武漢地區(qū)門診皮膚軟組織感染患者中甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌PVL基因攜帶及耐藥性檢測

劉小麗 王斌 江元山 梁建生 袁紅 張麗華 周燕飛 許慧瓊

430015武漢市疾病預(yù)防控制中心消毒與病媒生物防制所（劉小麗、王斌、梁建生、許慧瓊），病原生物檢測所（江元山）；武漢市第一醫(yī)院護理部（袁紅）；黃陂區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)院感染管理科（張麗華）；武漢市第五醫(yī)院醫(yī)院感染管理科（周燕飛）

·論著·

武漢地區(qū)門診皮膚軟組織感染患者中甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌PVL基因攜帶及耐藥性檢測

劉小麗 王斌 江元山 梁建生 袁紅 張麗華 周燕飛 許慧瓊

430015武漢市疾病預(yù)防控制中心消毒與病媒生物防制所（劉小麗、王斌、梁建生、許慧瓊），病原生物檢測所（江元山）；武漢市第一醫(yī)院護理部（袁紅）；黃陂區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)院感染管理科（張麗華）；武漢市第五醫(yī)院醫(yī)院感染管理科（周燕飛）

目的 探討從武漢地區(qū)門診皮膚軟組織感染（SSTI）患者中分離的甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）攜帶殺白細胞毒素（PVL）基因及耐藥特征。方法 收集2011—2013年在武漢市5所醫(yī)療機構(gòu)門診就診SSTI患者中分離的182株MSSA，采用紙片擴散法進行藥敏試驗，多重PCR法檢測mecA基因和PVL基因。結(jié)果 182株MSSA中有65株P(guān)VL陽性，陽性率為35.71%。不同病種PVL陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=49.76，P=0.00），其中癤/癰（7/7）、毛囊炎（3/3）、膿腫（55.53%，30/57）和膿皰瘡（2/4）的檢出率較高。PVL 陽性患者年齡［（35.40±19.31）歲］小于 PVL陰性患者［（43.21±20.75）歲］，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.50，P=0.01）。在65株P(guān)VL陽性MSSA菌株中，耐藥率居前3位的依次是氨芐西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、紅霉素（41.54%）。在117株P(guān)VL陰性MSSA菌株中，耐藥率居前3位的依次是克林霉素（26.50%）、青霉素（20.51%）、氨芐西林（12.82%）。PVL陽性 MSSA 菌株對青霉素（χ2=21.19）、氨芐西林（χ2=97.97）、多西環(huán)素（χ2=11.61）、環(huán)丙沙星（χ2=8.07）、紅霉素（χ2=25.04）、慶大霉素（χ2=10.86）的耐藥率高于 PVL陰性 MSSA菌株，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 武漢地區(qū)門診MSSA SSTI患者中，PVL陽性率較高，對大多數(shù)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，經(jīng)驗治療可選擇氟氯西林、復(fù)方磺胺甲 唑片或多西環(huán)素。

軟組織感染；金黃色葡萄球菌；微生物敏感性試驗；殺白細胞毒素；PVL基因

金黃色葡萄球菌是一種主要人類致病菌，它可引起輕微的皮膚軟組織感染（skin and soft-tissue infections，SSTI），亦可引起壞死性肺炎和中毒休克綜合征等中毒相關(guān)性疾病。金黃色葡萄球菌引起SSTI和嚴重的深部感染多與菌株攜帶殺白細胞毒素（Panton-Valentine leukocidin，PVL）基因有關(guān)，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcusaureus，MSSA）和社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（community-acquired methicillinresistantStaphylococcus aureus，CA-MRSA）均可攜帶PVL基因，兩者之間關(guān)系密切，PVL陽性MSSA是CA-MRSA的基因儲菌庫［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)PVL的MSSA引起的感染越來越多，甚至可以引起死亡［2］。本研究采集門診SSTI患者標本，以期了解武漢地區(qū)門診SSTI患者中MSSA攜帶PVL基因及與耐藥性關(guān)系，為門診SSTI患者的抗菌藥物合理使用提供科學依據(jù)。

