基于核基因序列JRD5680的核桃群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究

張 甜 王瑪麗 趙 鵬

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069)

* 通信作者：E-mail:pengzhao@nwu.edu.cn

基于核基因序列JRD5680的核桃群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究

張 甜 王瑪麗 趙 鵬*

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069)

以40個核桃(Juglansregia)地理群體及5個外類群植物為材料，利用苯丙氨酸解氨酶基因片段JRD5680序列對265個個體研究了我國不同地區(qū)核桃的群體遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)以及單倍型地理分布。結(jié)果表明：核基因JRD5680序列長度為809 bp，其中G+C堿基含量為46.2%，74個簡約性信息位點。共30個單倍型，單倍型多樣性變異小，表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性(Hd=0.370，π=0.005 3)。核桃群體間有明顯的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)(NST>GST)，呈現(xiàn)地域性分布格局的特點。空間遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，地理隔離距離與遺傳距離之間也顯示兩者之間相關(guān)性顯著(r=0.263 2；P=0.032 4*)，不同地理分布核桃群體間存在著明顯地理隔離效應(yīng)。綜合失配分析及中性檢驗的結(jié)果，可推斷出近期歷史上不同地區(qū)核桃沒有發(fā)生群體擴張事件。遺傳結(jié)構(gòu)顯示，核桃群體可分為兩組(西南地區(qū)與其他地區(qū))。AMOVA分析結(jié)果表明，核桃群體遺傳變異主要存于群體之間(56.54%)，不同種之間的遺傳分化水平較高(FST=0.885)。單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹中核桃與外類群物種均能形成單系分支，說明JRD5680序列在胡桃科中的具有較高的分子鑒別率。

核桃;苯丙氨酸解氨酶基因;遺傳多樣性;遺傳結(jié)構(gòu)

植物群體遺傳變異是進化的基礎(chǔ)，這些變化的速率與現(xiàn)有的遺傳多樣性的數(shù)量成比例[1～2]。遺傳多樣性水平可以反映植物自身的生物學(xué)特征及適應(yīng)自然環(huán)境變化和人為干擾的能力[3]。遺傳結(jié)構(gòu)是物種在空間上不同群體間和同一群體內(nèi)不同個體間的遺傳變異[4],群體遺傳結(jié)構(gòu)差異也是衡量植物遺傳多樣性的一種重要體現(xiàn)[5]。了解群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)，可以揭示物種或群體的進化歷史，為其進化潛力的研究提供重要資料，也為物種保護提供基本的遺傳信息。

核桃(JuglansregiaL.)也稱胡桃，具有很高的經(jīng)濟、食用和藥用價值[6]。核桃在我國的分布范圍十分廣泛，由于地理因素、氣候條件等不盡相同，導(dǎo)致不同地理群體的核桃在形態(tài)特征、生理及遺傳特性等方面存在一定的差異，具有豐富的遺傳多樣性。同時，由于核桃經(jīng)長期的自然和人為選擇，導(dǎo)致核桃的遺傳背景非常復(fù)雜[7]。近二十年來，國內(nèi)外學(xué)者采用不同的分子標(biāo)記技術(shù)，對核桃的不同種質(zhì)資源進行了研究。主要包括：限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)[8]、隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)[9]、簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性(SSR)[10]和擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)[11]等。但鑒于這些遺傳標(biāo)記本身存在的局限性，群體樣本數(shù)較少的限制。對中國整個地理分布范圍的核桃遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)仍需進一步認(rèn)識和研究。植物細(xì)胞中存在3套基因組，其中葉綠體基因(cpDNA)和線粒體基因(mtDNA)都是單親遺傳[12]，反映的遺傳信息有限，不適宜作為核桃種內(nèi)遺傳多樣性研究。而核基因DNA序列因為雙親遺傳標(biāo)記，包含著更為豐富的遺傳信息，在植物遺傳多樣性研究方面已有報道[13～14]，但在胡桃屬植物的種質(zhì)資源研究中還未見報道。

本研究擬通過核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出苯丙氨酸解氨酶基因片段JRD5680序列對核桃40個地理群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行了分析，以2個核桃楸(J.mandshurica)、1個野核桃(J.cathayensis)、1個山核桃(Caryacathayensis)及1個黃杞(Engelhardtiaroxburghiana)地理群體植物為外類群，探討在核基因的水平評估全國不同地理群體核桃的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及歷史動態(tài)，以期為核桃種質(zhì)資源的開發(fā)和利用提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集

