小鼠法檢測(cè)脂溶性貝類(lèi)毒素假陽(yáng)性來(lái)源分析

劉曉玉，徐　靜，晚觀生，劉慧穎，曹際娟,,

（1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034；2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001）

小鼠法檢測(cè)脂溶性貝類(lèi)毒素假陽(yáng)性來(lái)源分析

劉曉玉1，徐靜2，晚觀生1，劉慧穎2，曹際娟1,2,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034；2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001）

目的：探討牡蠣樣品中游離脂肪酸含量隨貯存溫度和時(shí)間的變化，以期對(duì)小鼠法檢測(cè)脂溶性貝類(lèi)毒素假陽(yáng)性結(jié)果的來(lái)源進(jìn)行探索和分析。方法：采用三氟化硼甲酯化法對(duì)脂肪酸進(jìn)行衍生化，使用固定液100%二氰丙基聚硅氧烷的毛細(xì)管色譜柱對(duì)牡蠣樣品中游離脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：-10 ℃和-20 ℃貯存樣品中游離脂肪酸總含量隨時(shí)間延長(zhǎng)先增加后減少，之后再緩慢增加，4 ℃貯存樣品中游離脂肪酸總含量隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)一直緩慢增加；貯存時(shí)間相同，-20 ℃貯存樣品游離脂肪酸含量明顯高于-10 ℃。在3 種貯存溫度條件下，高毒游離脂肪酸C20∶5n-3和低毒游離脂肪酸C22∶6n-3含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng)。5 個(gè)月后-20 ℃貯存樣品中C20∶5n-3含量為136.79 μg/g，達(dá)到小鼠最小致死量（6 mg）45%；若取2.5 倍稱樣量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可導(dǎo)致小鼠法假陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)論：牡蠣樣品中高毒游離脂肪酸是小鼠法檢測(cè)脂溶性貝類(lèi)毒素假陽(yáng)性結(jié)果的重要來(lái)源，且高毒游離脂肪酸含量隨貯存溫度和時(shí)間變化呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。

小鼠法；脂溶性貝類(lèi)毒；假陽(yáng)性；游離脂肪酸

隨著貝類(lèi)毒素分析技術(shù)不斷發(fā)展，許多國(guó)家和組織相繼提出了用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)替代小鼠生物法的建議，但是許多檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)仍然在使用SCT 3023—2004《貝類(lèi)中麻痹性小鼠法貝類(lèi)毒素的測(cè)定》、SN/T 1573—2013《出口貝類(lèi)中神經(jīng)性貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法》、SNT 2131.2—2010《貝類(lèi)腹瀉性貝類(lèi)毒素檢驗(yàn)方法》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的中小鼠生物法來(lái)進(jìn)行貝類(lèi)毒素的監(jiān)測(cè)分析。鑒于小鼠法直觀監(jiān)測(cè)貝類(lèi)毒素毒性大小的不可代替性，故該方法仍然作為貝類(lèi)毒素的常規(guī)監(jiān)控分析技術(shù)被廣泛使用。根據(jù)相似相溶原理，小鼠法檢測(cè)脂溶性貝類(lèi)毒素時(shí)，游離脂肪酸常被提取溶劑提取到待測(cè)液中，之后經(jīng)腹腔注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)。早在1982日本學(xué)者Takagi等［1］使用游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸對(duì)小鼠具有很大的毒害作用。之后Takagi等［2］進(jìn)一步對(duì)不飽和游離脂肪酸的毒害作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中的多烯游離脂肪酸可能是小鼠生物法檢測(cè)腹瀉性貝毒假陽(yáng)性結(jié)果的主要來(lái)源。

