基于熒光定量PCR評測熱性中藥成分對TRPV1通道功能的影響

周海玉,戴　麗,王德鳳,戴逸飛,周煒煒,孟晶,隋　峰,霍海如

(中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京　100700)

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基于熒光定量PCR評測熱性中藥成分對TRPV1通道功能的影響

周海玉,戴麗,王德鳳,戴逸飛,周煒煒,孟晶,隋峰,霍海如

(中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京100700)

熱性中藥成分；背根神經(jīng)節(jié)；TRPV1通道；7900 PCR儀；溫覺感受功能；能量代謝

瞬時受體電位通道(transient receptor potential，TRP)是一類廣泛分布于多細胞生物機體外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非選擇性陽離子通道[1-2]。瞬時受體電位香草酸受體亞型1(transient receptor potential vanilloid receptor subtype1，TRPV1)是TRP通道家族成員之一，可被熱(>43℃)、化學成分、低pH (<5.9)等激活，主要表達于背根神經(jīng)節(jié)(DRG)等外周感覺神經(jīng)元中，與機體感知外環(huán)境溫度進而調(diào)節(jié)機體的能量代謝過程關(guān)系密切[3-5]。以往研究TRPV1通道的溫覺感知功能，主要以共聚焦或膜片鉗為研究平臺，采用辣椒素等受體激動劑代替熱刺激激活TRPV1通道的模式，評價TRPV1通道介導溫覺刺激的生物功能[6-7]。由于化學成分與溫度刺激激活TRPV1的位點并不一致[8-9]，它們所傳遞的生物學意義也不盡相同。因此，本研究利用7900PCR儀的自動升溫功能和先進的熒光檢測系統(tǒng)，嘗試基于PCR儀搭建TRPV1通道的檢測和分析平臺，在評測體系建立的基礎(chǔ)上，選用臨床常用的熱性中藥的主要活性成分進行測試研究，為科學揭示中藥寒熱屬性的生物學基礎(chǔ)和現(xiàn)代科學內(nèi)涵積累有效數(shù)據(jù)。

1　儀器及材料

7900HT型熒光定量PCR儀(ABI公司)；FA1004N電子分析天平(上海精密儀器儀表有限公司)。二甲基亞砜(國藥集團化學試劑有限公司，批號：30072492)；無水乙醇(北京化工廠，批號：30072492)；Fluo-4 AM(Life technologies，批號：1321009)；F-127(Invitrgen，批號：980247)。辣椒素(Fluka，批號：BCBM1193，純度≥99%)；胡椒堿(西安冠宇生物技術(shù)有限公司，批號：20160308，純度≥98%)；阿魏酸(批號：PS01910100，純度98.5%)和姜黃素(批號：PS09112601，純度99.5%)均購于成都普斯生物科技股份有限公司；烏頭堿(寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：20131016，純度≥98%)；歐前胡素(批號：140511)、異歐前胡素(批號：140608)、高良姜素(批號：141028)、三七皂苷R1(批號：140328)、吳茱萸堿(批號：140526)和桂皮醛(批號：140518，純度≥97%)均購于成都克洛瑪生物科技有限公司(純度≥98%，除桂皮醛)；辣椒平(寧波智銳新材料有限公司，純度≥99%)。

2　方法

2.1 背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元的分離與培養(yǎng)小鼠置于75%乙醇中消毒后，剖開背部皮膚，露出脊椎。將頸椎部分剪斷，從頸椎縱向向下剪斷脊椎兩邊的肋骨，取出脊椎并修剪。從背側(cè)用眼科剪分別從左右兩側(cè)將髓腔打開，在解剖顯微鏡下將脊椎內(nèi)兩側(cè)的背根神經(jīng)節(jié)取出，剪掉神經(jīng)根及胞膜，置于4°C的L15培養(yǎng)基中。將取出的背根神經(jīng)節(jié)用吸管移到離心管內(nèi)，靜置1 min，將離心管內(nèi)的L15吸出，加入1 g·L-1膠原酶于37℃消化15 min。再將膠原酶移出，加入0.25%胰蛋白酶于37℃消化30 min，每5 min輕輕吹打一次，加入含10% FBS的L15終止消化，1 000 r·min-1離心5 min。棄廢液后用Neurobasal培養(yǎng)基重懸細胞，過80目篩，細胞接種于預先包被多聚賴氨酸的6孔板中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)液。

2.2PCR檢測平臺功能的鑒定將培養(yǎng)板中的背根神經(jīng)節(jié)細胞以1×105個/孔的密度鋪于預先包被多聚賴氨酸的96孔反應板中，培養(yǎng)24 h。將板內(nèi)細胞用PBS洗2遍，加入終濃度為4 μmol·L-1的Fluo-4 AM工作液，37℃孵育30 min。將板內(nèi)熒光染料輕輕吸出，用PBS洗2遍。每孔加入45 μL Hank’s液，實驗組加入5 μL相應濃度的阻斷劑，對照組加入5 μL Hank’s液。將板用膜封好。打開7900HT型熒光定量PCR儀SDS2.4軟件，進行PCR檢測平臺反應條件設(shè)置，設(shè)置條件見Tab 1。