實驗所用材料采自中國40個地理分布核桃群體、2個核桃楸群體、1個野核桃群體、1個山核桃群體及1個黃杞群體。各群體的采集地理位置、群體代碼、海拔、經(jīng)緯度等詳細(xì)信息(表1)。采集過程中，每個自然群體選擇9～20個植株進行采樣，采樣間隔距離為50～100 m。在每棵核桃樹上采集健康幼嫩的樹葉數(shù)片，將其迅速放入盛有變色硅膠的封口塑料袋內(nèi)，帶回實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取與檢測

基因組DNA的提取與分離方法是參照Doyle and Doyle提出的CTAB方法[14]，并在此基礎(chǔ)上進行了改良，方法詳見Zhao and Woeste和趙鵬等[9,15]。利用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的濃度和純度。

1.2.2核基因JRD5680序列的引物設(shè)計、PCR擴增、檢測與測序

從核桃的葉片、芽、雌花和雄花不同組織提取RNA后獲得核桃的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對轉(zhuǎn)錄組中拼接得到的基因進行功能注釋，從中我們篩選了一些功能基因。根據(jù)對一個注釋結(jié)果為抗逆性基因JRD5680序列(2 369 bp)在美國國家生物技術(shù)信息中心(National center biolotechnology information，NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫上在線BLAST后，發(fā)現(xiàn)該基因序列編碼苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)，分別與白樺(Betulaplatyphylla)的1 308 bp(GenBank No.AKN79308.1)、蓖麻(Ricinuscommunis)的1 271 bp(GenBank No.AGY49231.1)、木薯(Manihotesculenta)的1 269 bp(GenBank No.AAK60275.1)等序列相似(鑒定度分別為87%，85%和85%)，說明核桃JRD5680可能與其非生物逆境抗性密切相關(guān)[16～17]。用Primer3分別對全長為2 369 bp的JRD5680序列設(shè)計了兩對引物，其中一對擴增效果好，數(shù)據(jù)分析采用了擴增效果好的序列片段。JRD5680序列的PCR擴增引物序列是通過上海生物工程公司(Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai)合成(F:TGGACATGGCTAGTGACTGG;R：TCCCTCTTGCCTACATTGC)2X Taq PCR Mix(0.1 U Taq polymerase,500 μmol·L-1dNTPs,20 mmol·L-1Tris-HCl,pH 8.3,3 mmol·L-1MgCl2,100 mmol·L-1KCl)購自潤德生物技術(shù)有限公司(RUNDE，西安)，牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)購自ProMEGA公司(Madison,Wisconsin,USA)。根據(jù)Zhao and Woeste[10]的PCR反應(yīng)基礎(chǔ)做了改進，即在25 μL的PCR擴增反應(yīng)體系中，含50 ng·μL-1模版DNA 2 μL，2X Taq PCR Mix 12.5 μL，引物正反向都為1.0 μL(10 μmol·L-1)，牛血清蛋白(BSA，0.5 mg·mL-1)2.5 μL，H2O 6 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；93℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min后置10℃保存。擴增產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后，將擴增產(chǎn)物送到上海生工生物工程有限公司進行測序。

