花生Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析

石 磊 苗利娟 齊飛艷 張忠信 高 偉 孫子淇 黃冰艷 董文召湯豐收 張新友

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所 / 農(nóng)業(yè)部黃淮海油料作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河南省油料作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 花生遺傳改良國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 河南鄭州 450002

花生Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析

石 磊 苗利娟 齊飛艷 張忠信 高 偉 孫子淇 黃冰艷 董文召湯豐收 張新友*

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所 / 農(nóng)業(yè)部黃淮海油料作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河南省油料作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 花生遺傳改良國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 河南鄭州 450002

Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶(SAD)是決定植物體內(nèi)飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比值的關(guān)鍵酶。以花生品種豫花9326基因組DNA為模板, 通過基因組步移技術(shù), 克隆到花生Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶基因(AhSAD)起始密碼子ATG上游720 bp片段, 利用5′ RACE方法獲得了該基因的5′ UTR序列, 通過序列比對(duì)確定720 bp片段為AhSAD啟動(dòng)子區(qū)域。PLACE在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析表明, 該序列具有真核生物啟動(dòng)子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box, 含有多個(gè)與光誘導(dǎo)和激素響應(yīng)相關(guān)順式序列元件。將AhSAD啟動(dòng)子片段替換pBI121質(zhì)粒中的CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下游GUS基因表達(dá), 構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI-PAhSAD。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥和在花生不同組織中瞬時(shí)表達(dá), 利用GUS組織化學(xué)染色研究其表達(dá)特性。表明在擬南芥和花生受體中, AhSAD啟動(dòng)子主要調(diào)控下游基因在根、莖、葉片和子葉中表達(dá), 在花生的果針中也檢測(cè)到GUS活性; 擬南芥的莖生葉只有葉脈中具有GUS活性, 而花生整個(gè)葉片中都具有GUS活性。

花生; Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶基因(SAD); 啟動(dòng)子; 基因組步移; GUS報(bào)告基因

花生是國(guó)產(chǎn)植物油的重要來源?；ㄉ竞考s占籽仁干重的 50%, 其中不飽和脂肪酸油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)約占脂肪酸含量的80%。油酸是人們?nèi)粘z入最多的單不飽和脂肪酸, 約占單不飽和脂肪酸總攝入量的 90%[1], 油酸可以選擇性地抑制低密度脂蛋白升高, 而不影響高密度脂蛋白,低密度脂蛋白使人體內(nèi)膽固醇增加, 高密度脂蛋白降低身體組織內(nèi)的膽固醇, 降低冠心病及動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn), 高油酸花生還可以改善血脂和血糖, 并且具有更低的致敏性, 油酸還具有抗炎特性并且可以激活多種免疫細(xì)胞[2-4], 因此食用高油酸花生油更有益于健康[5]。油酸比亞油酸少一個(gè)雙鍵, 根據(jù)不同的檢測(cè)方法其氧化穩(wěn)定性比亞油酸高 3.4~14.5倍,這導(dǎo)致高油酸花生及其制品不易氧化和腐敗, 貨架期更長(zhǎng), 并且具有更好的風(fēng)味[5-8]。油酸的這些優(yōu)點(diǎn)決定了油脂的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及氧化穩(wěn)定性, 因此油酸含量或油酸與亞油酸的比值(油亞比, O/L)成為評(píng)價(jià)不同花生品種(油)商品性的重要生化指標(biāo)。培育高油酸花生品種已成為世界花生遺傳改良的重要目標(biāo), 闡明花生高油酸形成的分子機(jī)制具有重要意義。

Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶(SAD)是一種存在于質(zhì)體基質(zhì)中的可溶性脂肪酸脫氫酶, 通過在脂肪酸鏈的C9和C10之間引入一個(gè)雙鍵催化硬脂酰-ACP脫飽和生成油酰-ACP, 決定了植物油脂中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例[9]。目前, 在擬南芥[10]、花生[11]、大豆[12]、油菜[13]、小桐子[14]、冬性小麥[15]、水黃皮[16]、油樟[17]、銀杏[18]、椰子[19]、亞麻籽[20]、亞麻[21-22]等多種植物中克隆到了SAD基因。SAD屬于一個(gè)小的基因家族[10, 13-17, 23], 不同成員之間的表達(dá)模式及功能也有差異[10, 17, 23-25], SAD在多種植物發(fā)育的種子中表達(dá)量高于其他組織, 并隨著種子發(fā)育其表達(dá)量呈鐘型變化[16, 19-20, 22, 26-27]。利用RNAi沉默棉花SAD, 硬脂酸含量從正常的 2%~3%上升到 40%, 同時(shí)伴隨棕櫚酸、油酸、亞油酸含量的降低[28]。擬南芥 SAD突變也會(huì)導(dǎo)致硬脂酸含量從野生型的 0.8%增加到 14.3%, 同時(shí)伴隨棕櫚酸及油酸含量的減少[29], 而過表達(dá) SAD6會(huì)導(dǎo)致擬南芥硬脂酸含量降低和油酸含量升高, 而重新干擾SAD6后, 表型又恢復(fù)至野生型[25]。將馬鈴薯SAD轉(zhuǎn)入煙草, 同樣提高了葉片和種子中不飽和脂肪酸含量[30]。

很多高等植物通過基因復(fù)制、多倍體化等機(jī)制使維持生長(zhǎng)、發(fā)育等基本生物學(xué)過程的關(guān)鍵基因以多拷貝形式存在, 不同拷貝之間的功能或表達(dá)模式逐漸發(fā)生變化[31], 啟動(dòng)子功能分析可以精確定位基因的表達(dá)部位、發(fā)育階段和調(diào)控機(jī)制, 預(yù)測(cè)基因的功能, 另外內(nèi)源啟動(dòng)子也是植物基因工程中表達(dá)載體的重要元件, 根據(jù)不同目的需要各種不同類型的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中定時(shí)、定位表達(dá)。因此啟動(dòng)子序列的功能研究對(duì)于闡明基因功能及植物基因工程都具有非常重要的意義。

雖然有學(xué)者在花生中克隆了SAD并進(jìn)行了表達(dá)模式分析[11, 24], 但還未見有關(guān)AhSAD啟動(dòng)子的克隆與功能分析的報(bào)道。本研究通過基因組步移技術(shù)克隆了 AhSAD上游 720 bp的核苷酸序列, 并分析了AhSAD啟動(dòng)子序列特點(diǎn)及順式作用元件, 構(gòu)建了該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體pBI121-PAhSAD。通過轉(zhuǎn)基因擬南芥及花生不同組織的瞬時(shí)表達(dá), 初步研究了 AhSAD啟動(dòng)子的功能,以期為闡明AhSAD的功能特征及進(jìn)一步明確花生高油酸形成的分子機(jī)制提供理論參考, 同時(shí)也為花生品質(zhì)改良基因工程提供新的調(diào)控元件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 花生(Arachis hypogaea L.)品種豫花9326由本課題組選育, 正常季節(jié)種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地, 轉(zhuǎn)基因受體為擬南芥Columbia生態(tài)型, 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 農(nóng)桿菌菌株 GV3101、植物表達(dá)載體pBI121由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌JM109感受態(tài)、pMD18-T克隆載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 試劑 GenomeWalker Universal Kit、SMARTer RACE cDNA amplification Kit購(gòu)自Clontech公司; 植物DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司; 各種限制性內(nèi)切酶、連接酶、LA Taq、Pfu Taq等購(gòu)自TaKaRa公司; RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司, Prime-Script RT Reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司, SYBR PCR Master Mix Kit購(gòu)自羅氏(Roche, Swiss), PCR引物合成及DNA測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成;其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 AhSAD基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

