擬南芥CYCD2;1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化分析

代麗娟 鄭唐春 劉彩霞 李開隆 曲冠證

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

* 通信作者：E-mail:quguanzheng@yahoo.com

擬南芥CYCD2;1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化分析

代麗娟 鄭唐春 劉彩霞 李開隆 曲冠證*

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

細(xì)胞分裂是生物的基本特征之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，發(fā)揮著極其重要的作用，細(xì)胞周期蛋白CYCD2;1基因作為一個(gè)調(diào)控因子，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期具有重要作用。本文以擬南芥細(xì)胞周期蛋白(AtCYCD2;1基因)作為研究對(duì)象，利用PCR技術(shù)從擬南芥花序cDNA擴(kuò)增出AtCYCD2;1基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體(pROKII-AtCYCD2;1)并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化野生型煙草。轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，AtCYCD2;1基因已經(jīng)整合到了煙草基因組中。在T2代植株中，通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)顯示，AtCYCD2;1在mRNA水平也均有表達(dá)。過量表達(dá)CYCD2;1的轉(zhuǎn)基因煙草在花器官中存在明顯表型，與野生型相比主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株花冠寬度變大，花瓣和萼片長(zhǎng)度變長(zhǎng)，果實(shí)變大，上述結(jié)果表明AtCYCD2;1基因影響花的發(fā)育。

AtCYCD2;1；周期蛋白；遺傳轉(zhuǎn)化；煙草

植物D類周期蛋白(cyclin D,CYCD)控制著細(xì)胞周期的進(jìn)程，在細(xì)胞的分裂增殖過程中起重要作用，它是調(diào)控有絲分裂的信號(hào)。此外，植物D型周期蛋白在G1期優(yōu)先被分裂素刺激物誘導(dǎo)[1～2]。根據(jù)周期蛋白在細(xì)胞周期不同階段發(fā)揮的作用，將其分為G1周期蛋白、S周期蛋白和G2周期蛋白[3]。CYCD在G1到S期過渡中起重要作用，故而又被稱為G期特異性周期蛋白[4]。CYCD的作用主要是積累發(fā)育信號(hào)，控制細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期[3,5～6]。同時(shí)，周期蛋白作為一種調(diào)節(jié)亞基，通過與周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent-kinase，CDK)結(jié)合并將之激活，并在其它調(diào)控因子作用下，通過可逆性的磷酸化作用來(lái)控制細(xì)胞分裂周期有序地進(jìn)行[7～8]。研究表明，在植物中過量表達(dá)一些周期蛋白，尤其是CYCDs能改變植株的生長(zhǎng)和發(fā)育[9]。Yu等[10]以煙草、擬南芥為對(duì)象，研究了CYCA基因表達(dá)被抑制時(shí)能導(dǎo)致不育，并抑制葉片外植體形成愈傷組織。CYCB基因的過量表達(dá)能促使轉(zhuǎn)基因煙草葉片在不添加任何外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上形成不定芽[11]。CYCD的組成型表達(dá)使轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片在不添加外源細(xì)胞分裂素的組織培養(yǎng)條件下進(jìn)行細(xì)胞分裂[12]。此外，利用雌激素誘導(dǎo)CYCD3不僅能影響擬南芥初生根的生長(zhǎng)還能誘導(dǎo)初生根對(duì)重力的響應(yīng)[13]。Fujii等[14]也發(fā)現(xiàn)利用楊樹的PtCYCB1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CYCD基因在煙草中表達(dá)，不僅能提高維管形成層的細(xì)胞分裂還能增加次生木質(zhì)部的分化。

擬南芥CYCD分為3個(gè)亞型，分別是CYCD1、CYCD2、CYCD3[15]。CYCD2最早是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，在G1的早期被激活并受蔗糖調(diào)控，對(duì)激素不響應(yīng)，蛋白定位于細(xì)胞核，同時(shí)能與ICK相互作用共同抑制側(cè)根的形成[6,16]。Boucheron等[17]證明在超量表達(dá)擬南芥CYCD2的轉(zhuǎn)基因煙草植株中，從幼苗期到成熟的各個(gè)時(shí)期，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)和地上部分生物量積累速率加快，細(xì)胞周期縮短。