表1 全國各地45個群體植物材料地理與樣品信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

對核桃265個個體的PCR擴增產(chǎn)物測序后，用軟件BioEditv.7.0.9對測序結(jié)果進行排列、比對和校正[18]。使用Dnasp 5.0軟件[19]分析核苷酸多態(tài)性(π)、單倍型個數(shù)(H)、單倍型多樣性(Hd)等遺傳多樣性指標(biāo)，將全部數(shù)據(jù)分為兩組進行分析：第一組，核桃群體材料，第二組全部樣本植物材料(核桃群體，以及外類群：包括胡桃屬野核桃40個群體，核桃楸2個群體，山核桃屬山核桃1個群體，黃杞屬黃杞1個群體)；對不同地理群體之間的基因流(Nm)進行估算，并對群體進行Tajima’s、Fu的中性檢驗，以確定目標(biāo)DNA序列在進化過程中是否遵循中性學(xué)說[20～21]；并利用該軟件對所有群體的動態(tài)擴張進行失配分布分析(Mismatch Distribution Analysis)[22]。利用軟件NETWORK 4.2.0.1基于最大簡約性原則的中間連接網(wǎng)法分析(Median-joining networks)，構(gòu)建單倍型間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖[23]。利用軟件ARELEQUIN 3.11中的AMOVA(Analysis of Molecular Variance)分析方法[24]分別檢測群體間和群體內(nèi)的遺傳變異。運用軟件STRUCTURE2.0[25]進行貝葉斯聚類分析，其中采用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)迭代(1 000 000)，重復(fù)運行10次，K值設(shè)置為2-7。利用在線軟件STRUCTURE HAVESTER計算最優(yōu)K值，并利用軟件DISTRUCT進行遺傳組分聚類圖繪制。運用運用軟件MEGA6.0溯祖理論推測單倍型間的親緣關(guān)系，構(gòu)建JRD5680序列單倍型的鄰接(Neighor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹[26]。應(yīng)用IBD(Isolation by Distance)軟件(http://ibdws.sdsu.edu/～ibdws/)中IBDWS方法[27]對群體遺傳距離與地理距離間的相關(guān)性及遺傳距離與海拔之間的相關(guān)性進行Mantel檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸多樣性分析

對所有樣品測序的265條序列用BioEdit5.0和MEGA6.0軟件進行排列、對比、校正，JRD5680序列片段長度為809 bp。全部序列GC核苷酸含量占總核苷酸的46.2%。根據(jù)Dnasp 5.0的分析結(jié)果表明，共有75個變異位點，包括1個單堿基變異位點，74個簡約信息位點，共30個單倍型，不存在插入缺失。全部樣本個體的單倍型多樣性(Hd)較高為0.482，不同地理分布的40個核桃群體的單倍型多樣性(Hd)較低為0.370(表2)。兩組的核苷酸多態(tài)性結(jié)果與單倍型多樣性的結(jié)果一致(核桃π=0.005 27、全部個體π=0.008 99)(表2)。用Dnasp5.0對群體植物材料的基因流分析發(fā)現(xiàn)，不同地理核桃群體間的基因流較大(Nm=0.34)，全部個體的基因流小(Nm=0.10)(表2)。遺傳分化系數(shù)FST，也表現(xiàn)出明顯的差異，其全部個體的FST值最大為0.885，其核桃群體材料遺傳分化系數(shù)最小，其FST值為0.435。

表2 核基因序列JRD5680的遺傳多樣性分析

圖1 核桃群體JRD5680序列單倍型地理分布及單倍型Network網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖 餅圖代表各單倍型在該群體中的分布比例，標(biāo)注框內(nèi)不同顏色代表不同的JRD5680序列單倍型，群體代碼同表1，單倍型網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖位于左下角。Fig.1 Geographical distribution of JRD5680 haplotypes and network of haplotype for 45 populations of J.regia Different patterns were assigned for each haplotype to the legend at the right side of the figure. Circumference size indicates that the number of each population. Population symbols are identified in Table1. The network of haplotype based on JRD5680 data were located in the lower left corner.

這些結(jié)果都表明不同種之間遺傳差異比較大。在群體水平上，45個居群中單倍型多態(tài)性最高的兩個群體分別為貴州遵義(YW)(Hd=0.929，π=0.008 88)與新疆省巴盲(BM)(Hd=0.773，π=0.009 79)。

2.2 基因譜系

2.2.1 單倍型及地理分布與網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

從單倍型地理分布圖可以看出，所有樣品具有的30個單倍型中有25個單倍型存在核桃群體中(Genbank No.KT820730～KT820759)，其余5個單倍型存在于外類群中(圖1)。核桃群體中頻率最高的單倍型為H6，除了貴州貴陽(GZ)與云南保山(BS)群體擁有獨特單倍型H1外，38個(95%)群體具有單倍型H6。單倍型H1主要分布于西南地區(qū)的5個群體中：四川南充(SC)、重慶石桂(SG)、貴州遵義(YW)、貴州貴陽(GZ)、貴陽南明(GY)、云南保山(BS)。此外，擁有單倍型最多的群體分別為新疆巴盲(BM，7個單倍型：H6、H7、H8、H17、H18、H19、H20)、陜西寧陜(NS，6個單倍型)、貴州遵義(YW，6個單倍型：H1-H6)、湖北龍山(LS，6個單倍型：)與湖南慈利(CL，6個單倍型)。比較遺傳分化系數(shù)GST與NST發(fā)現(xiàn)，NST值都明顯高于GST值，表明各群體間有明顯的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)(表2)。