按照RNA提取試劑盒說明提取花生根、莖、葉、果針、種衣及花后30、40、50、60、70和80 d種子的總 RNA, 按照試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 以獲得的cDNA第1鏈為qRT-PCR模板, 花生ADH3作為內(nèi)參基因[32], 測(cè)定 AhSAD 的相對(duì)表達(dá)量?；贏hSAD 序列(AF172728.1)設(shè)計(jì) qRT-PCR 引物AhSAD-RT-F (5′-CCTAACCCTTCACAGAAGCT-3′) 和AhSAD-RT-R (5′-TCAGCCCAACCCTCTAACGA-3′)。ADH3 qRT-PCR引物為ADH3-RT-F (5′-GACG CTTGGCGAGATCAACA-3′)和ADH3-RT-R (5′-AAC CGGACAACCACCACATG-3′)[32]。擴(kuò)增體系10 μL, 含1 μL cDNA、5 μL 2 ×LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Swiss)、10 μmol L–1正向引物和反向引物各0.5 μL、3 μL ddH2O。用羅氏LightCycler 480 II Real-time PCR System (Roche, Swiss)進(jìn)行qRT-PCR, 反應(yīng)條件為95℃ 10 min; 95 ℃ 10 s , 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔(技術(shù)重復(fù)), 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2–ΔΔCt法分析相對(duì)表達(dá)量, 并計(jì)算3次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.3 AhSAD啟動(dòng)子的克隆

按照植物 DNA提取試劑盒操作說明提取花生葉片基因組DNA。按照基因組步移試劑盒操作說明(增加了Sma I內(nèi)切酶)進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增克隆AhSAD啟動(dòng)子。詳細(xì)步驟如下: 經(jīng)分光光度計(jì)、Dra I內(nèi)切酶酶切和凝膠電泳檢測(cè), 將DNA稀釋至0.1 μg μL–1,分別取25 μL DNA經(jīng)Dra I、EcoR V、Pvu II、Stu I、Sma I內(nèi)切酶酶切, 回收純化后溶于20 μL TE緩沖液(pH 7.5)中。分別取4 μL純化后的TE緩沖液, 連接接頭(5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGC GTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3′), 構(gòu)建5個(gè)不同的DNA庫(kù)(LD、LE、LP、LSt、LSm), 用作基因組步移第 1輪 PCR模板。基于 AhSAD序列(AF172728.1)信息, 在該序列的5′端設(shè)計(jì)2個(gè)3′端特異性巢式PCR引物GSP1 (5′-CCATGCGGAACCTT GGAGATCTGAGG-3′)和GSP2 (5′-GAAGGGTTAG GGTTCAGCCTCAGAGCCAT-3′)。分別以5個(gè)DNA庫(kù)為模板, 以GSP1和AP1 (5′-GTAATACGACTCAC TATAGGGC-3′)為引物進(jìn)行第 1輪擴(kuò)增, 擴(kuò)增體系10 μL, 含模板DNA 0.2 μL、10×LA-PCR緩沖液II (Mg2+plus) 1 μL、2.5 mmol L–1dNTPs混合物1.6 μL、10 μmol L–1GSP1 0.5 μL、AP1 (10 μmol L–1) 0.5 μL、LA Taq (5 U μL–1) 0.1 μL。ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1 min; 98℃變性10 s, 72℃退火6 min, 7個(gè)循環(huán); 98 ℃ 變性10 s, 67℃退火6 min, 33個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍, 取0.2 μL作為第2輪PCR模板, 以GSP2 和AP2 (5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′)為引物進(jìn)行第2輪PCR, 擴(kuò)增體系及條件同第1輪。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 切膠回收, 并克隆到pMD18-T載體上測(cè)序。

