用血球計(jì)數(shù)板觀察酵母菌種群密度實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)解析

郭晴嵐

摘 要 就血球計(jì)數(shù)板的規(guī)格、操作要點(diǎn)、計(jì)算方法以及血球計(jì)數(shù)板的優(yōu)缺點(diǎn)做了簡(jiǎn)單的闡述，基本覆蓋了高中生物必修3中“觀察酵母菌種群數(shù)量變化”的實(shí)驗(yàn)操作時(shí)學(xué)生容易出現(xiàn)的失誤和學(xué)生容易忽略的問題。

關(guān)鍵詞 血球計(jì)數(shù)板 操作 酵母菌 菌液密度

中圖分類號(hào) G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

血球計(jì)數(shù)板是一種對(duì)人體紅細(xì)胞、白細(xì)胞進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)的工具，也常應(yīng)用于觀察計(jì)算一些體積略大的，呈分散分布的單細(xì)胞微生物的數(shù)量，它是一種常見的生物學(xué)器具。人民教育出版社出版的高中生物教材《必修3·環(huán)境與穩(wěn)態(tài)》中，在探究酵母菌種群密度的實(shí)驗(yàn)里，明確要求應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板來觀察酵母菌種群數(shù)量的變化，并要求學(xué)生在此基礎(chǔ)上能夠建構(gòu)酵母菌種群數(shù)量增長的數(shù)學(xué)模型。所以，如何正確操作血球計(jì)數(shù)板并通過計(jì)算得到酵母菌種群的數(shù)量就成為這個(gè)探究實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)。

1 血球計(jì)數(shù)板的簡(jiǎn)介（XB.K.25型）

XB.K.25型血球計(jì)數(shù)板是由厚玻璃制成的，在正面由H形的凹槽將血球計(jì)數(shù)板分隔為上下兩個(gè)同樣的計(jì)數(shù)池。計(jì)數(shù)池兩側(cè)各有一支持柱，將血球計(jì)數(shù)板蓋玻片（簡(jiǎn)稱血蓋片）覆蓋其上，形成上下兩個(gè)高為0.10 mm的計(jì)數(shù)池。每個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi)均畫有9個(gè)大方格，每個(gè)圖中，中央大方格被雙線分成25個(gè)中方格（位于正中及四角的5個(gè)中方格是血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)域），每個(gè)中方格用單線劃分為16個(gè)小方格。至此，每個(gè)計(jì)數(shù)池中的中央大方格都包含400個(gè)小方格（圖1）。

2 血球計(jì)數(shù)板的操作

我國現(xiàn)行的高中生物學(xué)教材中多沒有很詳細(xì)的血球計(jì)數(shù)板的操作過程介紹。如果沒有教師的相應(yīng)指導(dǎo)，學(xué)生很容易因?yàn)椴僮鞑划?dāng)而導(dǎo)致失敗。以下從容易失誤的幾個(gè)方面加以說明：

（1） 鏡檢計(jì)數(shù)室。因前一次清洗不到位，或者保存過程中存在污染，更或者因操作不當(dāng)導(dǎo)致的計(jì)數(shù)室存在劃痕，若不及時(shí)清洗或更換，則會(huì)對(duì)后期實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)產(chǎn)生極大影響。所以，在每次使用血球計(jì)數(shù)板之前都需要加一步鏡檢計(jì)數(shù)室，如若在鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)計(jì)數(shù)室有污物，則需按要求清洗并吹干后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（2） 搖勻后取液。未搖勻的情況下，酵母菌因比重較大都沉降在培養(yǎng)液的下方，若此時(shí)取液，會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)得到的酵母菌數(shù)量存在偏差。

（3） 先蓋血蓋片后加菌液。在菌懸液搖勻后，應(yīng)先在血球計(jì)數(shù)板上蓋上血蓋片，再用滴管吸取少許菌懸液，從計(jì)數(shù)區(qū)中間平臺(tái)沿血蓋片的上邊緣滴入一小滴菌懸液，利用液體的表面張力一次性充滿計(jì)數(shù)區(qū)。若先加菌液再覆蓋血蓋片，則容易因?yàn)榫杭尤脒^多，而導(dǎo)致血蓋片未與血球計(jì)數(shù)板支持柱接觸，血蓋片浮于菌液上方而導(dǎo)致最后計(jì)數(shù)偏大，同時(shí)會(huì)因?yàn)橛袣馀莓a(chǎn)生而導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏小。這個(gè)易錯(cuò)點(diǎn)不僅操作上經(jīng)常出現(xiàn)，而且高考中也曾有所涉及，如2009年福建省的高考選擇題中的一選項(xiàng)是“對(duì)酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，用吸管吸取培養(yǎng)液滴滿血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室及其四周邊緣，輕輕蓋上蓋玻片后即可鏡檢”。

（4） 靜置片刻再計(jì)數(shù)。靜置5 min，待菌懸液不再漂浮流動(dòng)，酵母菌全部沉降后再將血球計(jì)數(shù)板放到顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。先在低倍鏡下找到需要觀察計(jì)數(shù)的大方格及中方格，將中方格移到視野中央，然后撥動(dòng)轉(zhuǎn)換器移至高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。