針對(duì)此問(wèn)題，很多學(xué)者進(jìn)行探索研究［3-8］。唐倩囡等［6］發(fā)現(xiàn)貯藏溫度和時(shí)間等因素會(huì)引起貝類(lèi)腸腺產(chǎn)生某種生化物質(zhì)，這種生化物質(zhì)經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確認(rèn)并非脂溶性貝毒，但是這種生化物質(zhì)進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)卻導(dǎo)致小白鼠死亡出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，從而影響小鼠法檢測(cè)貝毒的結(jié)果。沈志剛［7］采用1%硫酸-甲醇甲酯化進(jìn)行脂肪酸衍生化和帶有聚乙二醇涂層的毛細(xì)管色譜柱對(duì)陰性牡蠣樣品中游離脂肪酸進(jìn)行研究，并對(duì)其隨貯存時(shí)間和貯存溫度含量變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)-10 ℃冷凍保存4 個(gè)月時(shí)C20∶5n-3含量為389.0 mg/kg，相當(dāng)于1 mL中小鼠腹腔注射液含有7.78 mg C20∶5n-3，可造成小鼠死亡。

當(dāng)前脂肪酸的檢測(cè)，前處理的衍生化法［9-13］主要有堿法甲酯化、硫酸甲醇甲酯化、三氟化硼甲酯化。堿法甲酯化只適合于脂肪；硫酸-甲醇甲酯化既適于游離脂肪酸，又適合于結(jié)合態(tài)脂肪酸（脂肪）［9］，但是容易造成長(zhǎng)鏈脂肪酸（碳鏈長(zhǎng)度大于20 個(gè)碳原子）的損失［14］。三氟化硼法能利用快速皂化使脂肪酸鹽直接轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯，減少酸化提取手續(xù)，并可防止常規(guī)法皂化時(shí)所引起的異構(gòu)化［15］。本實(shí)驗(yàn)每次對(duì)所用的牡蠣樣品中貝類(lèi)毒素含量先進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測(cè)確證，確定整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中貝類(lèi)毒素的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。之后采用采用氣相色譜法對(duì)小鼠法檢測(cè)脂溶性貝類(lèi)毒素假陽(yáng)性結(jié)果來(lái)源進(jìn)行探索研究，對(duì)牡蠣樣品中游離脂肪酸的含量在不同貯存溫度條件下隨貯存時(shí)間的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

牡蠣購(gòu)于大連市場(chǎng)，收獲季節(jié)為7月份。

甲醇、二氯甲烷、氫氧化鈉、丙酮、正己烷均為色譜純；氯化鉀和氯化鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純；37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Supelco公司；三氟化硼-10%甲醇溶液、丁羥甲苯和Amberlyst-A26陰離子交換樹(shù)脂 美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

GC-2010 Plus氣相色譜儀 日本島津公司；Z 323K臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司；HY-4調(diào)速多用振蕩器 國(guó)華電器有限公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士Büchi公司；T25 basic高度分散機(jī) 德國(guó)IKA公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品的前處理

將在大連市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的新鮮牡蠣，去除外殼，立刻放入-10 ℃和-20 ℃的冰箱進(jìn)行貯藏。檢測(cè)時(shí)，到樣品處理室用絞碎機(jī)打碎，待稱樣使用。在室溫條件下使冷凍樣品融化呈半冷凍狀態(tài)，此時(shí)的貝肉仍呈冷凍狀態(tài)，除去牡蠣外部附著的冰片，用吸水紙輕輕抹去水分后，稱量10 g牡蠣肉作為檢樣。

1.3.2樣品總脂肪的制備［16-17］

取牡蠣碎肉樣品10 g，于100 mL離心管（帶孔的蓋子）中，加入二氯甲烷-甲醇溶液（2∶1，V/V）50 mL和丁羥甲苯10 μL，然后用高度分散機(jī)均質(zhì)勻漿 1 min、4 000 r/min條件下離心5 min；取出離心管后，取下層溶液（二氯甲烷大約30 mL）于50 mL具塞試管中，加入5 mL的0.88% KCl溶液后輕輕振蕩混勻，混勻過(guò)程中不斷開(kāi)蓋放氣。過(guò)夜分層后取下層液體到250 mL圓底燒瓶中進(jìn)行減壓濃縮真空干燥，所得黏稠狀油狀物即為粗脂肪。