在真核生物中，Horsch等[18]采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)首次獲得了轉(zhuǎn)基因的煙草植株，之后煙草的轉(zhuǎn)基因研究工作取得了一系列重要研究進(jìn)展。以往對(duì)于植物CYCD的功能性研究尚不全面，到目前為止，關(guān)于擬南芥周期蛋白基因在煙草中的異源表達(dá)研究報(bào)道較少。本研究從擬南芥中克隆CYCD2;1，其在擬南芥Tair網(wǎng)站的命名為AT2G22490。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)為1 715 bp，開放讀碼框?yàn)? 089 bp，共編碼362個(gè)氨基酸，該基因編碼蛋白的分子量為40 707.83 Da，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為4.96。通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，并使其在煙草中表達(dá)，觀察到轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)生了顯著的的表型變化，且這些表型在以前的轉(zhuǎn)基因擬南芥及煙草中未被發(fā)現(xiàn)。本研究不僅對(duì)植物周期蛋白CYCD2;1功能進(jìn)行了新的補(bǔ)充，還豐富了對(duì)植物花發(fā)育的ABC模型的新的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料擬南芥(ArabidopsisthalianaCol-0)、普通煙草(NicotianatabacumL.)由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌菌株GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

PCR相關(guān)試劑、DNA marker、限制性內(nèi)切酶、T4DNA ligase和PrimeScriptTMRT reagent Kit、限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司(美國(guó))；植物表達(dá)載體pROKII質(zhì)粒，由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈(zèng)；pEasy-T1載體、EasyPure Plant RNA Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成及基因測(cè)序由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 擬南芥CYCD2;1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)NCBI網(wǎng)站所公布的擬南芥CYCD2;1基因mRNA設(shè)計(jì)引物，分別命名為D2;1-F；D2;1-R。所用引物序列如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物列表

用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒提取擬南芥花序的總RNA，檢測(cè)純度和濃度后，以0.5 μg總RNA為起始材料，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以單鏈cDNA為模板，利用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含2.5 μL 10×Ex PCR Buffer、2.0 μL dNTP、1.0 μL的模版、1.0 μL上游引物(D2;1-F)、1.0 μL下游引物(D2;1-R)、0.25 μL ExTaq(5 U·μL-1)、17.25 μL ddH2O。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，共35 cycles；72℃延伸7 min。擴(kuò)增完成后，吸取3 μL利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.3.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

通過表1引物擴(kuò)增目的片段，連接pEasy-T1載體并轉(zhuǎn)化Trans1-T1，隨后挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，將菌液送哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測(cè)序并保存。然后，利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BamHⅠ對(duì)pEasy-T1-AtCYCD2;1和pROKII質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，分別回收目的片段，利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，以表1中的pROKII通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的菌液送哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測(cè)序，同時(shí)，將重組質(zhì)粒pROKII-AtCYCD2;1用SacⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切檢驗(yàn)，最后采用液氮凍融法將pROKII-AtCYCD2;1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。

1.3.3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

參考Horsch等[18]的煙草遺傳轉(zhuǎn)化方法，并修改如下：取長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)大約3周左右的野生型煙草(WT)的葉片，切成1 cm×1 cm小塊，在(25±2)℃、16 h·d-1光照下預(yù)培養(yǎng)1 d。在無(wú)菌操作下，將GV3101(pROKII-AtCYCD2;1)的菌種接種到20 mL含抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8。4 000 r·min-1離心5 min，濃縮菌體，將收集到的菌體用滅菌水稀釋至終濃度為OD600=0.2～0.3，然后，將預(yù)培養(yǎng)1 d的煙草葉片浸泡到制備好的侵染液中3～7 min，期間輕輕的搖動(dòng)侵染夜，取出葉片將多余的菌液用無(wú)菌濾紙吸干。將侵染過的葉片在不含抗生素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，暗培養(yǎng)條件(25±2)℃下共培養(yǎng)2 d。共培養(yǎng)后的葉片用無(wú)菌濾紙吸干多余的水分后放于含有相應(yīng)抗生素的MS分化培養(yǎng)基上(50 mg·L-1卡納霉素和500 mg·L-1頭孢霉素)培養(yǎng)，直至分化出抗性芽。待抗性芽長(zhǎng)出葉片后，將其切下放在含有抗生素的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行二次篩選分化。待2次分化的不定芽長(zhǎng)到約1.0 cm時(shí)，將其切下，放于MS生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。選擇生長(zhǎng)健壯的煙草植株，洗去附在煙草根部的培養(yǎng)基，將其移栽到肥沃的土壤中。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

為篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，利用CTAB法提取篩選后的T1代轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片DNA，同時(shí)利用表1中pROKII通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，35 cycles；72℃在延伸7 min，PCR結(jié)束后取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的熒光定量PCR檢測(cè)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證AtCYCD2;1基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，引物如表1所示。反應(yīng)體系為20 μL;其中2×SYBR Green實(shí)時(shí)熒光染料混合液10 μL，ROX DyeⅡ 0.4 μL，2 μL cDNA模板，正向引物(D2;1-RT-F)，反向引物(D2;1-RT-R)各0.8 μL。以Ntactin基因作為參照，擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，并通過2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 過表達(dá)AtCYCD2;1煙草植株的表型觀察

挑選表達(dá)量較高3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照株系分別移栽至溫室，分別對(duì)其進(jìn)行定期的觀察，在移栽后60 d后開始開花，1周后進(jìn)入盛花期，在頂部花序中，隨機(jī)選取5朵剛剛開放的花，分別測(cè)量它們的花瓣寬度、花的長(zhǎng)度和花萼，最后對(duì)測(cè)量的結(jié)果利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行SNK差異性統(tǒng)計(jì)分析。

在移栽入溫室后30 d，分別選取3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照株系的成熟葉片，將葉片下表皮細(xì)胞制作成鏡檢樣品，在顯微鏡下觀察并拍照。

選取相同生長(zhǎng)條件同期種植的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草株系，落花后一周，待形成果實(shí)后剝?nèi)ス?，并在?shí)體顯微鏡下對(duì)比觀察種子細(xì)胞的變化情況并進(jìn)行拍照。再過一周，果實(shí)大小已經(jīng)定性，不再繼續(xù)生長(zhǎng)，測(cè)量果實(shí)的長(zhǎng)度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥CYCD2;1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

利用RNA提取試劑盒，從擬南芥花序中成功提取總RNA，經(jīng)檢測(cè)濃度及質(zhì)量均可用于下一步試驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)表明，條帶清晰且和預(yù)期大小一致(圖1:A)。將目的片段膠回收后與pEasy-T1載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1，隨機(jī)挑取單菌落，用pEasy-T1通用引物進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。擴(kuò)增出1 000 bp左右的特異性條帶(圖1:B)，與預(yù)期結(jié)果一致，說明AtCYCD2;1基因片段已成功連接到pEasy-T1載體上。將檢測(cè)的菌液送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)目的片段未發(fā)生堿基突變，成功克隆AtCYCD2;1基因。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

將測(cè)序正確的pEasy-T1-AtCYCD2;1的菌液提質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BamHⅠ對(duì)pEasy-T1-AtCYCD2;1和pROKII的質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切反應(yīng)(圖2:A)，分別回收目的片段。利用T4DNA ligase進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得1 000 bp左右目的條帶。然后搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖2:B)，同時(shí)將重組質(zhì)粒利用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切檢測(cè)，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示切出1 000 bp左右的目的條帶(圖2:C)，此外將質(zhì)粒送公司測(cè)序。最終結(jié)果表明，AtCYCD2;1基因成功整合到植物表達(dá)載體pROKII中，未發(fā)生堿基突變，至此植物表達(dá)載體構(gòu)建完成。采用液氮凍融法將pROKII-AtCYCD2;1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選6個(gè)單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(圖2:D)

