粗莖秦艽中的人工生物堿及化學(xué)成分研究

杜 鵬

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng) 550004)

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粗莖秦艽中的人工生物堿及化學(xué)成分研究

杜 鵬

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng) 550004)

[目的]研究粗莖秦艽中的人工生物堿及其他化學(xué)成分。[方法]以含氨溶劑對(duì)粗莖秦艽進(jìn)行提取后，利用硅膠色譜分離純化該浸膏中的化學(xué)成分,根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]分離并鑒定了8個(gè)化合物,其結(jié)構(gòu)分別為粗莖龍膽堿A(gentiocrasine A，Ⅰ)、粗莖龍膽堿B(gentiocrasine B，Ⅱ)、秦艽甲素(gentianine，Ⅲ)、秦艽丙素(gentianal，Ⅳ)、西藏龍膽堿(gentiatibetine，Ⅴ)、胡蘿卜苷(daucosterol，Ⅵ)、β-谷甾醇(β-sitosterol，Ⅶ)、棕櫚酸(plamitic acid，Ⅷ)。[結(jié)論]化合物Ⅰ和化合物Ⅱ?yàn)槭状蔚玫降幕衔铩?/p>

粗莖秦艽；生物堿；化學(xué)成分

秦艽RadixGentianaeMacrophyllae是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥之一，在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛的功能，臨床上用于風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛、日曝潮熱和小兒疳積發(fā)熱等癥。粗莖秦艽是中藥志記載的秦艽主要原植物之一，分布于我國(guó)四川、云南西北部及西藏與四川的接壤地區(qū)，目前市場(chǎng)上流通的秦艽藥材多為粗莖秦艽。

秦艽主要含裂環(huán)烯醚萜苷、甾醇苷、揮發(fā)油和糖類(lèi)等成分[1-2]，前人曾從秦艽G.macrophyllyPall.中分離到數(shù)種生物堿[3-5]，但其后的研究表明秦艽生物堿類(lèi)成分是在提取處理過(guò)程中由裂環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分與氨作用轉(zhuǎn)化而來(lái)[6-8]，并非秦艽中本來(lái)存在的化學(xué)成分。楊肖鋒等[9]分析認(rèn)為龍膽苦苷的抗炎藥效是龍膽苦苷轉(zhuǎn)化為生物堿后二者的總和作用。喬衛(wèi)等[10]研究指出環(huán)烯醚萜苷和其乙酰酯在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的半縮醛和其他衍生物，這些衍生物才是具有藥理活性的物質(zhì)。為了更深入地探索秦艽藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，該研究首次對(duì)龍膽科植物粗莖秦艽進(jìn)行了生物堿類(lèi)化學(xué)成分的研究，并通過(guò)硅膠柱色譜及UV、IR、NMR、MS等波普技術(shù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)，以期為秦艽藥理活性研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。藥材秦艽購(gòu)于貴州省藥材市場(chǎng)，由貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為粗莖秦艽GentianacrassicaulisDuthie ex Burk.的干燥根。

1.1.2儀器。Bruker AC-E200和Varian Unity INOVA 400/54核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)；FINNIGAN LCQDECA 質(zhì)譜儀； VECTOR22紅外儀，KBr壓片；Cintra 10e UV-Visible Spectrometer紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Perkin Elmer Mode-134微量旋光儀；Boetius微量熔點(diǎn)測(cè)定儀；Sartorius BP-211D電子天平；Senco R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.1.3試劑。薄層層析用硅膠G為吸附劑，以0.5%CMC-Na調(diào)制涂板(0.3～1.4 mm)，改良Dragendorff’s試劑和8%硫酸乙醇試劑顯色；柱層析用硅膠H為吸附劑；硅膠均為青島海洋化工廠制品；氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇為分析純。

1.2提取與分離取干燥粗莖秦艽9.5 kg，粉碎。以混合溶液：吐溫80-70%乙醇溶液-10%氨水(0.5∶99.5∶14.0)浸潤(rùn)24 h后滲漉。以5%鹽酸調(diào)節(jié)滲漉液至pH 1～2，酸水液用氯仿萃取，氯仿萃取液回收溶劑后得到流動(dòng)性較大的棕色油狀浸膏A(120 g)；用濃氨水將酸水部分堿化至pH 5～6，用氯仿萃取至水液中無(wú)生物堿檢出，濃縮氯仿萃取液得流動(dòng)性較大的棕色浸膏B(60 g)。