單倍型網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖表明，核桃共有25個單倍型，其中單倍型H6為古老單倍型，其他單倍型都是有單倍型H6經(jīng)過一步或多步突變形成的，具有特有單倍型(圖1)。外類群中野核桃與核桃楸具有相同的單倍型H26；山核桃具有特有單倍型H28；黃杞具有獨特單倍型H29和單倍型H30。外類群的5種單倍型都是與核桃主流單倍型經(jīng)過2-5步突變而形成的，不同種之間不存在共有單倍型，且單倍型的頻率都比較低。核桃群體中單倍型H1位于網(wǎng)絡(luò)圖最外端，與其他群體分布的單倍型形成復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)關(guān)系(圖1)。

2.2.2 單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

以40個核桃(J.regia)、2個核桃楸、1個野核桃、1個山核桃及1個黃杞地理群體植物為材料，運用軟件Mega6.0構(gòu)建了核基因JRD5680序列最大鄰接樹(NJ)。結(jié)果表明：山核桃(單倍型H28)與黃杞(H29、H30)作為外類群分布位于系統(tǒng)發(fā)育樹的基部，各自為單系分支，自展支持率為99%。所有胡桃屬植物自成一支，自展支持率為53%。NJ樹的結(jié)果與單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)一致。野核桃(H26)與核桃楸的獨特單倍型H27分成兩小支。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

2.3.1 分子方差分析(AMOVA)

全國不同地理群體分子方差分析(AMOVA)見表3，群體間的遺傳變異為43.46%，群體內(nèi)的遺傳變異為56.54%，即全國不同地區(qū)核桃群體的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)。將外類群加入分子方差分析(AMOVA)分析時，結(jié)果表明，組間變異達(dá)到79.57%，群體間變異為8.90%，群體內(nèi)的變異為11.53%。說明利用JRD5680序列分組后的遺傳變異主要存在于不同物種之間。

2.3.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

運用Structure軟件對45個群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，K的取值范圍為2～7，運用Structure Harvester軟件確定最佳分組時發(fā)現(xiàn)，K的最佳分組為4，但K=3與K=4的結(jié)果相差不大。當(dāng)K=4時，發(fā)現(xiàn)外類群的遺傳結(jié)構(gòu)明顯與核桃不同，山核桃(ZJ)與黃杞(HQ)分為一組，野核桃(SM)與核桃楸(BXS與HLJ)的遺傳組分相似分為一組，核桃群體分為兩組，這與單倍型的分布一致(圖1)。遺傳結(jié)構(gòu)分析表明不同物種之間的遺傳差異比較大。40個核桃群體間遺傳差異不大，但貴州貴陽(GZ)、貴州遵義(YW)與云南保山(BS)三個群體明顯能與其他核桃群體分開，出現(xiàn)了較為明顯的遺傳分化(圖2)。

表3基于核基因序列JRD5680分子方差分析

Table3Analysisofmolecularvariance(AMOVA)forthepopulationsbasedonnuclearDNAJRD5680sequences

變異來源Sourceofvariation自由度df離差平方和Sumofsquares變異組成Variancecomponents變異比例PercentageofvariationP核桃J.regia群體間Amongpopulations39481.3730.9359143.46<0.001群體內(nèi)Withinpopulations436530.8771.2176156.54<0.001總體Total4751012.252.15352

圖2 基于抗旱基因核基因JRD5680序列的貝葉斯模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析a.超過10個重復(fù)估算出的數(shù)據(jù)的概率(△K)對K聚類分組的數(shù)據(jù)；(b)△K值的平均對數(shù)似然概率推斷不同群體遺傳結(jié)構(gòu)(K)的范圍從2～7；c.估計的遺傳聚類(K=3，K=4，K=5)，得到的遺傳結(jié)構(gòu)為256個個體，不同顏色代表不同遺傳組分，數(shù)字表示不同顏色遺傳成分所占比例，垂直線表示不同群體的分界標(biāo)識線。Fig.2 Results of the Bayesian model-based clustering structure analysis of 256 individuals of common walnut using drought relative nuclear marker JRD5680a. The probability of the data(△K) against the number of K clusters,calculated over 10 replicates; b. △K values from the mean log-likelihood probabilities from structure runs where inferred clusters(K) ranged from 2-7; c. Estimated genetic clustering(K=2,K=3,and K=4) obtained with the structure program for 256 individuals,colors represent the cluster are separating according to the population,and the black vertical line in the bar chart is the population identifier.