1.3.3游離脂肪酸的的制備

1.3.3.1Amberlyst-26（A-26）陰離子交換樹(shù)脂的活化［18-21］

稱取5 g A-26樹(shù)脂，加入50 mL濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液，用調(diào)速多用振蕩器以60 r/min振搖30 min，倒掉NaOH溶液，用高純水洗樹(shù)脂3 次，每次皆用10 mL高純水并振搖20 min，用30 mL甲醇洗3 次，每次皆用10 mL甲醇且振搖20 min，重復(fù)上述甲醇洗樹(shù)脂一次，將A-26樹(shù)脂保存于甲醇中。因A-26陰離子交換樹(shù)脂具有強(qiáng)烈的魚(yú)腥味，故稱量應(yīng)快速進(jìn)行。

1.3.3.2游離脂肪酸的提取

經(jīng)過(guò)減壓濃縮得到總脂肪后，在圓底燒瓶中加入15 mL丙酮-甲醇溶液（2∶1，V/V）和250 mg A-26陰離子交換樹(shù)脂，置于調(diào)速多用振蕩器中以水平60 r/min常溫振蕩2 h后去除溶液，用丙酮-甲醇溶液洗5 次（共用20 mL），最后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在常溫條件下小轉(zhuǎn)速樹(shù)脂吹干后待甲酯化。

1.3.4三氟化硼甲酯化［22-23］

在圓底燒瓶中加入5 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液混勻后連接回流裝置。在100 ℃水浴中加熱回流6～8 min，然后加3 mL三氟化硼-10%甲醇溶液反應(yīng)5 min，取出冷凝裝置將燒瓶冷卻至室溫后加入2 mL正己烷，將液體轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，后用3 mL飽和氯化鈉溶液清洗平底燒瓶3 次，合并飽和氯化鈉溶液于15 mL離心管，充分振搖后以2 000 r/min離心5 min。吸取上層溶液（正己烷層）約l mL于樣品瓶中作為測(cè)試液，供氣相色譜儀測(cè)定。

三氟化硼-10%甲醇溶液是強(qiáng)腐蝕性劇毒試劑，甲酯化反應(yīng)必須在通風(fēng)安全櫥中進(jìn)行；甲酯化后的試樣應(yīng)盡快進(jìn)行氣相色譜分析。如需保存，應(yīng)用惰性氣體保護(hù)，密封并冷藏于-4 ℃冰箱中。

1.3.5氣相色譜檢測(cè)條件［22,24］

氣相毛細(xì)管色譜柱內(nèi)壁涂有固定液100%二氰丙基聚硅氧烷，型號(hào)CNW CD-2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器；檢測(cè)器溫度：280 ℃；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；氣化室溫度：250 ℃；柱溫箱溫度：初始溫度140 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min；載氣：N2；載氣流速：1.0 mL/min；分流比：100∶1；進(jìn)樣量：1 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1牡蠣中脂肪酸的檢測(cè)結(jié)果

分別對(duì)新鮮牡蠣、4 ℃貯存、-10 ℃貯存及-20 ℃貯存條件下，牡蠣中游離脂肪酸的變化進(jìn)行了考察。圖1為37 種游離脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品圖譜；圖2為牡蠣樣品中脂肪酸圖譜。

圖1　37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.1　Profiles of 37 fatty acid methyl ester standards

從圖1可以看出，牡蠣中含量較高的游離脂肪酸約有20 種。Takagi［1］以游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)小鼠腹腔注射的進(jìn)行毒性研究，結(jié)果表明C20∶4n-6、C18∶3n-3、C20∶5n-3鼠單位（MU）劑量為6～12 mg，表現(xiàn)出高毒性；而C18∶2n-6t、C18∶2n-6c、C22∶6n-3鼠單位劑量為12～25 mg，表現(xiàn)出低毒性，C18∶1n-9鼠單位劑量為25～50 mg幾乎無(wú)毒。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)游離脂肪酸總含量，以及高毒和低毒的游離脂肪酸含量隨貯存溫度和時(shí)間的變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)分析。