1.4 RNA提取及5′非翻譯區(qū)序列(5′ UTR)的克隆

用RNA提取試劑盒提取葉片、花后30、40和60 d種子的總RNA, 經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量和分光光度計(jì)定量后, 等量混合。用SMARTer RACE cDNA amplification kit提供的試劑和方法進(jìn)行 5′RACE第1鏈cDNA的合成, 反應(yīng)體系含0.5 μg RNA 和1.0 μL 5′-CDS Primer A, ddH2O補(bǔ)齊至3.75 μL, 72℃溫浴3 min, 42℃溫浴2 min。加入1 μL SMARTer IIA oligo、2.0 μL 5×First-Strand緩沖液、1.0 μL DTT (20 mmol L–1)、1.0 μL dNTPs混合物(10 mmol L–1)、0.25 μL核糖核酸酶抑制劑(40 U μL–1)、1.0 μL SMARTscribe逆轉(zhuǎn)錄酶(100 U), 42℃溫浴 90 min, 70℃溫浴 10 min終止反應(yīng), 加入 20 μL Tricine-EDTA 緩沖液, 混勻, 完成構(gòu)建 5′-RACE-Ready cDNA。以5′-RACE-Ready cDNA為模板, GSP1和UPM (5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGC AGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)為引物, 進(jìn)行第 1 輪PCR擴(kuò)增, 除退火時(shí)間改為1 min外, 擴(kuò)增體系及條件同AhSAD啟動(dòng)子步移PCR。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍, 取0.2 μL作為第2輪PCR模板, 以GSP2和NUP (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GT-3′)為引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增, 擴(kuò)增體系和條件同第1輪。以1%瓊脂糖電泳檢測(cè)第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 切膠回收, 并克隆到pMD18-T載體上測(cè)序。

1.5 AhSAD啟動(dòng)子序列分析

利用植物啟動(dòng)子在線分析網(wǎng)站 PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和 plantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)分析可能的順式作用元件。

1.6 AhSAD啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)基因組步移獲得的DNA序列, 設(shè)計(jì)帶有保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)的引物AhSAD-P-S (5′-CAGAAG CTT(Hind III)GGTACC(Kpn I) AAATTTTGAGTAT CATTTTAGTAATAG-3′)和 AhSAD-P-A (5′-GACAT CTAGA(Xba I)TTTTCGTGTTGCGTCTTC-3′), 以花生基因組DNA為模板, 用Pfu Taq進(jìn)行AhSAD啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增, 回收純化產(chǎn)物, 經(jīng)Hind III和Xba I雙酶切后, 用T4 DNA連接酶連接到經(jīng)Hind III和Xba I雙酶切的pBI121質(zhì)粒上, 替換CaMV35S構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pBI-PAhSAD, 過程如圖1所示。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài), 通過PCR擴(kuò)增、酶切及測(cè)序(pBI121-S: 5′-GGAATTGTGAGCGGATAAC-3′; pBI121-A: 5′-GCCCGGCTTTCTTGTAAC-3′)鑒定陽(yáng)性克隆。提取質(zhì)粒, 以凍融法轉(zhuǎn)化 pBI-PAhSAD和pBI121至農(nóng)桿菌中, 鑒定陽(yáng)性克隆, 保存于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 植物表達(dá)載體構(gòu)建過程Fig.1 Flow chart for construction of the plant expression vector

1.7 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥及花生各組織

利用農(nóng)桿菌花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)化前1 d澆足水分, 剪去果莢; 農(nóng)桿菌離心后用 5%的蔗糖溶液重新懸浮, 加入終濃度為0.02% Silwet-77, 花序于蔗糖懸浮的農(nóng)桿菌菌液中浸泡50 s, 用保鮮膜包裹植株, 22℃避光培養(yǎng)24 h, 取下保鮮膜, 1周后進(jìn)行第2次侵染。種子成熟后, 室溫干燥, 于 4℃冰箱保存。T1代種子經(jīng)75%的乙醇消毒3 min, 0.01%的升汞消毒3 min, 無(wú)菌水漂洗5~7次, 播種于含50 mg L–1卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上。4℃暗培養(yǎng)3 d, 轉(zhuǎn)入22 ℃ 16 h光照/20℃ 8 h黑暗的植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱, 篩選抗性植株。以 CTAB法提取抗性苗幼嫩葉片基因組DNA, 用引物AhSAD-P-S和AhSAD-P-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性植株, 分別以野生型擬南芥 DNA和pBI-PAhSAD載體為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化花生根、莖、葉、果針、種子、子葉等組織, 進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。農(nóng)桿菌菌液的處理方法同轉(zhuǎn)化擬南芥的處理方法, 取花生各組織浸泡其中10 min, 無(wú)菌水沖洗2次, 于MS培養(yǎng)基上, 28℃避光培養(yǎng)2 d。