2.3.3 中性檢驗與失配分布

核桃群體與外類群兩組情況分別進行中性檢驗[23～24]結(jié)果表明：所有群體的Tajima’s D為不顯著負(fù)值(Tajima’sD=-1.101 9，P>0.10)，F(xiàn)u and Li’s D值與Fu and Li’s F均為正值(Fu and Li’sD=2.3420，P>0.10；Fu and Li’sF=0.759 0，P>0.10)。核桃40個群體中性檢驗結(jié)果表明：Tajima’s D為不顯著正值(Tajima’sD=0.270 8，P>0.10)，F(xiàn)u and Li’s D值為不顯著負(fù)值(Fu and Li’sD=-0.066 7，P>0.10)，F(xiàn)u and Li’sF為不顯著正值(Fu and Li’sF=0.093 2，P>0.10)，表明全國不同地區(qū)的群體均未經(jīng)過擴張事件。失配分布結(jié)果顯示：觀測值的曲線呈現(xiàn)為雙峰現(xiàn)象，也表明不同地理分布的核桃群體近期歷史上沒有經(jīng)歷擴張事件。

2.3.4 IBD分析

對中國核桃群體進行遺傳距離與地理距離(IBD)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者之間具有顯著地相關(guān)性(r=0.263 2；P=0.032 4*)，而對群體進行遺傳距離與海拔距離(IBD)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示不顯著相關(guān)性(r=0.012 4；P=0.668 9)，上述結(jié)果說明，中國不同地理核桃群體間的遺傳變異可能是由地理距離造成的。

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

遺傳多樣性主要包括同一群體不同個體之間、種內(nèi)不同群體之間遺傳變異的總和[1,28]。遺傳多樣性處于生物多樣性的核心地位，遺傳多樣性的高低，與植物與環(huán)境變化的適應(yīng)力相關(guān)。一些相關(guān)的參數(shù)如：單倍型多樣性、核苷酸多樣性都用來反應(yīng)遺傳多樣性，這些參數(shù)值越大，說明遺傳多樣性越高，基因的豐富度也就越高[1,29]。該研究采用一對可能具有抗逆功能的核基因JRD5680序列片段對核桃群體的單倍型多樣性為0.482，比葉綠體、線粒體、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的單倍型多樣性高。如秦嶺地區(qū)核桃的ITS序列分的單倍型多樣性為0.274，核桃楸葉綠體單倍型多樣性也很低，野核桃的葉綠體單倍型多樣性為0.796，美國白核桃的葉綠體單倍型多態(tài)性為0～0.317，表明核基因更適于做群體遺傳多樣性分析。核基因存在明顯的基因復(fù)制現(xiàn)象，非模式植物獲得核基因比較困難。但隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為非模式生物核基因的獲得提供可能。本文中JRD5680是從核桃轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中得到的，PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果來看，所獲得條帶與目的條帶大小一致，同時，Sanger測序得到的JRD5680序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，發(fā)現(xiàn)與白樺(Betulaplatyphylla)等物種的基因編碼序列(Coding sequence,cds)區(qū)域相似度很高，不存在四堿基以上的較大的間隔，說明我們所得到的序列不含內(nèi)含子，為苯丙氨酸解氨酶編碼區(qū)序列。同時，相對內(nèi)含子來說，外顯子更難發(fā)生突變，而核桃群體的JRD5680序列發(fā)生突變與其受到自然和人工選擇壓力有關(guān)。

