中切口，游離肝周韌帶。結(jié)扎右腎上腺靜脈和肝動(dòng)脈，游離膽總管并斷扎，阻斷門靜脈及肝下下腔靜脈，用含生理鹽水的5 ml注射器驅(qū)血，在膈肌環(huán)以上水平阻斷SHVC。門靜脈及肝下下腔靜脈殘端預(yù)置標(biāo)記、牽引線。移除受體肝臟，原位放入供肝。磁環(huán)組套入受體磁環(huán)，將SHVC外翻，用精密蚊式鉗進(jìn)行固定，用鹽水沖洗同時(shí)依靠磁力、三維空間自動(dòng)重合特性將供體和受體磁環(huán)對(duì)合，如圖2d～f所示?？p合組采用7-0 prolene線連續(xù)縫合SHVC。兩組均采用Kamada雙袖套法重建門靜脈、肝下下腔靜脈。血流開放后，膽道用硬外麻醉導(dǎo)管插管，另一端插入受體膽道，結(jié)扎固定，肝動(dòng)脈結(jié)扎。用溫生理鹽水沖洗腹腔，逐層關(guān)腹。

術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)置于室溫環(huán)境麻醉恢復(fù)，其后自由進(jìn)水，術(shù)后3天內(nèi)每天給予青霉素肌注，不用免疫抑制劑。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有定量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，各組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，生存率采用Kaplan-Meier生存曲線分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 磁環(huán)法簡(jiǎn)要過程

2 結(jié) 果

磁環(huán)組：SHVC的重建時(shí)間（0.91±0.24）分鐘，無肝期及手術(shù)時(shí)間分別為（5.63±0.65）分鐘以及（36.02±8.02）分鐘；縫線組：SHVC重建時(shí)間為（10.4±2.11）分鐘，無肝期及手術(shù)時(shí)間分別為（17.76±2.51）分鐘以及（49.38±12.06）分鐘。磁環(huán)組和縫線組大鼠相比，SHVC的重建時(shí)間、無肝期及手術(shù)時(shí)間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），如表1所示。

表1 各組肝上下腔靜脈重建時(shí)間、無肝期及手術(shù)時(shí)間

磁環(huán)組肝上磁環(huán)對(duì)合的成功率為100%，未出現(xiàn)滲血、氣栓或者扭曲等并發(fā)癥。彩色多普勒提示肝靜脈為標(biāo)準(zhǔn)三相波，血管造影結(jié)果提示所有吻合口均通暢（圖3）。HE染色及掃描電鏡均提示磁環(huán)組肝上吻合口愈合良好（圖4）。磁環(huán)組30只受體大鼠中有29只存活超過7天，28只存活超過30天；縫線組30只受體大鼠中25只存活超過7天，22只存活超過30天（圖5，P＜0.05）。

圖3 磁環(huán)組術(shù)后2周，彩色多普勒觀察肝上吻合口（a）；磁環(huán)組術(shù)后2周，血管造影觀察肝上吻合口（b）

圖4 術(shù)后2周磁環(huán)組肝上吻合口

圖5 磁環(huán)組和縫線組術(shù)后存活率比較

3 討 論

大鼠OLT是一種非常精細(xì)的顯微外科操作。它是一個(gè)多步驟、多環(huán)節(jié)、相互連續(xù)且相互聯(lián)系的手術(shù)過程，其中供、受體任何一個(gè)步驟操作失誤均會(huì)導(dǎo)致手術(shù)失敗，影響大鼠術(shù)后的存活，甚至直接導(dǎo)致大鼠死亡。其中最大的難點(diǎn)便是手術(shù)過程中存在無肝期。Kamada等[2]提出無肝期的最長(zhǎng)時(shí)間不能超過25分鐘，否則大鼠很難存活。本經(jīng)驗(yàn)也表明，無肝期的長(zhǎng)短直接關(guān)系到手術(shù)的成敗，熟練的顯微外科吻合技術(shù)和套管技術(shù)是縮短無肝期的有力保障。尤其是高質(zhì)量迅速完成肝上腔靜脈的吻合，是手術(shù)成功的最主要瓶頸[13-14]。

磁性壓榨吻合技術(shù)有3個(gè)方面優(yōu)勢(shì)：① 相同形狀磁體三維空間自動(dòng)重合，即肝上對(duì)合時(shí)可以自動(dòng)完全重合；② 非穿透性，可以避免縫線、鈦釘?shù)犬愇飵淼难装Y反應(yīng)，保證血管內(nèi)膜的完整性，減少異物刺激，促進(jìn)愈合；③ 漸進(jìn)性，即隨著磁環(huán)間組織壞死，磁環(huán)間距減少，磁力加大，安全性較好。尤其對(duì)于大鼠SHVC而言，菲薄的血管壁組織容易導(dǎo)致吻合口縫線穿透處漏血，或者起皺導(dǎo)致漏針，這些均是造成開放后動(dòng)物出血死亡的最常見原因。結(jié)果證實(shí)，采用磁環(huán)法進(jìn)行SHVC重建時(shí)，磁環(huán)對(duì)合成功率為100%，未出現(xiàn)滲血、氣栓或者扭曲等并發(fā)癥。彩色多普勒提示肝靜脈為標(biāo)準(zhǔn)三相波，血管造影提示所有吻合口均通暢。HE染色及掃描電鏡均提示磁環(huán)組肝上吻合口愈合良好。這些結(jié)果均顯示出磁環(huán)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。

磁環(huán)技術(shù)明顯縮短了大鼠肝移植模型的無肝期，降低了手術(shù)難度，術(shù)后存活率亦隨之提高。微型磁環(huán)快速重建技術(shù)，為大鼠肝移植術(shù)中肝上下腔靜脈重建提供一種新型、簡(jiǎn)單穩(wěn)定的方式，明顯縮短無肝期時(shí)間，提高手術(shù)成功率，降低手術(shù)難度。在2年的研究過程中，天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心將此技術(shù)推廣到其他移植中心，效果亦滿意，學(xué)習(xí)曲線2～3個(gè)月左右，最長(zhǎng)存活時(shí)間近1年半，并在此基礎(chǔ)上成功建立了急性排斥反應(yīng)模型、小鼠肝移植模型、腦死亡大鼠肝移植模型等。