骨癌痛大鼠脊髓中WNK1激酶表達(dá)的變化

沈濛溦，錢曉波，高建瓴，王麗娜，孟曉文，楊建平

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，江蘇 蘇州　215006)

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骨癌痛大鼠脊髓中WNK1激酶表達(dá)的變化

沈濛溦，錢曉波，高建瓴，王麗娜，孟曉文，楊建平

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，江蘇 蘇州215006)

目的研究骨癌痛大鼠脊髓中WNK1表達(dá)的變化。 方法健康♀ SD大鼠30只，體質(zhì)量170 g～200 g，隨機(jī)分為3組，對照組(C 組，n=3)、假手術(shù)組(S組，n=3)和骨癌痛組(BCP組，n=24)。對照組不給予任何處理，假手術(shù)組、骨癌痛組分別在左脛骨上端注射PBS液5 μL和WALKER 256乳腺癌細(xì)胞5 μL(約1×105個細(xì)胞)。模型制備前d 1以及制備后d 3、6、9、10、11、12測定大鼠機(jī)械痛閾。C 組與S組于術(shù)后d 12、BCP組于模型制備后d 3、6、9、12時處死大鼠并取脊髓(L4～6)。運(yùn)用qRT-PCR及Western blot方法分別檢測不同時間點WNK1 mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)果與S組比較，BCP組術(shù)后d 3機(jī)械痛閾開始降低(P<0.05)，BCP組脊髓中WNK1 mRNA 在術(shù)后d 3起表達(dá)上調(diào)并隨時間推移呈遞增趨勢(P<0.01),至d 9達(dá)到峰值(P<0.05),隨后表達(dá)下調(diào)，至d 12差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；WNK1蛋白在術(shù)后d 6開始表達(dá)上調(diào)，并隨時間推移呈遞增趨勢至12 d(P<0.01)。 結(jié)論骨癌痛大鼠脊髓中WNK1表達(dá)異常增高，可能參與了大鼠骨癌痛的發(fā)生和維持。

骨腫瘤；疼痛；WNK1；脊髓；NKCC1； KCC2

WNK (with-nolysine protein kinase)家族是20世紀(jì)90年代新發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因其功能結(jié)構(gòu)域中缺乏賴氨酸而被命名，其作為一類新發(fā)現(xiàn)的離子通道調(diào)控蛋白越來越受到關(guān)注。WNK1是WNK激酶家族中的一個成員，首次描述WNK1激酶的作用是在腎臟中，其能動態(tài)地控制離子通道進(jìn)而調(diào)節(jié)并改變細(xì)胞體積[1]。近年來有研究表明，在損傷、炎癥、低滲透壓等復(fù)雜情況下WNK家族能被激活，其中WNK1激活后通過調(diào)控下游離子通道從而影響細(xì)胞內(nèi)外的Cl-濃度，而Cl-濃度的變化與疼痛相關(guān)。傷害性刺激傳入神經(jīng)元，導(dǎo)致胞內(nèi)Cl-濃度升高，使原本起突觸前抑制作用的初級傳入去極化增大為背根反射，引起原發(fā)性痛覺過敏[3-5]。本實驗通過觀察WNK1在骨癌痛大鼠疼痛的中樞傳導(dǎo)通路脊髓中的表達(dá)變化，明確WNK1激酶對骨癌痛的作用，進(jìn)而為研究WNK1在骨癌痛發(fā)生發(fā)展過程中的可能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器Walker256腫瘤細(xì)胞為南京中醫(yī)藥大學(xué)新藥與海洋藥物研究中心藥理毒理研究室惠贈；兔抗大鼠WNK1一抗(sc-28897)購自美國Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG(H+L)二抗(GAR007)、小鼠抗兔GAPDH一抗(Mab5465)、山羊抗小鼠IgG二抗(GAM007)均購自聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；qRT-PCR試劑盒購自加拿大ABM公司；PCR引物及內(nèi)參由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成。von Frey 閾值測痛儀器Stoelting(58011)購自美國Stoelting Touch Test公司。Western blot儀器：伯樂生命bio-rad；qRT-PCR儀器：德國Roche LightCycler480 實時熒光定量PCR儀。