圖2　牡蠣樣品脂肪酸甲酯氣相色譜圖Fig.2　Profiles of fatty acid methyl esters from oyster samples

2.2牡蠣中游離脂肪酸總含量隨貯藏條件的變化

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，牡蠣貯存過(guò)程中游離脂肪酸總含量變化情況為在相同貯存時(shí)間中，-10、-20 ℃牡蠣中脂肪酸總含量都是隨貯存溫度的升高先升高后降低，之后緩慢升高，主要原因是C18∶2n-6t先升高，后劇烈下降，接近于零。新鮮牡蠣中脂肪酸總含量為270.78 μg/g，貯存5 個(gè)月后-20 ℃的牡蠣中游離脂肪酸總含量為333.35 μg/g，明顯高于-10 ℃貯存的總含量199.48 μg/g。（圖3）。對(duì)貯存4 個(gè)月后的牡蠣樣品進(jìn)行了加速實(shí)驗(yàn)，取出冷凍樣品，在貯存（4 ℃）條件下考察其脂肪酸含量1周內(nèi)的變化，發(fā)現(xiàn)其含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高（圖4）；超過(guò)1 周后4 ℃貯存的牡蠣樣品發(fā)生了腐爛變質(zhì)現(xiàn)象。

圖3　不同溫度貯存牡蠣肉中脂肪酸總含量變化Fig.3　Changes in the content of total toxic fatty acids in oysters at different storage temperatures

圖4　4℃貯存7 d條件下牡蠣中脂肪酸總含量變化Fig.4　Changes in the content of total toxic fatty acids in oysters with storage time

2.3牡蠣中低毒和高毒游離脂肪酸含量隨貯藏條件的變化

圖5　不同貯存溫度牡蠣中有毒脂肪酸含量變化Fig.5　Changes in contents of toxic fatty acids in oysters at different storage temperatures

由圖5可以看出，-10 ℃和-20 ℃貯藏時(shí)，低毒游離脂肪酸C18∶2n-6t含量都是隨時(shí)間延長(zhǎng)先升高后劇烈下降接近于零，C18∶2n-6c幾乎不變，C22∶6n-3含量隨貯存時(shí)間變化則緩慢增長(zhǎng)（圖5a和c）。高毒游離脂肪酸C20∶5n-3含量劇烈增長(zhǎng)，C18∶3n-3緩慢增長(zhǎng)，C20∶4n-6變化趨勢(shì)不明顯。從貯存第2個(gè)月起，-20 ℃貯存的牡蠣中每一種有毒游離脂肪酸含量均明顯高于-10 ℃貯存的牡蠣含量。

在加速實(shí)驗(yàn)（4 ℃貯存）條件下，牡蠣中低毒游離脂肪酸C22∶6n-3含量第5天之前緩慢增加，之后劇烈增長(zhǎng)（圖6）；而C18∶2n-6t和C18∶2n-6c變化趨勢(shì)不明顯；牡蠣中高毒游離脂肪酸C20∶5n-3含量變化趨勢(shì)同C22∶6n-3，但是C20∶5n-3含量明顯高于C22∶6n-3，C18∶3n-3緩慢增長(zhǎng)，C20∶4n-6變化趨勢(shì)不明顯。

圖6　4 ℃貯存牡蠣中有毒脂肪酸含量變化Fig.6　Changes in contents of toxic fatty acids in oyster stored at 4 ℃

2.4小鼠法檢測(cè)牡蠣中脂溶性貝毒假陽(yáng)性結(jié)果來(lái)源分析

表1　牡蠣中高毒游離脂肪酸含量與小鼠法致死量的關(guān)系Table1　Relationship between the contents of highly toxic free fatty acids in oysters and their lethal dose for mouse