A部分(120 g)經(jīng)減壓硅膠H柱層析，氯仿-甲醇系統(tǒng)(按1%比例加入二乙胺)，梯度洗脫(99∶1～4∶1)，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并得A1、A2、A3三部分。A1濃縮后析出化合物Ⅵ;A2濃縮后析出無(wú)色針晶，以丙酮重結(jié)晶得化合物Ⅶ;A3濃縮后析出化合物Ⅷ。B部分(60 g)經(jīng)減壓硅膠H柱層析，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(按1%比例加入二乙胺)，梯度洗脫(99∶1～4∶1)，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并得B1、B2、B3三部分。B1濃縮后析出黃色柱狀結(jié)晶，以丙酮重結(jié)晶后得化合物Ⅳ。B2經(jīng)硅膠H柱層析，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)，梯度洗脫(99∶1～4∶1)，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并得到C1、C2兩部分。B3經(jīng)硅膠H柱層析，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)，梯度洗脫(99∶1～4∶1)，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并后析出化合物V。

C1濃縮后析出白色羽狀結(jié)晶，以環(huán)己烷重結(jié)晶后得化合物Ⅲ。C2部分經(jīng)硅膠H柱層析，石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并得D1、D2兩部分。D1濃縮后得到化合物Ⅰ；D2濃縮后得到化合物Ⅱ。

2　結(jié)果與分析

對(duì)龍膽科植物粗莖秦艽加氨后提取分離得到了8個(gè)化合物，其中5個(gè)是裂環(huán)烯醚萜苷類(lèi)生物堿，且化合物Ⅰ和化合物Ⅱ?yàn)槭状蔚玫降幕衔?。秦艽生物堿類(lèi)化合物均未見(jiàn)碳譜數(shù)據(jù)報(bào)導(dǎo)，該研究補(bǔ)充了秦艽丙素、西藏龍膽堿的碳譜數(shù)據(jù)。

1H-1H COSY譜與HMQC譜提示分子中含有-CH2-CH2-O-結(jié)構(gòu)：δ 4.12 (1H,ddd,J=11.92 Hz,3.16 Hz,2.88 Hz)和δ 3.64(1H,m)為同碳上非化學(xué)等價(jià)的共振峰，該亞甲基碳與氧相連，其化學(xué)位移為δ 56.2。δ 2.95(1H,m)和δ 2.56(1H,m)為同碳上非化學(xué)等價(jià)的共振峰，該亞甲基碳的化學(xué)位移為δ 27.4，并從HMBC譜觀察到該亞甲基上2個(gè)

氫與吡啶環(huán)的C3、C4、C5均有相關(guān)信號(hào)，說(shuō)明該碳與C5相連。同時(shí)HMBC譜上顯示δ 5.49(1H,s)的質(zhì)子信號(hào)與位移值為δ 27.4的亞甲基碳相關(guān)，推測(cè)分子中含有吡啶單萜結(jié)構(gòu)。

另外，Ⅰ的氫譜中δ 2.45(3H,s)為一個(gè)處于較低場(chǎng)的甲基信號(hào)，由HMBC譜觀察到該甲基上的氫與吡啶環(huán)上的C2、C3之間的遠(yuǎn)程相關(guān)，推斷該甲基與C2相連，HMQC譜提示該甲基碳的化學(xué)位移為δ 21.1。

Ⅰ的氫譜還可見(jiàn)δ 3.92(1H,m)、δ 3.64(1H,m)和δ 1.26(3H,t,J=7.06 Hz)的一組共振峰信號(hào)，由化學(xué)位移及質(zhì)子的相互耦合情況推測(cè)分子中含有乙氧基，其中信號(hào)δ 3.92(1H,m)、δ 3.64(1H,m)為同碳上非化學(xué)等價(jià)的共振峰；HMQC譜及DEPT譜提示該乙氧基中2個(gè)碳的化學(xué)位移分別為δ 63.5(CH2)和δ 15.0(CH3)。由HMBC譜觀察到質(zhì)子信號(hào)δ 5.49(1H,s)與碳信號(hào)δ 63.5(CH2)相關(guān)，說(shuō)明該乙氧基與環(huán)醚結(jié)構(gòu)中的次甲基相連。