1.8 AhSAD啟動(dòng)子功能分析

用GUS組織化學(xué)染色分析方法驗(yàn)證AhSAD啟動(dòng)子的功能。取擬南芥陽(yáng)性苗和農(nóng)桿菌侵染后的花生不同組織, 放入GUS染色液中(X-gluc 0.5 g L–1, 50 mmol L–1pH 7.0磷酸緩沖液, 10 mmol L–1EDTA, 0.5 mmol L–1鐵氰化鉀, 0.5 mmol L–1亞鐵氰化鉀, 0.01% Triton X-100, 20%甲醇), 抽真空10 min, 37℃溫育過夜。用乙醇乙酸混合液(體積比為 1∶1)將綠色組織脫色至無(wú)色, 分別用75%、50%、25%的乙醇洗滌3次, 用蒸餾水洗滌數(shù)次, 顯微鏡或相機(jī)照相、保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhSAD基因組織表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明, AhSAD基因在上述組織中均有表達(dá), 且表達(dá)量存在組織差異性, AhSAD在不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)量最高, 果針中的表達(dá)量最低(圖2)。AhSAD相對(duì)表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期的種子中存在明顯差異, 隨著種子發(fā)育呈鐘型變化, 在花后 70 d的種子中表達(dá)量達(dá)到最高值,是花后30 d種子中的4.35倍, 隨著種子的成熟, 表達(dá)量下降, 這暗示AhSAD可能在種子發(fā)育過程中起重要作用。

圖2 AhSAD基因在不同花生組織和發(fā)育時(shí)期種子中的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Expression of AhSAD in various peanut tissues and various development stage seeds DAF: days after flowering.

2.2 AhSAD啟動(dòng)子的克隆

利用基因組步移法, 以AhSAD特異性引物為起點(diǎn)經(jīng)2輪PCR擴(kuò)增, 在豫花9326基因組DNA構(gòu)建的LD和LE庫(kù)中獲得了明顯的特異性條帶(圖3), 切膠回收較大的LD庫(kù)的PCR產(chǎn)物, 并連接到T載體pMD18-T中測(cè)序。結(jié)果表明PCR產(chǎn)物堿基數(shù)目785 bp, 在序列的5′端查找到了接頭的部分序列和Dra I(識(shí)別序列 TTT|AAA)酶切后的 AAA殘基序列, 在3′端查找到了GSP2引物序列和AhSAD 5′UTR的部分序列(圖5)。去除接頭的部分序列, 獲得了起始密碼子ATG上游720 bp的堿基序列。

2.3 AhSAD 5′UTR的克隆

圖3 基因組步移擴(kuò)增AhSAD基因啟動(dòng)子電泳圖Fig.3 PCR products of AhSAD promoter by the genomic walking method

利用構(gòu)建的花生幼葉、花后30、40和60 d種子的混合全長(zhǎng) cDNA文庫(kù)進(jìn)行 5′RACE, 克隆到了AhSAD的特異性擴(kuò)增片段(圖4)。連接到pMD18-T載體測(cè)序, 證明該序列為AhSAD的5′UTR序列。去除序列中5′RACE接頭堿基, 從GSP2引物到可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)長(zhǎng)度為 167 bp, 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子ATG上游–138 bp處(圖5)。通過和基因組步移獲得的AhSAD啟動(dòng)子序列比對(duì), 該序列完全位于AhSAD啟動(dòng)子的3′端, 證明獲得的啟動(dòng)子序列并不是 AhSAD位于ATG上游的內(nèi)含子區(qū)域, 確定是AhSAD啟動(dòng)子序列。

2.4 AhSAD啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

圖4 AhSAD基因5′RACE瓊脂糖電泳圖Fig.4 Agarose electrophoresis image of AhSAD 5′RACE M: DL 2000 DNA marker; 1: 5′RACE PCR產(chǎn)物。