材料與方法

一、菌株來源及鑒定

選擇2011—2013年在武漢市第一醫(yī)院、武漢市第五醫(yī)院、黃陂區(qū)人民醫(yī)院、江漢區(qū)萬松街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、江岸區(qū)西馬街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心皮膚科、外科門診就診SSTI患者，對需切開引流或病灶破潰患者進行采樣，如果病灶沒有破損且不需切開引流，則不予采樣，經(jīng)患者知情同意后，由門診換藥室護士以無菌棉拭子采集病灶深部的膿液或分泌物，共采集標本1 400份，同時填寫研究小組專門設(shè)計的《醫(yī)院門診病人換藥情況問卷調(diào)查表》。按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第3版）所規(guī)定的方法分離培養(yǎng)和鑒定出金黃色葡萄球菌。MSSA的篩查用頭孢西?。?0 μg/片）紙片擴散法，并以PCR檢測MecA基因確定。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，購于中國藥品生物制品檢定所。

二、藥敏試驗

用紙片擴散法對金黃色葡萄球菌進行11種抗菌藥物的藥敏試驗，根據(jù)美國臨床與實驗室標準化研究所（CLSI）相關(guān)檢驗標準與操作規(guī)范（2010版）進行操作和結(jié)果判定［3］，抗菌藥物包括青霉素、頭孢西丁、氨芐西林、復(fù)方磺胺甲 唑片、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、四環(huán)素、利福平，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

三、基因檢測

1.細菌DNA模板制備：挑取金黃色葡萄球菌分離株轉(zhuǎn)入700 μl液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床150轉(zhuǎn)/min振搖過夜培養(yǎng)，離心收集菌落，棄上清后加入 TE 緩沖液（pH 8.0）300 μl混懸，加入 1 g/L 葡萄球菌溶菌酶5 μl消化細菌細胞，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h。參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取細菌DNA，每個PCR反應(yīng)液中加入1.5 μl細菌DNA洗脫液。

2.多重PCR鑒定PVL陽性MSSA分離株：采用 McClure 等［4］設(shè)計的引物（MecA310）和反應(yīng)條件對金黃色葡萄球菌進行分子鑒定，檢測mecA基因，引物上游 5′-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATA A-3′，下游：5′-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTA A-3′（310 bp）。參照Jarraud等［5］設(shè)計的PVL引物和反應(yīng)條件檢測PVL基因，PVL上游：5′-ATCATTA GGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3′，PVL 下游：5′-GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC-3′（433bp）。若mecA陰性、PVL陽性，即判定為PVL陽性MSSA分離株；若mecA陰性、PVL陰性，則為PVL陰性MSSA分離株。見圖1。

圖1 PCR檢測金黃色葡萄球菌攜帶PVL和mecA基因的電泳圖16SrRNA（+）為金黃色葡萄球菌。M：100bpDNAladder；1～4：PVL（+）MSSA；5、8：PVL（-）MSSA；6、7、9：PVL（-）MRSA；10：空白對照

四、統(tǒng)計分析

使用WHO推薦的WHONET5.4軟件進行藥敏試驗結(jié)果分析，同時用SPSS16.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、一般情況

本研究共分離203株金黃色葡萄球菌，其中21株MRSA、182株MSSA。分離出MSSA的182例SSTI患者中，男 106例（58.24%），女 76例（41.76%），年齡11個月至91（40.42±2.05）歲。病種包括：膿腫57例（31.32%），甲溝炎47例（25.82%），外傷后化膿感染28例（15.38%），表淺皮膚感染18例（9.89%），癤/癰7例（3.85%），膿皰瘡 4例（2.20%），膿性指頭炎 4例（2.20%），毛囊炎 3例（1.65%），丹毒 3例（1.65%）和其他11例（6.04%）。

二、PVL基因檢出情況

182株MSSA中有65株P(guān)VL陽性，陽性率為35.71%。PVL陽性SSTI患者年齡［（35.40±19.31）歲］小于 PVL陰性患者［（43.21±20.75）歲］，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.50，P=0.01）。不同病種患者PVL陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中癤/癰、毛囊炎、膿腫和膿皰瘡的檢出率較高。不同性別患者PVL陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