Tab 1　Reaction condition setting of PCR detection platform

Experimental data converted to change rate of fluorecence value(ΔF/F0)

2.3熱性中藥成分對TRPV1通道功能影響的測試研究將培養(yǎng)板中的背根神經(jīng)節(jié)細胞以1×105個/孔的密度鋪于預先包被多聚賴氨酸的96孔反應板中，培養(yǎng)24 h。將板內(nèi)細胞用PBS洗2遍，加入終濃度為4 μmol·L-1的Fluo-4 AM工作液，37℃孵育30 min。將板內(nèi)熒光染料輕輕吸出，用PBS洗2遍。每孔加入45 μL Hank’s液，實驗組加入5 μL 200 μmol·L-1濃度的熱性中藥成分，對照組加入5 μL 不含中藥成分的溶劑，用膜封好96孔板。打開7900 HT型熒光定量PCR儀SDS 2.4軟件，進行PCR檢測平臺反應條件設(shè)置，設(shè)置條件和分析方法同上。

3　結(jié)果

3.1PCR檢測平臺功能的鑒定結(jié)果由Fig 1知，原代培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)細胞經(jīng)溫度激活(37℃到61℃)達到43℃時，熒光值開始升高，在49℃時熒光值達到最高。給予10μmol·L-1的辣椒平后，43℃左右熒光值未升高，TRPV1通道被辣椒平阻斷。如Fig 2所示，隨著辣椒平濃度的升高，背根神經(jīng)節(jié)的TRPV1通道功能逐漸降低。由Tab 2知，1 μmol·L-1、5 μmol·L-1辣椒平與對照組相比差異明顯(P<0.05)，10、50、100、200 μmol·L-1辣椒平與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)。

Fig 1　Temperature actiation of TRPV1 in DRG neurons

Fig 2　Inhibition on TRPV1 in DRG neurons by different concentrations of capsazepine Tab 2　Inhibition on TRPV1 in DRG neurons by different concentrations of ±s, n=8)

GroupChannelfunction(ΔF/F0×100%)Control22．76±0．01capsazepine1μmol·L-114．95±0．06?5μmol·L-19．35±0．04?10μmol·L-11．53±0．01??50μmol·L-11．32±0．03??100μmol·L-10．55±0．01??200μmol·L-10．41±0．02??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.2熱性中藥成分對背根神經(jīng)節(jié)TRPV1通道的影響PCR檢測平臺考察了20 μmol·L-1濃度的熱性中藥成分對背根神經(jīng)節(jié)TRPV1通道的影響。鑒于TRPV1通道在溫度>43℃時被激活，因此在數(shù)據(jù)采集時我們選用該通道被激活后的熒光變化值作為統(tǒng)計源數(shù)據(jù)。因中藥成分較多，分成了兩部分檢測，F(xiàn)ig 3和Tab 3為第一部分，F(xiàn)ig 4和Tab 4為第二部分。由Fig 3、Tab 3可知，與對照組相比，阿魏酸對TRPV1通道功能的上調(diào)作用明顯(P<0.05)，辣椒堿、吳茱萸堿、胡椒堿、烏頭堿、姜黃素對TRPV1通道功能的上調(diào)作用非常明顯(P<0.01)。由Fig 4、Tab 4可知，與對照組相比，桂皮醛對TRPV1通道功能的上調(diào)作用明顯(P<0.05)。

Fig 3　Effect of ingredients from hot herbs on TRPV1 channel activation at 43℃

A:Control;B:Capsaicin;C:Evodiamine;D:Piperine;E:Aconitine;F:Curcumin;G:Ferulic acid

Fig 4　Effect of ingredients from hot herbs on TRPV1 channel activation at 43℃

A:Control;B:Galangin;C:Imperatorin;D:Isoimperatorin;E:Notoginsenoside;F: Cinnamaldehyde

4　討論

本研究利用新型熒光定量PCR具有自動升溫和熒光信號捕獲的功能，嘗試基于7900HT型熒光定量PCR儀構(gòu)建了PCR檢測平臺，首先以背根神經(jīng)節(jié)原代神經(jīng)元為檢測體系，通過升溫變化激活TRPV1通道，檢測Ca2+通過TRPV1通道進入胞內(nèi)所引起的熒光值變化，并用阻斷劑對PCR檢測平臺的功能加以驗證。研究結(jié)果顯示[13]，溫度升高約43℃以上時，胞內(nèi)的熒光值逐漸開始升高，提示Ca2+通道被打開，進入胞內(nèi)的Ca2+與預先孵育時進入的熒光指示劑結(jié)合產(chǎn)生熒光。與對照組比較，1 μmol·L-1辣椒平對TRPV1通道功能具有明顯的抑制作用，濃度越高，抑制作用越強，存在良好的濃度依賴關(guān)系，這些現(xiàn)象表明，儀器檢測到的熒光值的變化是由TRPV1通道受溫度激活后被打開引起的，也反映了基于PCR儀的TRPV1通道功能良好，適于藥物調(diào)節(jié)TRPV1通道功能的評價和研究。

GroupConcentration/μmol·L-1ΔF/F0/%controlControl-100．00±16．99Capsaicin20202．31±16．72??Evodiamine20168．58±29．42??Piperine20121．50±7．02??Aconitine20205．56±25．95??Curcumin20155．76±19．87??Ferulicacid20134．14±20．85?