1.2實驗動物選擇與分組清潔級健康♀ SD大鼠170 g～200 g 30只，由昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司提供，使用許可證號SCXK(蘇)2013-0003。實驗動物飼養(yǎng)室溫度保持為(22～24)℃，濕度45%～55%,光照周期為8:00～19:00,大鼠自由進(jìn)食和飲水。隨機(jī)分為3組：對照組(C組，n=3)、假手術(shù)組(S組，n=3)、骨癌痛組(BCP組，n=24)，其中骨癌痛組再根據(jù)處死時間不同分為4組(造模后3、6、9、12 d，n=6)。

1.3實驗方法

1.3.1骨癌痛模型的制備參照本實驗室的方法建立脛骨癌痛模型[6-9]。大鼠腹腔注射本實驗室凍存的Walker256 乳腺癌細(xì)胞(細(xì)胞量約為1×1010個細(xì)胞)，可穩(wěn)定于3～7 d出現(xiàn)大量腹水。消毒大鼠腹部后經(jīng)腹腔抽取腹水5 mL，經(jīng)PBS液洗滌3次后濃縮細(xì)胞濃度至約2×1010·L-1。大鼠于腹腔注射4%水合氯醛(0.01 mL·g-1)麻醉后，在左脛骨上段膝關(guān)節(jié)下切開約3 mm小口，鈍性分離肌肉等組織后暴露脛骨干骺端，然后用1 mL針筒的針頭在脛骨干骺端鉆孔，用自制彎頭的10 μL微量注射器注入5 μL walker256細(xì)胞(1×105個細(xì)胞)的懸濁液，待1 min后拔出注射器彎頭并及時用醫(yī)用膠水堵住針眼，消毒傷口周圍的皮膚以防感染。假手術(shù)組僅注入PBS液5 μL。

1.3.2機(jī)械痛閾的測定各組大鼠分別于術(shù)前d 1以及術(shù)后d 3、6、9、10、11、12時機(jī)測定機(jī)械痛閾。將大鼠放入底部為鐵絲網(wǎng)的有機(jī)玻璃籠中30 min，待其安靜并適應(yīng)周圍環(huán)境后進(jìn)行測量。利用Touch test Von Frey纖維毛針刺激大鼠左后肢足底，刺激強(qiáng)度以26 g開始，逐漸用力使毛針彎曲，至超過毛針軸線1 cm。若大鼠不出現(xiàn)縮足反應(yīng)則換高一級強(qiáng)度的毛針，直至大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng)，記錄此時Von Frey纖維毛針的力度，反映大鼠的機(jī)械痛閾。機(jī)械痛閾連續(xù)測定3次，每次間隔5 min，取其平均值。

1.3.3WNK1 mRNA表達(dá)的測定采用TRIzol一步法提取L4～6脊髓組織的總RNA。測量每個樣本RNA的濃度后取等量總RNA，按Abm公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作合成cDNA，繼而進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。WNK1引物序列：上游引物5′-CAGAGTGAGCAGCCAACAGA-3′，下游引物5′-CCACGGACTGAGGCATACTT-3′；β-actin內(nèi)參引物序列：上游引物5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。進(jìn)行qRT-PCR，最終反應(yīng)體系10 μL。經(jīng)過多次預(yù)實驗結(jié)合溶解曲線摸索出最佳的反應(yīng)條件，為三溫法：95℃預(yù)變性3 min后，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，80℃讀板1 s，共40個循環(huán)后繪制溶解曲線，72℃再延伸5 min。采集各組的熒光閾值循環(huán)數(shù)(CT 值)，并設(shè)2復(fù)孔進(jìn)行重復(fù)，取其平均值，采用2-ΔΔCT方法計算基因表達(dá)，以反映WNK1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.4WNK1蛋白表達(dá)的測定各組取脊髓(L4～6)，稱重后剪碎加入研磨器中，加入細(xì)胞裂解液RIPA(10 μL·mg-1)和PMSF(1 ∶100)，冰浴中研磨。取組織勻漿，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min后取上清液，BCA法測定蛋白濃度。配制8%SDS-PAGE凝膠，取總蛋白樣品50 μg用RIPA補(bǔ)齊至相同體積，加入蛋白上樣緩沖液后80℃煮10 min后加入樣品孔中，濃縮膠恒壓80 V、分離膠恒壓120 V分離蛋白后恒流350 mA、240 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下于封閉液(5 g脫脂奶粉溶于100 mL TBS溶液)中封閉2 h。加入GAPDH、WNK1一抗，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，滴加化學(xué)發(fā)光液，室溫孵育30 s，曝光拍照，所得圖片采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析，以WNK1條帶積分光密度值與GAPDH條帶積分光密度值的比值反映WNK1的相對表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠機(jī)械痛閾的比較各組間大鼠基礎(chǔ)痛閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，C組、S組機(jī)械痛閾與自身基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與C組比較，S組各時點機(jī)械痛閾差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與自身基礎(chǔ)值相比BCP組模型制備后d 3開始機(jī)械痛閾降低(P<0.05)，d 6～12各對應(yīng)時間點的機(jī)械痛閾明顯降低(P<0.01)，見Tab 1。2.2大鼠脊髓中WNK1 mRNA表達(dá)水平變化與S組比較，術(shù)后d 3起脊髓中WNK1 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢(P<0.01)，并且在d 9達(dá)到峰值(P<0.05)，之后表達(dá)開始下降，與S組比較，術(shù)后d 12 WNK1 mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)， 見Tab 2、Fig 1。