三、PVL與MSSA的耐藥性分析

65株P(guān)VL陽性MSSA中，耐藥率居前3位的依次是氨芐西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、紅霉素（41.54%）。117株P(guān)VL陰性MSSA，耐藥率居前3位的依次是克林霉素（26.50%）、青霉素（20.51%）、氨芐西林（12.82%）。PVL陽性MSSA對青霉素、氨芐西林、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素的耐藥率明顯高于PVL陰性MSSA，尤其是對β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義。見表2。

表1 182例皮膚軟組織感染患者中甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌PVL基因檢出情況

討 論

表2 PVL陽性與PVL陰性甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）對抗菌藥物敏感性比較［株（%）］

PVL是一種能募集多形核細胞和單核細胞并激發(fā)其凋亡和裂解的穿孔外毒素蛋白［6］，PVL陽性MSSA不僅可引起輕微的SSTI，也可引起皮膚感染的爆發(fā)，嚴重者可引起死亡等［2，7］。MSSA 可通過噬菌體的轉(zhuǎn)導作用獲得PVL基因，然后通過轉(zhuǎn)座子SCCmec基因變成攜帶 PVL 基因的 MRSA［8］?？梢娍刂茢y帶PVL基因的MSSA至關(guān)重要，如有“蜘蛛樣咬傷”表現(xiàn)，有膿腫反復(fù)發(fā)作，β內(nèi)酰胺類抗菌藥物療效差，存在CA-MRSA的危險因素，應(yīng)該考慮CAMRSA或PVL陽性MSSA［9］。本研究結(jié)果顯示，從門診SSTI患者中分離的MSSA菌株中PVL基因陽性率為35.71%，PVL陽性患者年齡小于PVL陰性患者，癤/癰、毛囊炎、膿腫和膿皰瘡的PVL檢出率較高，與國內(nèi)外MSSA的研究結(jié)果類似［10-11］，但普遍高于國內(nèi)外報道MRSA中PVL陽性率（28.6%和26.1%）［12-13］。

本次研究顯示，PVL陽性MSSA菌株對β內(nèi)酰胺類抗菌藥物和紅霉素類耐藥率較高，如氨芐西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、紅霉素（41.54%），但PVL陰性MSSA菌株對氨芐西林、青霉素和紅霉素的耐藥率僅為20.51%、12.82%和10.26%，因此在臨床上應(yīng)用時要慎重選擇β內(nèi)酰胺類和紅霉素類抗菌藥物來治療癤/癰、毛囊炎和膿腫等SSTI，可選擇半合成的耐青霉素酶青霉素，如氟氯西林［9］。

克林霉素有很好的組織穿透能力，英國社區(qū)MRSA感染的診斷與處理指南中克林霉素可用于治療MSSA感染［9］。在歐洲，克林霉素是SSTI的唯一推薦用藥［14］。而本研究結(jié)果顯示，PVL陽性和陰性MSSA菌株對克林霉素的敏感率只有21.54%和30.77%，提示我國門診MSSA SSTI患者應(yīng)慎用克林霉素進行經(jīng)驗治療。

美國感染病學會指南推薦復(fù)方磺胺甲 唑片或多西環(huán)素用于門診SSTI患者經(jīng)驗治療用藥［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，PVL陰性或陽性MSSA菌株對復(fù)方磺胺甲 唑片、多西環(huán)素、慶大霉素、利福平的敏感率都很高，但利福平單獨應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性，因此利福平可以作為輔助藥物與其他抗菌藥物聯(lián)用，以避免導致細菌耐藥。

綜上所述，武漢地區(qū)門診MSSA SSTI患者中PVL陽性率較高，尤其癤/癰、毛囊炎、膿腫和膿皰瘡患者的PVL檢出率最高，PVL陽性MSSA的耐藥性普遍高于PVL陰性MSSA，且對大多數(shù)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率明顯升高，經(jīng)驗治療可選擇氟氯西林、復(fù)方磺胺甲 唑片或多西環(huán)素。

志謝 感染項目組所有工作人員的辛勤付出，武漢市疾病預(yù)防控制中心熊燕主任、陳智副主任技師，江漢區(qū)萬松街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心楊志兵主任、江岸區(qū)西馬街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心夏志忠主任、江漢區(qū)疾病預(yù)防控制中心劉建龍科長、江岸區(qū)疾病預(yù)防控制中心丁曉紅副主任、黃陂區(qū)疾病預(yù)防控制中心韓墨主任在項目實施過程中的支持與幫助

［1］RasigadeJP,LaurentF,LinaG,etal.Globaldistributionandevolution of Panton-Valentine leukocidin-positive methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,1981-2007 ［J］.J Infect Dis,2010,201（10）:1589-1597.DOI:10.1086/652008.

