對(duì)映-貝殼杉烷二萜化合物KamebacetalA誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Hep-G2凋亡的熒光檢測(cè)

徐德萍　李國(guó)鐸　梁勤

對(duì)映-貝殼杉烷二萜化合物KamebacetalA誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Hep-G2凋亡的熒光檢測(cè)

徐德萍李國(guó)鐸梁勤

目的：驗(yàn)證香茶菜中天然二萜化合物具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。方法：選用二萜化合物Kamebaceta?lA對(duì)Hep-G2細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，Hoechst33258熒光染色，觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：低濃度藥物處理細(xì)胞72h，即出現(xiàn)早期凋亡形態(tài)特征，中濃度藥物處理24h，即出現(xiàn)典型的凋亡小體。高濃度藥物處理細(xì)胞72h，細(xì)胞已完全崩解成碎片。結(jié)論：二萜化合物Kamebac?etalA具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征隨藥物濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而愈加明顯。

對(duì)映-貝殼杉烷二萜化合物；KamebacetalA；細(xì)胞凋亡；Hep-G2

從香茶菜屬植物中提取的二萜化合物中多數(shù)具有顯效的抗癌作用，對(duì)映-貝殼杉烷類二萜化合物是香茶菜屬植物的主要次生代謝物，含量極為豐富，當(dāng)?shù)孛耖g用其治療肺膿瘡，療效顯著，天然植物二萜化合物的細(xì)胞毒活性主要表現(xiàn)在引起腫瘤細(xì)胞凋亡［1-3］。本文采用形態(tài)學(xué)觀察法檢測(cè)植物二萜化合物的細(xì)胞毒活性，用幾種香茶菜中攝取的二萜化合物處理癌細(xì)胞后，利用熒光染料Hoechst 33258染色后用熒光顯微鏡觀察。熒光染料Hoechst 33258與DNA特異結(jié)合的活性染料，以非嵌入式結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)，紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射藍(lán)色熒光。該實(shí)驗(yàn)中，KamebacetalA處理后的細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核染為高亮藍(lán)色的典型凋亡小體，其細(xì)胞核明顯固縮、凝聚和斷裂。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和被試化合物Hep-G2細(xì)胞株和對(duì)映-貝殼杉烷二萜化合物KamebacetalA均由西北師范大學(xué)生命科學(xué)院提供?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　KamebacetalA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2主要試劑及儀器合成培養(yǎng)基RMPI-1640購(gòu)自Gibco，胰蛋白酶購(gòu)自Sigma，新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)有限公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。Hoechst33258貯存液：稱取Hoechst33258試劑1mg，用1ml蒸餾水溶解后，濾過，4℃避光保存。用時(shí)蒸餾水100倍稀釋成工作液。細(xì)胞固定液：甲醇/冰乙酸（3：1），PBS緩沖液：PH=7.4。美國(guó)Costar 24孔板，超凈工作臺(tái)，CO2飽和濕度恒溫箱，倒置顯微鏡，熒光顯微鏡，高速離心機(jī)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)［4］。取Hep-G2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RP?MI1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素各100IU/ml，置于37℃、含5%CO2的飽和濕度空氣中培養(yǎng)。

1.3.2接種細(xì)胞株與藥物作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-G2細(xì)胞，加入0.6%胰蛋白酶消化分散，用完全培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)為90%的PRMI-1640合成培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清）制成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)濃度為1×105個(gè)/ml）接種于24孔板上，每孔1ml。置37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h加藥，Kame?bacetalA濃度分別為0（對(duì)照組）、5、10、15、20μmol/L。

1.3.3Hoechst33258染色。收集代謝液于離心管中后，每孔加入0.6%胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞（1000r/ min離心5min），去上清，PBS洗2次后。加入300μl固定液4℃固定30 min。2000r/min離心10min棄去上清，用30μl的Hoechst33258工作液重懸細(xì)胞，染色5分鐘后，壓片，熒光顯微鏡下觀察。

2　結(jié)果

由圖2看出，對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)染色后細(xì)胞形態(tài)完整，呈均一藍(lán)色（圖A）。用10μmol/L KamebacetalA處理72h，出現(xiàn)早期凋亡形態(tài)特征，染色質(zhì)開始凝集（圖B）。15、20μmol/L KamebacetalA處理24h，出現(xiàn)典型的凋亡小體（圖C、E）。15μmol/L KamebacetalA處理細(xì)胞48h，細(xì)胞膜破損，細(xì)胞已經(jīng)壞死（圖D），當(dāng)20μmol/L KamebacetalA處理細(xì)胞72h，細(xì)胞已完全崩解成碎片，在熒光顯微鏡下看不到完整的細(xì)胞。

圖2　Hoechst33258染色檢測(cè)KamebacetalA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

3　討論

細(xì)胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細(xì)胞自主有序性的死亡，具有重要的生物學(xué)意義。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的無限增殖及凋亡受阻有關(guān)，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一種有效的腫瘤治療手段，也成為篩選抗腫瘤藥物的一個(gè)重要指標(biāo)。天然二萜化合物所具有的細(xì)胞毒活性主要表現(xiàn)在引起腫瘤細(xì)胞凋亡。

對(duì)Hep-G2細(xì)胞加藥培養(yǎng)24h后，在倒置顯微鏡下觀察各藥物處理組及對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)的變化情況。藥物處理24 h后，處理組的細(xì)胞與對(duì)照組相比，其倒置顯微鏡下的形態(tài)特征發(fā)生變化，藥物處理組細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)中開始出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，并有少量細(xì)胞開始脫落；隨著藥物濃度的增高，癌細(xì)胞生長(zhǎng)完全停止，并出現(xiàn)細(xì)胞回縮，貼壁細(xì)胞相互間隙加大，胞內(nèi)充滿顆粒堆積，大部分細(xì)胞脫落而漂浮于培養(yǎng)液中。上述藥物處理后細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況表明：較低濃度的藥物處理時(shí)可抑制Hep-G2細(xì)胞的生長(zhǎng)，在較高濃度時(shí)則可致細(xì)胞死亡。

另外，本實(shí)驗(yàn)采用Hoechst33258熒光染色法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，研究發(fā)現(xiàn)用KamebacetalA處理Hep-G2細(xì)胞可得到較明顯的凋亡效果，該藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤藥理活性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥物處理時(shí)間與藥物濃度對(duì)凋亡程度也有顯著影響，由圖2和圖3可見低濃度藥物處理Hep-G2細(xì)胞時(shí)，24小時(shí)之內(nèi)細(xì)胞凋亡不明顯；48h后，10μmol/L和15μmol/L KamebacetalA能誘導(dǎo)大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡小體，提示此階段為藥物誘導(dǎo)作用的高峰時(shí)期，用最高濃度藥物處理72h后已很難觀察到正常細(xì)胞，大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)崩解、彌散、呈碎片狀?？傊?，以上結(jié)果表明作用時(shí)間、藥物濃度均與細(xì)胞凋亡程度有關(guān)，在較寬的濃度范圍內(nèi)二萜化合物均可誘導(dǎo)Hep-G2細(xì)胞凋亡，而檢測(cè)時(shí)間以48小時(shí)左右為佳。

本研究證實(shí)了植物天然二萜化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡誘導(dǎo)作用，并且初步探討了出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象所需的藥物濃度及作用時(shí)間，為臨床用藥提供了一定的參考。

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A

1004-2725（2016）10-0770-02

工作單位：730050甘肅蘭州，甘肅省中醫(yī)院檢驗(yàn)科

徐德萍，E-mail：546378746@qq.com