根據(jù)以上證據(jù)，推斷化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)如圖1，并歸屬了Ⅰ的NMR數(shù)據(jù)(表1)，HMBC圖譜關(guān)鍵相關(guān)信息見(jiàn)圖2。該研究是首次獲得該化合物，暫命名為粗莖龍膽堿A(gentiocrasine A)。

圖1　化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)式Fig.1　Structure of compound Ⅰ

CδCHδH(J=Hz)1H-1HCOSYHMBC(HtoC)2158.5,C2———3128.3,C3———4143.0,C4———5121.3,CH56.84,d(1H,d,4.8)63,4,6,106147.7,CH68.25,d(1H,d,5.2)52,4,5794.4,CH75.48(1H,s)—2,3,4,9,12956.2,CH29a4.11(1H,ddd,11.92,3.16,2.88)9b,10a,10b4,79b3.84(1H,m)9a,10a4,7,101027.4,CH210a2.52(1H,m)9a,9b,10b3,4,5,910b2.94(1H,m)5,9a,9b,10a3,4,51121.1,CH3112.45(3H,s)—2,31263.5,CH212a3.64(1H,m)12b,137,1312b3.92(1H,m)12a,137,131315.0,CH3131.25(3H,t,6.8)12a,12b12

圖2　化合物Ⅰ的HMBC圖譜的關(guān)鍵相關(guān)信息Fig.2　Key correlation information of HMBC spectrum of compound Ⅰ

Ⅱ的碳?xì)渥V數(shù)據(jù)與Ⅰ比較，乙氧基的數(shù)據(jù)相似：1H-NMR(CDCl3，200 MHz)譜中可見(jiàn)δ 3.85(1H,m)、δ 3.68(1H,m)和δ 1.27(3H,t,J=7.00)的乙氧基共振峰信號(hào)，結(jié)合13C-NMR(DEPT)譜推斷該乙氧基的化學(xué)位移分別為δ 64.0(CH2)和δ 15.2(CH3)。由于Ⅱ分子中的環(huán)醚與二氫吡啶相連，與Ⅰ的環(huán)醚信號(hào)相差較大。1H-NMR譜中可觀察到C1～C10上各質(zhì)子間的耦合：δ 2.28(1H,m)和δ 4.38(2H,q)為二氫吡啶環(huán)上C5-H與C6-H的信號(hào)峰；信號(hào)δ 4.24(1H,m)和δ 4.38(1H,q)為C9上非化學(xué)等價(jià)的同碳二氫共振峰；信號(hào)δ 2.53(1H,m)和δ 2.18(1H,m)為C10上非化學(xué)等價(jià)的同碳二氫共振峰；δ 5.36(1H,s)為C7上的氫信號(hào)。另外，1H-NMR譜中δ 2.14(3H,m)及13C-NMR(DEPT)譜中信號(hào)δ 20.7(CH3)共同提示了一個(gè)處于較低磁場(chǎng)的甲基，由其化學(xué)位移及氫譜中各信號(hào)峰的耦合關(guān)系，推斷該甲基與C5相連。根據(jù)以上證據(jù)，推斷化合物Ⅱ結(jié)構(gòu)如圖3，并歸屬了Ⅱ的NMR數(shù)據(jù)(表2)。該研究是首次獲得該化合物，暫命名為粗莖龍膽堿B(gentiocrasidine B)。

圖3　化合物Ⅱ結(jié)構(gòu)式Fig.3　Structure of compound Ⅱ

表2　化合物Ⅱ的NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)