圖1 擬南芥AtCYCD2;1基因的克隆及鑒定a.擬南芥AtCYCD2;1基因的克隆(M. DNA marker DL5000； 1. AtCYCD2;1基因PCR產(chǎn)物)；B. pEasy-T1-AtCYCD2;1載體在大腸桿菌菌液中PCR檢測(cè)(M. DNA marker DL5000；1～5. pEasy-T1-AtCYCD2;1載體的PCR產(chǎn)物；6. ddH2O作為陰性對(duì)照)Fig.1 The clone and verification of AtCYCD2;1 gene from Arabidopsisa. The cloning of AtCYCD2;1 gene(M. DNA marker DL5000; 1. PCR product of AtCYCD2;1 gene); B. PCR detection of pEasy-T1-AtCYCD2;1 in E.coli(M. DNA marker DL5000; 1-5. PCR products of pEasy-T1-AtCYCD2;1 vector; 6. ddH2O as a negative control)

圖2 植物表達(dá)載體pROKII-AtCYCD2;1的構(gòu)建及驗(yàn)證a.限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果(M. DNA marker DL5000；1.pEasy-T1-AtCYCD2;1的雙酶切條帶；2～3.質(zhì)粒pROKII的雙酶條帶)；B.植物表達(dá)載體pROKII-AtCYCD2;1的質(zhì)粒PCR檢測(cè)(M. DNA marker DL5000；1～3.pROKII-AtCYCD2;1質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；4.ddH2O作為陰性對(duì)照)；C.植物表達(dá)載體pROKII-AtCYCD2;1的雙酶切鑒定(M. DNA marker DL5000；1～2.重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物)；D.農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測(cè)(M. DNA marker DL5000；1～6. 6個(gè)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測(cè)；7.ddH2O作為陰性對(duì)照)Fig.2 The construction and verification of plant expression vector pROKII-AtCYCD2;1a. Electrophoretogram of restriction enzymes digestion(M. DNA marker DL5000; 1. Digestion of pEasy-T1-AtCYCD2;1 with SacⅠ and BamHⅠ; 2-3. Digestion of pROKII vector with SacⅠ and BamHⅠ); B. PCR detection of plant expression vector pROKII-AtCYCD2;1(M. DNA marker DL5000; 1-3. PCR products of pROKII-AtCYCD2;1 vector; 4. ddH2O as a negative control); C. The double digestion result of plant expression vector pROKII-AtCYCD2;1(M. DNA marker DL5000; 1-2. Double digestion of recombinant plasmids); D. PCR detection of Agrobacterium-mediated transformation(M. DNA marker DL5000; 1-6. PCR products of transformants in Agrobacterium; 7. ddH2O as a negative control)

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及PCR檢測(cè)

用含有pROKII-AtCYCD2;1農(nóng)桿菌GV3101侵染煙草葉片，經(jīng)4～6周的選擇培養(yǎng)，從葉片周圍的愈傷組織分化，都出現(xiàn)綠色或淡綠色的不定芽(圖3:A)。將不定芽分割后培養(yǎng)，繼而生成大量從生芽。待抗性芽長(zhǎng)出葉片后，將葉片切下放在含有卡納(50 mg·L-1)抗生素的分生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，進(jìn)行2次篩選。將兩次分化獲得的芽在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根定植，獲得完整轉(zhuǎn)基因煙草植株(圖3:B)。提取T1代轉(zhuǎn)基因生根植株煙草葉片基因組DNA，利用載體pROKII的通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。最終結(jié)果表明，所有檢測(cè)的抗性植株中，除了轉(zhuǎn)基因株系6號(hào)外，其余的12個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均擴(kuò)增出了大小為1 000左右的片段，與陽(yáng)性對(duì)照大小一致，野生型煙草為模板的反應(yīng)，未擴(kuò)增出條帶，說明外源基因已經(jīng)整合入煙草基因組中(圖3:D)。進(jìn)而將檢測(cè)為陽(yáng)性的T2代植株栽倒土里，使其繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育(圖3:C)。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及PCR檢測(cè)a.選擇培養(yǎng)基上形成的抗性芽；B.轉(zhuǎn)基因植株生根苗；C.移栽至土中的轉(zhuǎn)基因植株(CK.野生型植株作為對(duì)照；T.轉(zhuǎn)基因植株)；D.轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)(M. DNA marker DL5000；P.重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照；CK.野生型煙草DNA；1～13. 13個(gè)抗性植株的DNAPCR檢驗(yàn)；14. ddH2O作為陰性對(duì)照)Fig.3 The acquirement and PCR detection of transgenic plantsa. The putative transgenic shoot buds; B. The transgenic seedling for rooting; C. The mature plant in soil(CK. Wild-type plant; T. The transgenic plant with target gene); D. Thirteen transgenic tobaccos were determined by PCR using special primers(M. DNA marker DL5000; P. Positive control; CK. Wild-type tobacco as negative control; 1-13. PCR products of 13 independent transgenic tobacco; 14. ddH2O as a negative control)