2.3大鼠脊髓和DRG中WNK1 蛋白表達(dá)水平變化與S組比較，術(shù)后d 3 BCP組脊髓中WNK1蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，自術(shù)后d 6起表達(dá)呈遞增趨勢，至d 12達(dá)到峰值(P<0.01)，見Tab 2、Fig 2。

Tab 1　Changes of PWT in different time points before and after model establishment ±s,n=3，g)

*P<0.05,**P<0.01vsbaseline;#P<0.05,##P<0.01vscontrol

GroupqRT?PCRWesternblotSham11BCP　3d1．34±0．04??0．95±0．10　6d2．04±0．21??2．33±0．13??　9d2．42±0．28?2．53±0．44??　12d1．51±0．292．71±0．18??

*P<0.05,**P<0.01vssham

Fig 1　Relative mRNA expression level

*P<0.05,**P<0.01vssham

Fig 2　Relative protein expression level

A:Images of western blot bands; B:Figures of Western blot.Values**P<0.01vssham

3　討論

本實驗采用Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞接種至同源♀SD大鼠左側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)，由此建立大鼠脛骨骨癌痛模型[6-9]，是本實驗室較為成熟穩(wěn)定的模型。結(jié)果表明，在模型制備后d 3開始大鼠左后肢機(jī)械痛閾下降，d 6以后肉眼可觀察到接種處脛骨腫脹，左后肢活動度降低，d 9以后左后肢不能負(fù)重并且拖地行走，機(jī)械痛閾處于低值且逐漸穩(wěn)定，提示模型建立成功。

而WNK1作為新發(fā)現(xiàn)的一類離子通道調(diào)控蛋白，歷來多在高血壓病例中進(jìn)行大量深入探討。Richardson等[10]研究得出，WNK1能激活Ste20/SPS1相關(guān)的富含脯氨酸和丙氨酸的激酶(SPS1-related proline/alanine rich kinase，SPAK)，繼之磷酸化陽離子氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體(cationchloride cotransporters，CCCs)家族成員之一的鈉氯聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium-chloride co-transporter，NCC)，導(dǎo)致高血壓。在疼痛領(lǐng)域關(guān)于WNK1的研究較少，而最新研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，在神經(jīng)病理性疼痛的大鼠模型中WNK1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)CCCs的表達(dá)參與疼痛機(jī)制。CCCs是一組轉(zhuǎn)運(yùn)鈉、鉀、氯離子進(jìn)出細(xì)胞的膜蛋白，CCCs家族成員中的鈉鉀氯聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(sodium-potassium-chloride co-transporter 1，NKCC1)與鉀氯聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(potassium-chloride co-transporter 2，KCC2)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)氯離子平衡的主要調(diào)控蛋白。目前研究認(rèn)為NKCC1和KCC2參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)脊髓疼痛傳導(dǎo)的調(diào)控，通過改變胞內(nèi)氯離子濃度來調(diào)控GABA能和甘氨酸能神經(jīng)元的功能，從而影響疼痛信號的傳導(dǎo)[12-13]。由此可見，WNK1位于疼痛傳導(dǎo)通路的上游，其通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)氯離子的濃度來影響疼痛信號的傳導(dǎo)。因此，以WNK1為研究靶點對于揭示疼痛的機(jī)制、干預(yù)疼痛的進(jìn)程具有重要的意義。然而，關(guān)于WNK1在骨癌痛中的表達(dá)及其在骨癌痛發(fā)生發(fā)展過程中的可能機(jī)制尚未見相關(guān)報道。