根據(jù)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)［25］，采用有機(jī)試劑提取脂溶性貝毒，將1 mL注射液（內(nèi)含有20 g貝肉樣品提取液），腹腔注射導(dǎo)致小鼠死亡的含量，定義為一個(gè)鼠單位（MU）。但有機(jī)試劑不但可提取出脂溶性貝毒，也會(huì)將其中的高毒游離脂肪酸提取出來(lái)，特別是3 種高毒游離脂肪酸，是造成假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因。根據(jù)文獻(xiàn)［1］的研究結(jié)果，脂肪酸對(duì)小鼠致死量C20∶4n-6、C18∶3n-3、C20∶5n-3鼠單位劑量為6～12 mg，表現(xiàn)出高毒性。表1列出了本實(shí)驗(yàn)3種高毒性游離脂肪酸的致死量，與歷經(jīng)貯存后牡蠣中的脂肪酸含量對(duì)比?？梢?jiàn)各高毒脂肪酸含量均隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)而升高，特別是C20∶5n-3，在-20 ℃貯存5 個(gè)月后，其含量已經(jīng)達(dá)到最小致死量（6 mg）的45%。此含量雖然尚不足以致小鼠死，但如果將檢測(cè)稱樣量加大，則也會(huì)引起假陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)合脂肪酸隨貯存時(shí)間而增長(zhǎng)的趨勢(shì)，可以預(yù)測(cè)在后續(xù)貯存過(guò)程中，各高毒脂肪酸將有可能增長(zhǎng)到小鼠致死的劑量。

根據(jù)文獻(xiàn)［7］研究結(jié)果，C20∶5n-3在-10 ℃貯存4 個(gè)月后，含量即可達(dá)到389 μg/g，可導(dǎo)致小鼠死亡，與本實(shí)驗(yàn)所獲得結(jié)果不同。游離離脂肪酸的產(chǎn)生，可作為水產(chǎn)品腐敗的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一，但目前尚無(wú)公認(rèn)的水解機(jī)理，普遍認(rèn)為是由三酰甘油經(jīng)化學(xué)水解或者酶促水解產(chǎn)生［26］。但不同的動(dòng)物品種，水解的過(guò)程機(jī)理和水解的最終結(jié)果都會(huì)有所不同，武華等［27］對(duì)凍藏溫度對(duì)鳙魚(yú)片脂質(zhì)特性變化的影響進(jìn)行研究，考察了-10、-20 ℃和-30 ℃貯存條件下，鳙魚(yú)片中游離脂肪酸總含量的變化，其結(jié)果是前2 個(gè)溫度條件下，脂肪水解量在前4 周快速升高，而后漸趨平緩；-30 ℃條件則是一直緩慢升高，這與本實(shí)驗(yàn)研究牡蠣的結(jié)果，以及張寧等［8］研究的牡蠣結(jié)果也不同。因此本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，游離脂肪酸的水解過(guò)程，會(huì)受到物種的影響而不同，也會(huì)受到同一物種而不同產(chǎn)地乃至不同收獲季節(jié)的影響。

3　結(jié) 論

牡蠣在冷凍貯存過(guò)程，體內(nèi)的三酰甘油經(jīng)化學(xué)水解或者酶促水解產(chǎn)生游離脂肪酸，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有毒脂肪酸含量占測(cè)得20 種脂肪酸總含量的66%～71%，特別是其中3種高毒性脂肪酸，C18∶3n-3、C20∶4n-6和C20∶5n-3，其含量均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加。在-20 ℃貯存5 個(gè)月后，C20∶5n-3的含量即可接近小鼠的半數(shù)致死量，可認(rèn)為高毒游離脂肪酸是造成小鼠法檢測(cè)脂溶性貝毒假陽(yáng)性結(jié)果的重要原因之一。

［1］ TAKAGI T, HAYASHI K, LTIABASHI Y. Toxic effect of free polyenoic acids： a fat soluble marine toxin［J］. Bulletin Faculty Fisheries Hokkaido University, 1982, 33（4）： 255-262.

［2］ TAKAGI T, HAYASHI K, LTIABASHI Y. Toxic effect of free unsaturated fatty acids in the mouse assay of diarrhetic shellfish toxin by intnperitoneal injection［J］. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 1984, 50（8）： 1413-1418. DOI：10.2331/ suisan.50.1413.

［3］ JAMES F L, RAJINDER K C, RATNAYAKE W M N, et al. An incident of elevated levels of unsaturated free fatty acids in mussels from nova scotia and their toxic effect in mice after intraperitoneal injection［J］. Natueal Toxins, 1994, 2（5）： 318-321. DOI：10.1002/ nt.2620020511.