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測(cè) CK.野生型煙草；L1～5/L7～13. 12個(gè)AtCYCD2;1轉(zhuǎn)基因煙草植株Fig.4 The qRT-PCR detection of transgenic plants CK. Wild-type tobacco; L1-5/L7-13. Twelve transgenic tobacco plants of AtCYCD2;1

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的熒光定量PCR檢測(cè)

為了研究擬南芥AtCYCD2;1基因在煙草植株中的表達(dá)情況，提取煙草葉總RNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。與野生型煙草比，擬南芥AtCYCD2;1基因轉(zhuǎn)化到煙草植株中均有表達(dá)，表達(dá)量較高的株系有L1、L2、L4、L5、L8、L9、L10和L13，表達(dá)量最高的株系是L4、L5、L8(圖4)，這3個(gè)株系用于下一步的繼續(xù)分析。

2.5 過表達(dá)AtCYCD2;1煙草植株的表型分析

將得到的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行不定期觀察，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，暫未發(fā)現(xiàn)可見的性狀差異。待植株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系相比花冠變大、花瓣變大、萼片及果實(shí)變大(圖5:A～C)，分別選取3株轉(zhuǎn)基因株系L4、L5和L8和3株對(duì)照株系(每個(gè)株系頂端隨機(jī)取5朵花)，測(cè)量它們的花冠寬度、花瓣的長(zhǎng)度、萼片及果實(shí)的長(zhǎng)度，利用SPSS 19.0軟件，采用SNK方差齊性檢驗(yàn)的方法對(duì)其差異顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6:A～D，轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系比，花冠顯著變寬、花瓣顯著變大、萼片及果實(shí)也明顯變長(zhǎng)。上述結(jié)果表明過表達(dá)AtCYCD2;1基因影響轉(zhuǎn)基因植株的花器官及果實(shí)的發(fā)育。

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草的表型觀察a.花朵大小觀察；B.花冠大小觀察；C.果實(shí)大小比較 CK. 野生型對(duì)照植株；L4/5/8. 3個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因煙草株系Fig.5 Phenotype observation of transgenic tobaccoa.Observation of the size of flowers; B.Observation of the size of corolla; C.Comparation of the size of fruits CK. Wild type; L4/5/8: 3 individual transgenic plant

圖6 轉(zhuǎn)基因煙草表型的統(tǒng)計(jì)分析a.轉(zhuǎn)基因與對(duì)照煙草花冠寬度的比較；B.轉(zhuǎn)基因與對(duì)照煙草花瓣長(zhǎng)度的比較；C.轉(zhuǎn)基因與對(duì)照煙草花萼長(zhǎng)度的比較；D.轉(zhuǎn)基因與對(duì)照煙草果實(shí)長(zhǎng)度的比較 CK1～3. 3個(gè)野生型植株；L4/5/8. 3個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因煙草株系；柱形圖上小寫字母不同表示同一根段不同樣品間差異達(dá)到顯著水平(P ≤ 0.05)Fig.6 Statistic analysis phenotype of transgenic tobaccoa.Comparison of the width of corolla between the transgenic and wild type tobacco; B.Comparison of the length of petal between the transgenic and wild type tobacco; C.Comparison of the length of sepal between the transgenic and wild type tobacco; D.Comparison of the length of seed pod between the transgenic and wild type tobacco CK1-3. 3 individual wild-type; L4/5/8. 3 individual transgenic plant. Different lowercase letters on the column diagram showed the significant difference between different samples(P≤0.05)