（5） 高倍鏡下調(diào)亮度。低倍鏡下，用平面鏡和小光圈，可以清晰地看到血球計(jì)數(shù)板上的酵母菌。但是，撥動(dòng)轉(zhuǎn)換器換到高倍鏡后，即使是用了平面鏡和最小光圈，視野里往往還是白茫茫一片，什么都看不見，這時(shí)候可以嘗試操作遮光器上的金屬遮光片進(jìn)行遮光處理。因?yàn)榛畹慕湍妇团囵B(yǎng)液的折光率相近，所以要在高倍鏡下將視野調(diào)得暗一些。

（6） 掌握計(jì)數(shù)原則。在高倍鏡下進(jìn)行酵母菌的計(jì)數(shù)，對(duì)于壓在方格界線上的酵母菌應(yīng)當(dāng)計(jì)數(shù)同側(cè)的相鄰兩邊上的菌體數(shù)，一般可采取“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上左兩邊的一個(gè)夾角”的原則處理，另兩條邊和三個(gè)角不計(jì)數(shù)。一般選擇觀察的菌液濃度控制在每個(gè)小方格內(nèi)有4或5個(gè)酵母菌為宜，若酵母菌濃度太高，可適當(dāng)稀釋。若遇到酵母菌出芽生殖的情況，觀察芽體，若芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的一半時(shí)，即可作為2個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從一塊血球計(jì)數(shù)板的2個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均值來計(jì)算，對(duì)每個(gè)樣品可計(jì)數(shù)3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），再取其平均值，由此來得出血球計(jì)數(shù)板上酵母菌的估算數(shù)量，從而進(jìn)行種群密度的計(jì)算。

（7） 清洗血球計(jì)數(shù)板。血球計(jì)數(shù)板上有網(wǎng)格，所以切忌用刷子對(duì)其進(jìn)行刷洗，應(yīng)用流水沖洗，自然晾干或者吹風(fēng)機(jī)吹干或者使用有機(jī)溶劑脫水使其干燥，并鏡檢合格后再放入配套的保存盒。

近年在高考或?qū)W業(yè)水平測(cè)試中，也時(shí)有涉及上述內(nèi)容的試題出現(xiàn)。

3 利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌菌液密度的計(jì)算（XB.K.25型）

依據(jù)從5個(gè)中方格中計(jì)數(shù)得到的酵母菌數(shù)（計(jì)數(shù)需重復(fù)至少3次，取平均值），利用酵母菌（個(gè)數(shù)/mL）=5個(gè)中方格細(xì)胞總計(jì)數(shù)/5×25×10 000×稀釋倍數(shù) 即可得到酵母菌菌液的密度。學(xué)生通過血球計(jì)數(shù)板的操作和計(jì)算，進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)生物學(xué)問題的理解，從而達(dá)到理論聯(lián)系實(shí)際，并解決實(shí)際問題的要求，這方面的要求在近年的高考中也有體現(xiàn)，如：

2012年江蘇省高考第27題：（2）③將樣液稀釋100倍，采用血球計(jì)數(shù)板（規(guī)格為1 mm × 1 mm × 0.1 mm）計(jì)數(shù)，觀察到的計(jì)數(shù)室中細(xì)胞分布圖（圖2），則培養(yǎng)液中藻細(xì)胞的密度是 個(gè)/mL。（答案：108）

解析：因血球計(jì)數(shù)板規(guī)格為1 mm × 1 mm × 0.1 mm，所以應(yīng)取四角和最中間5個(gè)中方格計(jì)數(shù)，依據(jù)計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右的原則處理，5個(gè)中方格內(nèi)共有5+4+4+4+3=20個(gè)酵母菌，平均每個(gè)中方格內(nèi)有4個(gè)酵母菌。計(jì)數(shù)區(qū)25個(gè)中方格，所以一共有4×25=100個(gè)酵母菌。計(jì)數(shù)區(qū)體積為1mm × 1mm × 0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3mL，換算成1mL則有酵母菌100×104個(gè)，再乘以稀釋倍數(shù)100，結(jié)果為108個(gè)/mL。

4 運(yùn)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限

用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行酵母菌種群數(shù)量的計(jì)數(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的，如操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，成本低，可重復(fù)性強(qiáng)。但缺點(diǎn)也很明顯，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，視野范圍內(nèi)無法區(qū)分細(xì)胞的死活，所以計(jì)數(shù)時(shí)，死的和活的細(xì)胞都計(jì)數(shù)在內(nèi)，數(shù)值存在誤差；對(duì)于一些體積較小的微生物，用血球計(jì)數(shù)板在高倍鏡下也很難觀察到，通常就需要選用價(jià)格更昂貴的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或者使用油鏡；血球計(jì)數(shù)板不適合用以觀察和計(jì)數(shù)如放線菌等絲狀微生物，也不能用于鏈狀或不分散的微生物的觀察等。