應(yīng)用在線軟件 PLACE和 plantCARE對(duì)花生AhSAD啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明, 在AhSAD啟動(dòng)子區(qū)有4個(gè)可能的真核生物RNA聚合酶II結(jié)合位點(diǎn)TATA-box, 5個(gè)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的CAAT-box (圖5)。并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)的順式作用元件, 其中有1個(gè)響應(yīng)病原菌及鹽誘導(dǎo)的作用元件GT1GMSCAM4 (GAAAAA), 5個(gè)光響應(yīng)相關(guān)元件, 分別是–10PEHVPSBD、GATABOX、GT1CONSENSUS、GT1CORE和GT1CONSENSUS, 1個(gè)水楊酸誘導(dǎo)的WRKY結(jié)合位點(diǎn)WBOXATNPR1, 1個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)CCA1ATLHCB1, 1個(gè)激素應(yīng)答相關(guān)位點(diǎn)ARFAT。該序列還有1個(gè)葉肉組織表達(dá)特異性元件CACTFTPPCA1 (YACT), 1個(gè)增強(qiáng)種子特異性表達(dá)元件EBOXBNNAPA (CANNTG), 1個(gè)增強(qiáng)基因表達(dá)的順式元件CT-rich motif (TCTCTCTCT)。這些作用元件對(duì)AhSAD啟動(dòng)子的功能可能起重要作用。

圖5 AhSAD基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析Fig.5 Bioinformatics analysis of DNA sequence of AhSAD promoter

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及組織化學(xué)染色

以基因組DNA為模板, PCR擴(kuò)增獲得AhSAD啟動(dòng)子序列(圖6), 構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI-PAhSAD, 經(jīng)Hind III和Xba I雙酶切及測(cè)序鑒定正確后, 以凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。采用花序浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0, 獲得T1代種子。用50 mg L–1Kan篩選T1代種子, 獲得近百株抗性苗, 通過PCR檢測(cè)和GUS染色顯示, 抗性苗絕大多數(shù)為陽(yáng)性苗。選取9株進(jìn)行T2代種子的Kan篩選追蹤, 發(fā)現(xiàn)6個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因株系綠苗和黃化苗的比例接近 3∶1, 初步認(rèn)為這6個(gè)株系是以單拷貝的形式整合到擬南芥基因組中的。

取上述6個(gè)株系的T3代轉(zhuǎn)基因植株幼苗及不同組織進(jìn)行GUS染色, 確定啟動(dòng)子的表達(dá)特性, 染色結(jié)果如圖7所示。在子葉期轉(zhuǎn)基因植株幼苗的子葉為藍(lán)色, 根部不能被染色; 幼苗期子葉、蓮座葉和根部都被染成藍(lán)色, 隨著苗齡的增加, 顏色有所變淺,主要集中在主根及葉脈處, 幼嫩的根部不能被染色;進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后, 擬南芥的莖被染成藍(lán)色, 在莖生葉中只有主葉脈被染成藍(lán)色; 進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后,擬南芥種子中的胚被染成藍(lán)色。

圖6 AhSAD基因啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增Fig.6 PCR amplification result of AhSAD promoter

對(duì)農(nóng)桿菌侵染后的花生根、莖、葉、果針、種子和子葉進(jìn)行GUS染色, 如圖8所示, 陰性對(duì)照花生的各個(gè)組織沒有被染色。轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照pBI121載體的花生各個(gè)組織都被染成了藍(lán)色, 說明花生根、莖、葉、果針、種子和子葉中的GUS基因都可以被CaMV35S組成型啟動(dòng)子激活表達(dá)。轉(zhuǎn)化載體pBI-PAhSAD花生的根、莖、葉、果針、種子和子葉都被染成藍(lán)色, 除葉片的顏色比 CaMV35S驅(qū)動(dòng)的葉片顏色更藍(lán)外, 其他組織與 CaMV35S驅(qū)動(dòng)的GUS基因的表達(dá)接近, 說明載體pBI-PAhSAD能夠驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在花生的根、莖、葉、果針、種子和子葉中表達(dá)。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS組織化學(xué)染色Fig.7 Histochemical GUS assay of transgenic Arabidopsis