2.6過表達(dá)AtCYCD2;1煙草植株葉片與種子的顯微觀察

選取3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照株系的成熟葉片，將葉片下表皮制作成鏡檢樣品，在體式顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果(圖7:A～B)顯示，轉(zhuǎn)基因株系下表皮細(xì)胞與對(duì)照相比，暫未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大小具有明顯區(qū)別。此外選取相同生長(zhǎng)條件同期種植的轉(zhuǎn)基因和對(duì)照煙草株系，待形成果實(shí)后剝掉果皮，并在顯微鏡下對(duì)比觀察種子的發(fā)育情況及種子上的表皮細(xì)胞大小，同時(shí)計(jì)算種子單位面積的敗育率。結(jié)果表明：果實(shí)發(fā)育基本一致，野生型(CK)果實(shí)和轉(zhuǎn)基因株系(AtCYCD2;1)果實(shí)的單位面積敗育率分別為0.1167%和0.5767%，利用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)顯示單位面積內(nèi)種子敗育率差異不顯著。此外種子的直徑差異不大，表皮細(xì)胞大小也沒有明顯的差異(圖7:C～F)。

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草葉片及種子的顯微觀察 A～B.轉(zhuǎn)基因與對(duì)照煙草的葉片下表皮的顯微觀察；C～D. 轉(zhuǎn)基因與對(duì)照煙草發(fā)育中果實(shí)的顯微觀察；E～F. C和D圖的局部放大圖 CK.野生型對(duì)照植株(A，C，E)；T.轉(zhuǎn)基因煙草株系(B，D，F(xiàn))Fig.7 Microscopic observation of leaves and seeds from transgenic tobacoo A-B. Microscopic observation of the leaf epidermis; C-D. Observation of the seeds in the development; E-F. Close-up of the image C and D CK. Wild-type(A,C,E); T. Transgenic plant(B,D,F)

3 討論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育受內(nèi)外信號(hào)的調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白作為重要的體內(nèi)調(diào)控因素，作用舉足輕重[3]。在一些細(xì)胞周期過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中，尤其是CYCDs，能改變植株的生長(zhǎng)和發(fā)育[12]。CYCD2;1作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，最初由Soni等[6]在擬南芥中克隆并鑒定。Qi等[19]首次提出了在CYCD2;1基因的cDNA和DNA序列轉(zhuǎn)基因株系中存在轉(zhuǎn)錄差異，只有形成全長(zhǎng)的mRNA，才會(huì)使G1期細(xì)胞數(shù)量增加，同時(shí)其過表達(dá)能增加CDK/Cyclin的酶活，減小S期和分裂期細(xì)胞的大小。此外，在植物的生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂中，ICK的過量表達(dá)能夠抑制CDK/Cyclin的活性，在擬南芥中過量表達(dá)ICK1致使轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞變大，這與CYCD過表達(dá)植株的表型相反[20]。酵母雙雜交顯示ICK1與CYCD2存在互作關(guān)系，然而35S::ICK1×35S::CYCD2雜交植株在F1代與同一時(shí)間段野生型的細(xì)胞相比顯著地變小，推測(cè)CYCD2;1與ICK1的結(jié)合后，CYCD2;1的功能尚未被完全抑制，仍能導(dǎo)致植物細(xì)胞變小，進(jìn)而影響植株的生長(zhǎng)與發(fā)育[21]。最新研究表明，一個(gè)靜默中心特異表達(dá)的wuschel-relatedhomeobox5(WOX5)基因能在根干的靜默中心通過抑制CYCD的活性，來(lái)啟動(dòng)和位置靜默中心的功能[22]。