［2］LowTB,HartyL,MurrayM,etal.PantonValentineleukocidinMSSA leadingtomulti-organfailure［J］.IrMedJ,2009,102（6）:185.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.MS100-S20.Performance standards for antimicrobial susceptibility;Testing twenty informational supplement［S］.CLSI,2010.

［4］McClure JA,Conly JM,Lau V,et al.Novel multiplex PCR assay for detection of the staphylococcal virulence marker Panton-Valentine leukocidin genes and simultaneous discrimination of methicillin-susceptible from-resistant staphylococci ［J］.J Clin Microbiol,2006,44 （3）:1141-1144.DOI:10.1128/JCM.44.3.1141-1144.2006.

［5］Jarraud S,Mougel C,Thioulouse J,et al.Relationships between Staphylococcus aureusgenetic background,virulence factors,agr groups （alleles）,and human disease［J］.Infect Immun,2002,70（2）:631-641.DOI:10.1128/IAI.70.2.631-641.2002.

［6］?zekinci T,Dal T,Yan?k K,et al.Panton-Valentine leukocidin in community and hospital-acquiredStaphylococcus aureusstrains［J］.Biotechnol Biotechnol Equip,2014,28（6）:1089-1094.DOI:10.1080/13102818.2014.976457.

［7］Bourigault C,Corvec S,Brulet V,et al.Outbreak of skin infections due to panton-Valentine leukocidin-positive methicillin-susceptible Staphylococcus aureusin a French prison in 2010-2011［J］.PLoS Curr,2014,6:PMC3946008.DOI:10.1371/currents.outbreaks.e4df88f057fc49e2560a235e0f8f9fea

［8］Boyle-Vavra S,Daum RS.Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus:the role of Panton-Valentine leukocidin［J］.Lab Invest,2007,87（1）:3-9.DOI:10.1038/labinvest.3700501.

［9］Nathwani D,Morgan M,Masterton RG,et al.Guidelines for UK practice for the diagnosis and management of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） infections presenting in the community［J］.J Antimicrob Chemother,2008,61（5）:976-994.DOI:10.1093/jac/dkn096.

［10］趙春江,王輝,劉穎梅,等.北京四家醫(yī)院社區(qū)獲得性甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌感染的流行病學調(diào)查［J］.中華檢驗醫(yī)學雜 志,2012,35 （3）:237-242.DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2012.03.010.Zhao CJ,Wang H,Sun QN,et al.Epidemiological investigation of community-acquired methicillin resistantStaphylococcus aureus infection from 4 hospitals in Beijing［J］.Chin J Lab Med,2012,35（3）:237-242.DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2012.03.010.

［11］Kaltsas A,Guh A,Mediavilla JR,et al.Frequency of pantonvalentine leukocidin-producing methicillin-sensitive Staphylococcus strainsin patients with complicated skin and soft tissue infection in Bronx,New York ［J］.J Clin Microbiol,2011,49（8）:2992-2995.DOI:10.1128/JCM.00704-11.

［12］Shrestha B,Singh W,Raj VS,et al.High prevalence of Panton-Valentine leukocidin （PVL） genes in nosocomial-acquired Staphylococcus aureusisolated from tertiary care hospitals in Nepal［J］.BiomedResInt,2014,2014:790350.DOI:10.1155/2014/790350.

［13］胡龍華,熊建球,周信云,等.兒童與成人金黃色葡萄球菌分離株攜帶PVL基因狀況比較［J］.臨床兒科雜志,2012,30（3）:251-255.DOI:10.3969/j.issn.1000-3606.2012.03.015.Hu LH,XiongJQ,Zhou XY,etal.Thecomparison of Staphylococcus aureuscarrying Panton-Valentine leukocidin gene between children′s isolates and adult isolates［J］.J Clin Pediatr,2012,30（3）:251-255.DOI:10.3969/j.issn.1000-3606.2012.03.015.