［4］ COMBES R D. The mouse bioassay for diarrhetic shellfi sh poisoning：a gross misuse of laboratory animals and of scientifi c methodology［J］. Alternatives to Laboratory Animals, 2003, 31（6）： 595-610.

［5］ TURRELL E A, STOBO L A. Comparison of the mouse bioassay with liquid chromatography-mass pectrometry for the detection of lipophilic toxins in shellfi sh from Scottish waters［J］. Toxicon, 2007, 50（1）： 442-447. DOI：10.1016/j.toxicon.2007.04.002.

［6］ 唐倩囡. 貝類(lèi)低溫儲(chǔ)存后對(duì)腹瀉性貝毒檢疫的影響［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 48（7）： 1722-1723. DOI：10.3969/ j.issn.0439-8114.2009.07.060.

［7］ 沈志剛. 牡蠣產(chǎn)品腹瀉性貝毒檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生原因及其控制措施［D］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2009.

［8］ 張寧, 林洪, 隋濤, 等. 冷凍牡蠣貯存過(guò)程中脂溶性有毒物質(zhì)的變化研究［J］. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2010, 40（1）： 31-34. DOI：10.3969/j.issn.1672-5174.2010.01.018.

［9］ 寇秀穎, 于國(guó)萍. 脂肪和脂肪酸甲酯化方法的研究［J］. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2005, 26（2）： 46-47. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2005.02.016.

［10］ 劉帥, 王愛(ài)武, 李美艷, 等. 脂肪酸甲酯化方法的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)藥房, 2014, 25（37）： 3535-3537. DOI：10.6039/ j.issn.1001-0408.2014.37.27.

［11］ 黃崢, 盛靈慧, 馬康, 等. 5 種脂肪酸甲酯化方法的酯化效率研究［J］.中國(guó)油脂, 2013, 38（9）： 86-88.

［12］ 伍新齡, 王鳳玲, 關(guān)文強(qiáng). 植物油脂肪酸甲酯化方法比較與含量測(cè)定［J］. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2015, 36（7）： 84-87. DOI：10.3969/ j.issn.1005-6521.2015.07.022.

［13］ 曹潔, 陳衛(wèi)棟, 薛斌. 植物油脂中脂肪酸甲酯合成方法及應(yīng)用［J］. 糧食與油脂, 2014, 27（3）： 26-28. DOI：10.3969/ j.issn.1008-9578.2014.03.008.

［14］ 楊國(guó)龍, 畢艷蘭, 馬宇翔, 等. 甲酯化方法對(duì)油脂脂肪酸組成分析的影響［C］//中國(guó)糧油學(xué)會(huì)油脂分會(huì)第十六屆學(xué)術(shù)年會(huì)會(huì)議論文, 2007： 78-81.

［15］ 應(yīng)珊紅, 李歆, 郝希成. 動(dòng)植物油脂脂肪酸甲酯制備方法驗(yàn)證試驗(yàn)［J］. 糧油食品科技, 1999, 7（2）： 2-7. DOI：10.3969/ j.issn.1007-7561.1999.02.003.

［16］ 付娜, 王錫昌, 湯辰婧, 等. 氣相色譜法分析中華絨螯蟹4 個(gè)部位中總脂肪酸和游離脂肪酸含量與組成［J］. 食品工業(yè)科技, 2014, 35（13）：305-311. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2014.13.058.

［17］ 湯辰婧, 松前成輝, 付娜, 等. 不同階段中華絨螯蟹脂含量及脂肪酸組成分析［J］. 食品科學(xué), 2013, 34（22）： 174-178. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201322035.

［18］ ERIC C N, GRAEME D F. A method for the quanti-tative determination of individual free fatty acids in milkby ion exchange resin adsorption and gas-liquid chromatograph［J］. Journal of Dairy Research, 1983, 50（3）： 321-329. DOI：10.1017/s0022029900023153.

［19］ 日本食品工業(yè)學(xué)會(huì). 食品分析方法［M］. 成都： 四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1986.

［20］ 周順伍. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 1998.