從單倍型地理分布圖中可以明顯看出，核桃群體遺傳多樣性中心主要分布于秦嶺巴山地區(qū)(NS、HB與CL)、西南地區(qū)(YW)、太行山北部地區(qū)(DZ、HL)及新疆地區(qū)(BM)，且不同地區(qū)之間存在明顯地單倍型差異，僅共享主流單倍型H6(圖1)。這說明不同地區(qū)的地形、氣候因子復(fù)雜多變，尤其溫度與水份因子變化尤其劇烈，這些因素都有可能造成核桃群體適應(yīng)不同的環(huán)境演化出許多特有單倍型。同時，核桃栽培歷史已有6 800多年[1,30]，在長期人工馴化過程中，一些核桃品種產(chǎn)生了優(yōu)良的抗逆基因[31]，如抗旱[32]與耐鹽[32～33]等，由于商業(yè)活動及人為對核桃的傳播，導(dǎo)致栽培核桃群體與野生核桃群體之間長期的基因交流，這些也是中國主要核桃產(chǎn)區(qū)的群體遺傳多樣性較高的原因。中國核桃的主要栽培中心為新疆、陜西、河北和云南等省和地區(qū)[34]，本研究中遺傳多樣性較高的核桃群體(新疆巴盲、陜西寧陜、湖北宜昌、湖南慈利、貴州遵義、河北張家口及山東德州)也主要集中于上述四個地區(qū)(圖1)。這一結(jié)果與奚聲坷1987年將我國核桃的栽培實生群劃分為新疆、華北山地、秦巴山地、西藏高地四個地理生態(tài)型一致[35]。Structure軟件分析的遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)果發(fā)現(xiàn)貴州貴陽(GZ)、貴州遵義(YW)與云南保山(BS)三個群體與其他群體出現(xiàn)較明顯遺傳分化，這可能是由于該三個地區(qū)擁有自己獨特的單倍型H1的比例較高，從而導(dǎo)致遺傳結(jié)構(gòu)分為西南地區(qū)和其他地區(qū)兩大組。另外，西南地區(qū)核桃群體遺傳多樣性較高且原始單倍型H6分布頻率高，說明該地區(qū)也可能為核桃群體的遺傳多樣性起源中心之一。

3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳結(jié)構(gòu)指遺傳多樣性大小和在群體中的分布形式，通過物種群體間和群體內(nèi)的遺傳分化來實現(xiàn)[4]。遺傳分化可以通過基因流的大小來體現(xiàn)，基因流越大，群體間的遺傳分化越小；相反，基因流越小群體間的遺傳分化越大。除此之外，溫度、海拔、氣候、濕度等外部的因素也可能對遺傳結(jié)構(gòu)造成影響[4]。由于核基因JRD5680序列的NST值都明顯高于GST值，表明各群體間有明顯的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。同時，核桃種群IBD(Isolation by Distance)空間遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，地理隔離距離與遺傳距離之間也顯示兩者之間相關(guān)性顯著(r=0.263 2；P=0.032 4*)，說明該研究中不同地

圖3 基于核基因JRD5680序列的30個單倍型氨基酸序列變異位點Fig.3 The amino acid sequence variation sites based on nuclear gene JRD5680 sequences of 30 haplotypes

理分布核桃群體間存在著明顯地理隔離效應(yīng)。利用軟件ArcGIS進行遺傳分析結(jié)果也顯示，核桃群體在JRD5680位點下的生物地理分布格局呈現(xiàn)地域性分布特點(圖1)。而遺傳距離與海拔梯度之間不存在顯著相關(guān)性(R=0.012 4；P=0.668 9)，這說明核桃群體間不存在海拔梯度的遺傳變異。AMOVA分析結(jié)果表明不同物種之間的遺傳變異比較大(79.57%)，核桃群體間與群體內(nèi)遺傳變異大小相當(dāng)(表3)。Hamrick[36]等研究發(fā)現(xiàn)廣布種、壽命較長的多年生木本、異交風(fēng)媒物種的群體間分化程度均小于其他物種。核桃為廣布種，多年生木本，風(fēng)媒傳粉，花粉傳播的距離較遠(yuǎn)，導(dǎo)致群體之間分化程度較小，這符合HamricK的結(jié)論。核桃群體遺傳組分可分為兩組，即西南地區(qū)與其他地區(qū)核桃群體分為開(圖2)，其中，云南寶山(BS)群體僅有單倍型H1，這說明，核桃可能在西南地區(qū)長期適應(yīng)形成自己特有單倍型H1，這也可能與該地區(qū)適應(yīng)環(huán)境有關(guān)。