［14］De Angelis G,Cipriani M,Cauda R,et al.Treatment of skin and soft tissue infections due to community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus in Europe: the role of trimethoprim-sulfamethoxazole0010［J］.Clin Infect Dis,2011,52（12）:1471-1472.DOI:10.1093/cid/cir247.

［15］Liu C,Bayer A,Cosgrove SE,et al.Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of america for the treatmentof methicillin-resistantStaphylococcus aureusinfections in adults and children［J］.Clin Infect Dis,2011,52（3）:e18-e55.DOI:10.1093/cid/ciq146.

Prevalence of Panton-Valentine leukocidin genes and antimicrobic resistance inStaphylococcus aureusisolates from outpatients with skin and soft-tissue infections in Wuhan city

Liu Xiaoli,Wang Bin,Jiang Yuanshan,Liang Jiansheng,Yuan Hong,Zhang Lihua,Zhou Yanfei,Xu Huiqiong

Department of Disinfection and Pest Control,Wuhan Centers For Disease Prevention and Control,Wuhan 430015,China（Liu XL,Wang B,Liang JS,Xu HQ）;Institute of Pathogen Detection,Wuhan Centers For Disease Prevention and Control,Wuhan 430015,China（Jiang YS）;Department of Nursing,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,China（Yuan H）;Department of Hospital Infection Management,Huangpi People′s Hospital,Wuhan 430300,China （Zhang LH）;Department of Hospital Infection Management,Wuhan Fifth Hospital,Wuhan 430050,China（Zhou YF）

Objective ToestimatetheprevalenceofPanton-Valentineleukocidin（PVL）genesandantimicrobial resistance in methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus（MSSA）isolateds from outpatients with skin and soft-tissue infections （SSTIs）in Wuhan city.Methods A total of 182 MSSA isolates were collected from outpatients with SSTIs in 5 different hospitals in Wuhan city between 2011 and 2013.The Kirby-Bauer′s disk diffusion method was used to evaluate antimicrobial susceptibility of the MSSA isolates,and multiplex PCR was performed to detect mecA and PVL genes in these isolates.Results Of the 182 MSSA isolates,65（35.71%）carried PVL genes.The positive rate of PVL genes was significantly different among patients with different diseases （χ2=49.76,P=0.00）,and relatively higher in patients with furuncles/carbuncles（7/7）,folliculitis（3/3）,abscesses（55.53%,30/57）or impetigo（2/4）.The age of patients with PVL-positive MSSA infection was significantly younger than that with PVL-negative MSSA infection（35.40±19.31 years vs.43.21±20.75years,t=2.50,P=0.01）.Among65PVL-positiveMSSAisolates,therateofresistancetoclindamycinwashighest（87.69%）,followedbythattopenicillin（53.85%）anderythromycin（41.54%）.Thefrequencyofresistancetoclindamycinwas highestin117PVL-negativeMSSAisolates,followedbythattopenicillin（20.51%）andampicillin（12.82%）.Furthermore,there was a significantincrease in the rate of resistance to penicillin（χ2=21.19）,ampicillin（χ2=97.97）,doxycycline（χ2=11.61）,ciprofloxacin（χ2=8.07）,erythromycin（χ2=25.04）and gentamicin（χ2=10.86）in PVL-positive MSSA isolates compared with PVL-negative MSSA isolates（allP＜0.05）.Conclusions MSSA isolates from outpatients with SSTIs in Wuhan city are resistant to most β-lactam antibiotics.Flucloxacillin,compound sulfamethoxazole tablets or doxycycline is recommended for empirical treatment of PVL-positive MSSA infections.

Soft tissue infections;Staphylococcus aureus;Microbial sensitivity tests;Panton-Valentine leukocidin;PVL genes

Liang Jiansheng,Email:wh-ljs@sohu.com

梁建生，Email:wh-ljs@sohu.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.005

武漢市衛(wèi)生局公共衛(wèi)生科研項目（WG12D03）

Fund program:Public Health Research Program of Wuhan Municipal Health Bureau（WG12D03）

2015-08-12）

（本文編輯：周良佳 顏艷）