［21］ 傅櫻花, 馬長(zhǎng)偉. 陰離子交換樹(shù)脂及氣相色譜法測(cè)定臘肉中的游離脂肪酸［J］. 食品科技, 2003, 28（3）： 82-84. DOI：10.3969/ j.issn.1005-9989.2003.03.031.

［22］ 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 17376—2008 動(dòng)植物油脂： 脂肪酸甲酯制備［S］. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

［23］ 佘珠花. 氣相色譜法中油脂脂肪酸衍生化方法及其選擇［J］. 糧食加工, 2004, 29（6）： 64-66. DOI：10.3969/j.issn.1007-6395.2004.06.018.

［24］ 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局, 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 17377—2008 動(dòng)植物油脂： 脂肪酸甲酯的氣相色譜分析［S］. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

［25］ 衛(wèi)生部. GB/T 5009.212—2008 貝類(lèi)中腹瀉性貝類(lèi)毒素的測(cè)定［S］.北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

［26］ de ABREU P D A, LOSADA P P, MAROTO J, et al. Lipid damage during fozen storage of Atlantic halibut （Hippoglossus hippoglossus）in active packaging fi lm containing antioxidants［J］. Food Chemistry, 2011, 126（1）： 315-320. DOI：10.1016/j.foodchem.2010.10.048.

［27］ 武華, 洪惠, 羅永康, 等. 鳙魚(yú)片脂質(zhì)特性變化的影響進(jìn)行研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 19（6）： 173-178. DOI：10.11841/ j.issn.1007-4333.2014.06.24.

Inquiry and Analysis of Sources of False Positive Results for the Detection of Fat Soluble Shellfish Toxins by the Mouse Bioassay

LIU Xiaoyu1, XU Jing2, WAN Guansheng1, LIU Huiying2, CAO Jijuan1,2,*
（1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China）

Objective： To examine the changes in free fatty acid contents in oyster with storage temperature and storage time for the purpose of exploring and analyzing the sources of false positive results in mouse bioassay for fat soluble shellfi sh toxins. Methods： Methyl esterifi cation of free fatty acids was carried out with boron trifl uoride in methanol. The products were analyzed by gas capillary chromatography with a column coated with a 100% cyanopropyl polysiloxane stationary phase. Results： The total content of free fatty acids stored at -10 ℃ and -20 ℃ increased at first, then decreased, and slowly increased again with prolonging time. When the sample was stored at 4 ℃, there was a slowly increasing trend. The content of free fatty acids stored at -20 ℃ was signifi cantly higher than at -10 ℃ at the same storage time. At all the three storage temperatures, the contents of the highly toxic free fatty acid C20：5n-3and the low toxic fatty acid C22：6n-3kept increasing throughout the storage period. Five months later, C20∶5n-3in oyster stored at -20 ℃ was 136.79 μg/g, which was 45% of the lethal dose for mice. If 2.5-fold weight of the oyster sample was used, the mice would die, leading to false positive results in mouse bioassay for fat soluble shellfi sh toxins. Conclusion： The high toxic free fatty acid in oyster samples was important source of false positive results in mouse bioassay for fat soluble shellfi sh toxin, and the content of high toxic free fatty acid in oyster samples presented an increasing trend at three temperatures as time goes by.

mice method； fat soluble shellfish poison； false positive； free fatty acid

10.7506/spkx1002-6630-201620026

TS254.4

A

1002-6630（2016）20-0157-05

劉曉玉, 徐靜, 晚觀生, 等. 小鼠法檢測(cè)脂溶性貝類(lèi)毒素假陽(yáng)性來(lái)源分析［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 157-161.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620026. http：//www.spkx.net.cn

LIU Xiaoyu, XU Jing, WAN Guansheng, et al. Inquiry and analysis of sources of false positive results for the detection of fat soluble shellfish toxins by the mouse bioassay［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 157-161. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620026. http：//www.spkx.net.cn

2016-02-04

國(guó)家公益性行業(yè)（質(zhì)檢）科研專(zhuān)項(xiàng)（201310141）

劉曉玉（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測(cè)。E-mail：liuxiaoyua@sina.com

曹際娟（1968—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：cjj0909@163.com