3.3 核DNA基因片段JRD5680核桃進化歷史分析

核基因片段JRD5680序列單倍型網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(Network)與鄰接樹(NJ)均表明了核桃與其他幾個外類群植物(核桃楸、野核桃、山核桃、黃杞)并無共享的單倍型，表明不同種之間的遺傳差異比較大，該核基因序列可用于胡桃科不同屬間系統(tǒng)分類與物種分化方面的研究。同時，胡桃屬植物中核桃與另外兩個外類群核桃楸和野核桃也可以明顯分開，沒有共享單倍型的現(xiàn)象，核桃楸和野核桃共享單倍型H28，說明核桃楸與野核桃親緣關(guān)系比較近。這個結(jié)果支持核桃(J.regia)屬于核桃組(Sect.Juglans)，核桃楸、野核桃歸屬于核桃楸組(Sect.Cardiocaryon)的結(jié)論[35～37]。

單倍型H6為主流單倍型廣泛分布在核桃中，其他單倍型與單倍型H6之間存在較為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)進化關(guān)系。造成這種現(xiàn)象的原因，一方面可能與核桃的動態(tài)歷史有關(guān)。本研究中，中性檢驗、失配分布分析結(jié)果都表明核桃在演化的過程中沒有明顯的擴張現(xiàn)象，可能在各地理區(qū)域內(nèi)由于當(dāng)?shù)剡m應(yīng)(local adaption)、自然選擇及突變形成多個頻率較低的單倍型。另一方面，由于該研究采用核基因?qū)儆陔p親遺傳，位點間存在重組和雜合性，可能導(dǎo)致網(wǎng)狀進化的存在(圖1)。植物中nrDNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)由于進化速率較快，提供了較多的遺傳進化信息，研究學(xué)者利用該序列進行了群體進化方面的研究[38～39]。JRD5680這個基因植物形成次級代謝中起到重要作用，對植物生長發(fā)育、抗病、抗旱、抗寒等方面具有重要意義和價值[16～17]，而這些適應(yīng)性會對物種的遺傳多樣性造成影響，導(dǎo)致群體的遺傳分化。利用NCBI數(shù)據(jù)對該基因進行氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)核桃及外類群中的不同單倍型序列也引起了氨基酸的變異(圖3)。因此，這種功能上的差異可能與物種之間的分化及其環(huán)境適應(yīng)有著密切相關(guān)。在物種分化過程中，由于選擇或者功能不同，可能導(dǎo)致相應(yīng)的種間基因流和遺傳分化不同。這些結(jié)果對中國不同地理群體核桃的遺傳多樣性及種質(zhì)資源保護和利用提供一定的理論依據(jù)。

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SequenceAnalysisofNuclearDNAJRD5680forDeterminingGeneticDiversityandGeneticStructureAnalysisofCommonWalnut(JuglansregiaL.)

ZHANG Tian WANG Ma-Li ZHAO Peng*

(College of Life Sciences,Northwest University,Xi’an 710069)

We studied the genetic diversity and population genetic structure of 265 individuals from different regions of China by using the roles of phenylalanine ammonia-lyase(PAL) nuclear geneJRD5680 DNA sequence of 40 common walnut(Juglansregia) and 5 out group plant species. The length ofJRD5680 sequence was 809 bp, the content of G+C was 46.2% with 74 information sites. A total of 30 haplotypes, haplotype diversity variation showed low genetic diversity(Hd=0.370,π=0.005 3). There is a clear geographical structure(NST>GST), which is a regional distribution pattern. The spatial genetic structure analysis showed that the correlation between geographical isolation and genetic distance was significant(r=0.263 2;P=0.032 4*), and there was obvious geographical isolation effect among different geographic populations. The results of comprehensive mismatch analysis and neutral test can be deduced from the recent history of the different regions of the population expansion event. From the genetic structure, the walnut population can be divided into two groups(southwest and other regions). By AMOVA, the genetic variation among the populations was mainly stored in the populations(56.54%), and the genetic differentiation among the populations was higher(FST=0.885). The total of 5 species of Juglandaceae could be a single branch, and theJRD5680 sequence might be with high molecular identification radio in the members of the Juglandaceae.

Juglansregia;phenylalanine ammonia-lyase(PAL) gene;genetic diversity;genetic structure

國家自然科學(xué)基金項目(31200500；41471038)；陜西省教育廳重點實驗室科研計劃(13JS094)

張?zhí)?1989—)，女，碩士研究生，主要是從事植物分子生態(tài)學(xué)研究。

2015-10-27

S664.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.012