圖8 花生不同組織的GUS組織化學(xué)染色Fig.8 Histochemical GUS assay of different tissues of peanut

3 討論

基因在植物中的富集表達(dá)部位與其功能密切相關(guān), 為了研究花生 Δ9-硬脂酰-ACP脫飽和酶基因的功能, 首先通過熒光定量PCR分析該基因的表達(dá)模式, 其在種子中的表達(dá)量較高, 表達(dá)量隨著種子的發(fā)育呈鐘型分布, 在根、莖、葉、果針和種衣中也均有表達(dá), 與目前克隆到的其他物種SAD基因表達(dá)模式相似[16, 19-20, 22-23, 26-27], 說明該基因表達(dá)模式具有一定的保守性, 推測(cè)其功能也具有保守性。利用基因組步移技術(shù)和PCR方法克隆得到AhSAD基因5′側(cè)翼序列, 雖然在其他物種未發(fā)現(xiàn)該基因存在位于起始密碼子ATG上游非編碼區(qū)中的內(nèi)含子, 鑒于花生脂肪酸合成途徑中的一些基因存在該類內(nèi)含子且片段較長(zhǎng), 如AhFAD2-1[33]、AhFAD2-2和AhFAE (未發(fā)表數(shù)據(jù)), 為驗(yàn)證獲得的序列是否為內(nèi)含子序列,本研究通過5′ RACE技術(shù)獲得了該基因的5′非編碼區(qū)序列, 通過與基因組步移獲得序列比對(duì), 證明獲得的序列為啟動(dòng)子序列。啟動(dòng)子序列中調(diào)控元件的種類、數(shù)量以及彼此的順序和距離都可能影響下游基因的轉(zhuǎn)錄。序列分析表明, 除了 TATA-box和CAAT-box基本順式作用元件外, 還含有生物脅迫和非生物脅迫的作用元件, 以及增強(qiáng)種子特異性表達(dá)的元件。通過GUS組織化學(xué)染色, 表明該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥和瞬時(shí)表達(dá)的花生組織中都能啟動(dòng)GUS的正確表達(dá), 兩者的表達(dá)模式基本一致, 并且在種子中的染色較深, 說明該啟動(dòng)子在種子中表達(dá)量較大, 這與花生 AhSAD的表達(dá)模式基本一致, 證明克隆到的啟動(dòng)子具備執(zhí)行功能的基本元件, 推測(cè)該基因?qū)ㄉN子中的油酰-ACP的合成與積累起重要作用。SAD通過催化硬脂酰-ACP的氧化與多種植物生命活動(dòng)密切相關(guān), 如增強(qiáng)低溫耐受性[34]、增加抗病能力及調(diào)控植物生長(zhǎng)[17], 這與該啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)的多個(gè)生物脅迫、非生物脅迫、病原菌及鹽誘導(dǎo)的作用元件相一致, 對(duì)這些順式作用元件的深入研究有助于了解該啟動(dòng)子的具體作用, 具有實(shí)際意義。