*P<0.05;**P<0.01vscontrol

Tab 4Effect of ingredients

GroupConcentration/μmol·L-1ΔF/F0/%controlControl-100．00±16．06Galangin2092．16±12．42Imperatorin2083．97±27．16Isoimperatorin20107．10±17．93Notoginsenoside2098．17±14．59Cinnamaldehyde20127．76±7．14?

*P<0.05vscontrol

研究顯示[10-12]，大部分(除高良姜素、歐前胡素、三七皂苷)經(jīng)過熱性中藥成分對TRPV1通道的Ca2+介導功能具有一定的促進作用。除高良姜素、歐前胡素、異歐前胡素、三七皂苷外，其它所選成分與對照組相比，均有明顯差異。聯(lián)系我們以往的研究結(jié)果，部分熱性中藥成分能夠提高動物機體能量代謝過程，有理由認為，熱性中藥表征的熱性屬性與其所含的活性成分能夠提高TRPV1通道感知溫度的活性，從而增加機體的能量代謝有關(guān)。但鑒于本研究只測試和分析了中藥的單一成分，在TRPV1通道環(huán)節(jié)上，這些成分多大程度上能夠代表中藥整體的活性調(diào)節(jié)作用尚有待進一步結(jié)合其所源中藥的其它成分進行深入研究和綜合分析。

(致謝：本實驗在中國中醫(yī)科學院中藥研究所中藥理論與本草文獻研究中心實驗室由周海玉、戴麗、王德鳳、戴逸飛、周煒煒、孟晶、隋峰、霍海如等共同參與完成的。)

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Evaluation of regulational function of ingredients from hot herbs on TRPV1 channel based on 7900 PCR instrument

ZHOU Hai-yu,DAI Li,WANG De-feng,DAI Yi-fei,ZHOU Wei-wei,MENG Jing,SUI Feng,HUO Hai-ru

(InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

AimTo further study the molecular mechanism of the herbs with hot nature on the regulational action on TRPV1 channel based on the 7900 Real-time PCR instrument. Methods7900 PCR instrument was applied to detect the intracellular flurescence of TRPV1 channel in the dorsal root ganglions (DRG) neurons and the effect on the TRPV1’s thermo-sensational functions of the selected 11 ingredients from hot herbs was explored. ResultsTRPV1 channels could be activated by gradually elevated temperature; the activation process could be blocked by the TRPV1 specific blocking agent capsaizepine. Most of the ingredients from hot-nature herbs had the potential to up-regualate TRPV1 channel function. ConclusionsThe established TRPV1 channel detection system based on PCR instrument is suitable for the analysis of regulational functions of drugs on the heat-activated TRPV1 channel; the functions of hot herbs may be related to the up-regualtional effects of its active ingredients on the TRPV1 channel which will further up-regulate energy metabolism.

ingredients from hot-nature herbs；dorsal root ganglion neurons；TRPV1 channels；7900 PCR instrument；thermo-sensational function；energy metabolism

時間：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.026.html

2016-06-11,

2016-08-20

國家自然科學基金面上項目(No 81274112，81373986，81473372)；國家自然科學基金青年項目(No 81403125，81403322)；北京市自然科學基金項目(No 7152106)

周海玉(1992-)，女，碩士生，研究方向：中藥學,Tel:010-64041008, E-mail: zhouhy@163.com;

隋峰(1967-)，男，研究員, 博士后合作導師，研究方向：中藥藥性和藥理學,通訊作者,Tel:010-64041008,E-mail:suifeng2136@126.com;

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.013

A

1001-1978(2016)10-1395-04

R-332；R282.71；R285.1；R322.85；R348.1；R392.11摘要：目的深入研究熱性中藥的生物學功能和分子機制。方法該研究選擇了臨床常用的熱性中藥的主要活性成分，基于新型7900PCR儀嘗試搭建背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元TRPV1通道溫覺感知功能的檢測評價系統(tǒng)，并對熱性中藥成分的TRPV1通道功能的調(diào)節(jié)作用進行了研究。結(jié)果TRPV1通道能夠被溫度升高所激活，且該激活過程可被TRPV1特異性阻斷劑辣椒平抑制，所選大部分熱性中藥成分均具有上調(diào)TRPV1通道功能的作用。結(jié)論這些結(jié)果提示基于PCR儀建立的TRPV1通道功能檢測體系適于藥物調(diào)節(jié)TRPV1通道功能的研究；熱性中藥表征的熱性屬性可能與其所含的活性成分能夠提高TRPV1通道感知溫度的活性，從而增加機體的能量代謝有關(guān)。

霍海如(1960-)，女，研究員，博士生導師，研究方向：中藥藥理和藥性研究,通訊作者,Tel:010-64041008,E-mail:hairuh@icmm.ac.com