本實(shí)驗(yàn)為探究擬南芥AtCYCD2;1基因異源表達(dá)的功能，從擬南芥花cDNA中克隆出AtCYCD2;1基因，將AtCYCD2;1基因轉(zhuǎn)入到煙草后發(fā)現(xiàn)了新的表型。與野生型相比，過量表達(dá)AtCYCD2;1的轉(zhuǎn)基因煙草的花器官發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為花冠寬度、花瓣和萼片的長(zhǎng)度都大于對(duì)照植株，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的果實(shí)也大于野生型煙草。然而轉(zhuǎn)基因植株的葉片下表皮及種子的細(xì)胞沒有觀察到明顯的變小趨勢(shì)。研究表明，大多數(shù)的植物D型周期蛋白在分裂旺盛的組織中表達(dá)量較高[23]。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞大小觀察的材料均為發(fā)育成熟的葉片表皮及成熟的種子，可能取材時(shí)間及部位存在誤區(qū)，這和Qi等[19]發(fā)現(xiàn)根尖分裂區(qū)細(xì)胞明顯變小，而成熟葉片表皮細(xì)胞差異不大的結(jié)果類似。花芽分化是是由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的生理和形態(tài)標(biāo)志?；ㄔ细鬏喕ㄆ鞯姆只樞?，一般為向心分化，即從花托的外周開始，先分化花萼，然后逐漸向心分化花瓣、雄蕊、雌蕊。本實(shí)驗(yàn)中花萼、花瓣等明顯變大，表明擬南芥AtCYCD2;1在異源調(diào)控細(xì)胞周期活動(dòng)以及植物的生殖發(fā)育方面具有非常重要的作用。已有研究表明擬南芥AtCYCD2;1是通過與CDK結(jié)合形成復(fù)合物作用于細(xì)胞周期的G1期，從而控制分生組織內(nèi)的細(xì)胞分裂速率[19]。這說明煙草中可能也存在與AtCYCD2;1結(jié)合的CDK，擬南芥AtCYCD2;1與煙草NtCDK有可能在植株特定的發(fā)育時(shí)期，調(diào)節(jié)控制植株的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是生殖器官的發(fā)育。然而，AtCYCD2;1基因在植物中是通過怎樣的方式調(diào)控生殖器官發(fā)育及果實(shí)的形態(tài)變化仍需進(jìn)一步深入的探究，下一步將進(jìn)行分裂期細(xì)胞的形態(tài)觀察以及G1期速率的測(cè)定等一系列實(shí)驗(yàn)，以期對(duì)AtCYCD2;1基因作用機(jī)理進(jìn)行闡述，挖掘出其潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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ConstructionofPlantExpressionVectorandGeneticTransformationAnalysisofArabidopsisthalianaCYCD2;1GeneinNicotianatabacum

DAI Li-Juan ZHENG Tang-Chun LIU Cai-Xia LI Kai-Long QU Guan-Zheng*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

Cell division is one of the basic characteristics of organisms, which plays an extremely important role in the plant growth and development.CYCD2;1, as a regulatory factor, has been identified in regulation of cell cycle. In our study,CYCD2;1 was amplified fromArabidopsisinflorescences cDNA by PCR. Plant overexpression vector (pROKII-AtCYCD2;1) was constructed and transformed into wild-type tobacco byAgrobacterium-mediated leaf disc transformation. The transgenic plants were confirmed by PCR, and the result showedAtCYCD2;1 gene was integrated into tobacco genome. The result of qRT-PCR detection of T2 generation plants showed the mRNA ofAtCYCD2;1 was transcribed in transgenic tobaccos. There were significant differences in the flower between the transgenic and wild type plant, such as the width of the corolla, the lengths of the petal and sepal, and increased volume of seed pod, which suggesting overexpression ofAtCYCD2;1 has an obvious influence on the development of flowers.

AtCYCD2;1;cyclin;genetic transformation;Nicotianatabacum

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET-12-0808)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370661)資助

代麗娟(1988—)，女，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。

2015-07-29

Q943

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.018