鑒于花生遺傳轉(zhuǎn)化周期比較長(zhǎng), 轉(zhuǎn)化效率較低,研究中經(jīng)常選擇模式植物擬南芥和煙草來分析啟動(dòng)子的表達(dá)模式, 如通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得的根特異性表達(dá)基因 Asy, 其啟動(dòng)子在擬南芥和煙草中呈現(xiàn)根特異性表達(dá)[35]; 在花生胚中特異性表達(dá)的油體蛋白AhOleo17.8基因[36], 其啟動(dòng)子在擬南芥中驅(qū)動(dòng)GUS在胚和胚根中都有表達(dá), 這可能是花生熒光定量過程中對(duì)根的取樣沒有包含胚根的結(jié)果, 也可能是該啟動(dòng)子在花生和擬南芥中的功能存在差異引起的。相同啟動(dòng)子在不同受體中的表達(dá)模式也有差異, 如煙草絨氈層特異性啟動(dòng)子pTA29在煙草中特異性地在絨氈層中表達(dá), 而在棉花的葉片表皮毛和花粉中也檢測(cè)到了GUS活性[37]; 擬南芥PABP5啟動(dòng)子在擬南芥的絨氈層、花粉、胚珠中表達(dá)[38], 與擬南芥不同, 在煙草受體的柱頭中也檢測(cè)到了GUS活性[39]。因此盡管本研究中花生硬脂酰-ACP脫飽和酶基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥和花生的瞬時(shí)表達(dá)模式與熒光定量結(jié)果一致, 要明確該啟動(dòng)子的功能及作用元件如何調(diào)控啟動(dòng)子仍需在轉(zhuǎn)基因花生中進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過基因組步移技術(shù)克隆了花生AhSAD基因5′側(cè)翼序列, 該序列長(zhǎng)度為720 bp, 含有TATA-box和CAAT-box等順式作用元件。AhSAD啟動(dòng)子在根、莖、葉片和種子中啟動(dòng)GUS的優(yōu)勢(shì)表達(dá)。

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Cloning and Functional Analysis of Peanut Δ9-Stearoyl-Acyl Carrier Protein Desaturase Promoter

SHI Lei, MIAO Li-Juan, QI Fei-Yan, ZHANG Zhong-Xin, GAO Wei, SUN Zi-Qi, HUANG Bing-Yan, DONG Wen-Zhao, TANG Feng-Shou, and ZHANG Xin-You*

Industrial Crops Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Oil Crops in Huanghuaihai Plains, Ministry of Agriculture / Henan Provincial Key Laboratory for Oil Crops Improvement, Zhengzhou 450002, China

The Δ9-stearoyl-acyl carrier protein desaturase (SAD) plays key roles in determining the ratio of saturated to unsaturated fatty acids in higher plants.The 720 bp 5′ flanking sequence of peanut SAD (AhSAD) gene was isolated from the genomic DNA of peanut cultivar Yuhua 9326 by nested PCR using genomic walking method.The fragment of 5′ UTR was obtained using 5′ RACE (Rapid Amplification of cDNA End), confirming that the 720 bp 5′ flanking sequence is promoter fragment based on sequence alignments.Bioinformatics analysis indicated that AhSAD promoter contained several light, hormone responsive elements and enhancer-like elements as well as CAAT box and TATA box.To study the function of this promoter, we constructed a binary expression vector pBI-PAhSAD by replacing CaMV35S promoter of pBI121 with the AhSAD promoter, which was introduced into Arabidopsis and transiently expressed in peanut, respectively, by Agrobacterium-mediated transformation.Histochemical staining analysis showed that the GUS gene mainly expressed in roots, stem, leaves, cotyledon and peanut pegs.The histochemical staining was observed in peanut whole leaves, while only in Arabidopsis veins of cauline leaves.

Peanut (Arachis hypogaea L.); Δ9-stearoyl-ACP desaturase (SAD); Promoter; Genomic walking; GUS reporter gene

10.3724/SP.J.1006.2016.01629

本研究由國(guó)家高技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102602-6), 河南省重大科技專項(xiàng)(141100110600), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-14), 河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(S2012-5)和河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金(2013YQ11)資助。

This study was supported by National High-Tech R&D Program of China (863 Program) (2013AA102602-6), the Key Project of Science and Technology of Henan Province (141100110600), the China Agriculture Research System (CARS-14), the Henan Provincial Agriculture Research System (S2012-5), and the Scientific Foundation for Excellent Young Scholars of Henan Academy of Agricultural Sciences (2013YQ11).

*通訊作者(Corresponding author) : 張新友, E-mail: haasz@126.com, Tel: 0371-65729560

聯(lián)系方式: E-mail: leis100@163.com

稿日期): 2016-02-29; Accepted(接受日期): 2016-07-11; Published online(

日期): 2016-08-11.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160811.1623.022.html