本實驗結(jié)果表明，WNK1在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，且骨癌痛大鼠的脊髓中WNK1在mRNA水平和蛋白水平均存在時間相關(guān)性的上調(diào)。通過對各時間點數(shù)據(jù)的分析，mRNA表達(dá)的上調(diào)先于蛋白，而蛋白的上調(diào)與機(jī)械痛閾降低相關(guān)聯(lián)，這表明在骨癌痛大鼠的疼痛傳導(dǎo)通路中，脊髓內(nèi)的WNK1表達(dá)存在異常增高。結(jié)合上述的一系列研究報道，我們推測：WNK1能夠通過調(diào)控CCCs家族成員來改變神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外的氯離子濃度從而調(diào)控GABA能神經(jīng)元的功能，參與痛覺的形成和維持。因此，本課題組擬在本實驗的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入探究WNK1及其下游通路在骨癌痛發(fā)生發(fā)展中的作用。

綜上所述，WNK1在骨癌痛大鼠的脊髓中表達(dá)異常增高，可能參與了大鼠骨癌痛的發(fā)生發(fā)展與維持。

(本實驗在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院南區(qū)中心實驗室由沈濛溦、錢曉波費時約半年完成，在此衷心感謝導(dǎo)師楊建平教授、感謝實驗室高建瓴、王麗娜、孟曉文老師的指導(dǎo)！)

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Change in expression of WNK1 in spinal cord of a rat model with bone cancer pain

SHEN Meng-wei，QIAN Xiao-bo，GAO Jian-ling，WANG Li-na，MENG Xiao-wen,YANG Jian-ping

(DeptofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,SuzhouJiangsu215006,China)

AimTo investigate the changes in the expression of WNK1 in spinal cord of a rat model with bone cancer pain. MethodsFemale SD rats, weighing 170～200 g,were randomly divided into three groups: normal control group (group C,n=3), sham operation group (group S,n=3) and bone cancer pain group (group BCP,n=24). Group C was not given any treatment, and group S was injected into the bone marrow of left tibia with 5 μl PBS solution while group BCP with 5 μl WALKER 256 mammary gland cancer cell suspension (approximately 1×105cells). Mechanical paw withdrawal threshold (MWT) was measured at d1 before inoculation (baseline) and d3,6,9,10,11,12 after inoculation. Group S and C were sacrificed at d 12 while group BCP at d 3,6,9,12 after inoculation and spinal cord (L4～6) were removed at different time points for detection of WNK1 mRNA expression by qRT-PCR and WNK1 protein expression by Western blot. ResultsCompared with group C and S，group BCP’s MWT started to decrease since d 3(P<0.05). The mRNA expression of WNK1 in spinal cord was up-regulated(P<0.05) from d 3 showing an increasing trend over time until d 9(peak) and then down-regulated to d 12(P>0.05) while the protein expression upregulated since d6 and also showed an increasing trend to d 12 (P<0.01). ConclusionThe expression of WNK1 in spinal cord of a rat model with bone cancer pain increased abnormally, which may be involved in the occurrence and maintenance of a rat model with bone cancer pain.

bone cancer; pain; WNK1; spinal cord; NKCC1； KCC2

時間：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.042.html

2016-06-19，

2016-08-05

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81471136)

沈濛溦(1991-)，女，碩士，研究方向：疼痛及其脊髓機(jī)制；E-mail：cherishmean@163.com；

楊建平(1957-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：疼痛及其脊髓機(jī)制，通訊作者,Tel:0512-67780149，E-mail: szyangjp@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.021

A

1001-1978(2016)10-1442-04

R-332；R322.81；R345.57；R441.1；R738.102.2；R977.6