圖4　化合物Ⅲ結(jié)構(gòu)式Fig.4　Structure of compound Ⅲ

圖5　化合物Ⅳ結(jié)構(gòu)式Fig.5　Structure of compound Ⅳ

CδCCδC2164.8,CH745.3,CH393.4,C964.8,CH24149.1,C1022.9,CH25115.1,C11185.6,CH6151.28,C1222.0,CH3

13C-NMR(DEPT)(CD3OD，50 MHz)譜給出9個(gè)碳信號(hào)，由5個(gè)低場(chǎng)區(qū)的碳信號(hào)δ 157.5(C)、δ 146.0(CH)、δ 147.7(C)、δ 131.8(C)、δ 123.2(CH)，以及1H-NMR(CD3OD，200 MHz)譜中的特征質(zhì)子信號(hào)δ 8.25(1H,d,J=5.02 Hz)和δ 7.11(1H,d,J=5.05 Hz)推測(cè)分子中含有吡啶環(huán)[13]；并由13C-NMR譜信號(hào)δ 28.6(CH2)、δ 57.0 (CH2)、δ 89.4(CH)，結(jié)合生源初步推斷Ⅴ為吡啶單萜類(lèi)生物堿。1H-NMR譜中信號(hào)δ 8.25(1H,d,J=5.02 Hz)和δ 7.11(1H,d,J=5.05 Hz)為吡啶環(huán)上α-H與β-H的共振峰；信號(hào)δ4.28(1H,ddd,J=11.9 Hz,3.48 Hz,2.86 Hz)和 δ 3.93(1H,m)為C9上同碳二氫的共振峰；信號(hào)δ 3.02(1H,m)和δ 2.66(1H,m)為C10上同碳二氫的共振峰。δ 5.98(1H,s)為C7上的氫信號(hào)；13C-NMR(DEPT)譜中C7的信號(hào)峰δ 94.4(CH)為縮醛結(jié)構(gòu)，處于較低磁場(chǎng)。C9及C10的化學(xué)位移為δ 56.2(CH2)和δ 27.4(CH2)，δ 20.9(CH3)為與吡啶環(huán)相連的C11信號(hào)峰。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對(duì)照，與已知化合物西藏龍膽堿基本一致，鑒定化合物Ⅴ為西藏龍膽堿(gentiatibetine)，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。該研究歸屬了Ⅴ的碳譜數(shù)據(jù)(表4)。

圖6　化合物Ⅴ結(jié)構(gòu)式Fig.6　Structure of compound Ⅴ

2.6化合物Ⅵ白色無(wú)定形粉末，50 mg，mp：290～295 ℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均顯陽(yáng)性。碳?xì)渥V數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)[12]比較，鑒定化合物Ⅵ為胡蘿卜苷(daucosterol)，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7。

表4　化合物Ⅴ的NMR數(shù)據(jù)(CD3OD)

圖7　化合物Ⅵ結(jié)構(gòu)式Fig.7　Structure of compound Ⅵ

2.7化合物Ⅶ無(wú)色針晶(丙酮)，30 mg,mp：135～137 ℃，與茴香醛試劑產(chǎn)生亮天藍(lán)色斑點(diǎn)，漸變成綠色。TLC與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品比較，Rf值一致，混合測(cè)熔點(diǎn)不下降。鑒定化合物Ⅶ為β-谷甾醇(β-sitosterol),其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖8。

圖8　化合物Ⅶ結(jié)構(gòu)式Fig.8　Structure of compound Ⅶ

2.8化合物Ⅷ白色無(wú)定形粉末，25 mg,mp：60～61 ℃，溴甲酚綠反應(yīng)陽(yáng)性。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)譜低場(chǎng)區(qū)無(wú)質(zhì)子信號(hào)；δ 0.88(3H,t,J=6.4 Hz)顯示唯一的-CH3； δ 2.35(2H,t,J=7.6 Hz)顯示羰基α位次甲基；δ 1.63(2H,m)顯示羰基β位次甲基；在δ 1.25處有一脂肪鏈質(zhì)子信號(hào)，提示該化合物為一長(zhǎng)鏈脂肪酸。TLC與棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品比較，Rf值一致，混合測(cè)熔點(diǎn)不下降。鑒定化合物Ⅷ為棕櫚酸(plamitic acid)。

3　結(jié)論

該研究首次對(duì)龍膽科植物粗莖秦艽加氨后生成的生物堿類(lèi)成分進(jìn)行了提取、分離，共得到了8個(gè)化合物，通過(guò)波譜和化學(xué)分析鑒定分別為粗莖龍膽堿A(gentiocrasine A，Ⅰ)、粗莖龍膽堿B(gentiocrasine B，Ⅱ)、秦艽甲素(gentianine，Ⅲ)、秦艽丙素(gentianal，Ⅳ)、西藏龍膽堿(gentiatibetine，Ⅴ)、胡蘿卜苷(daucosterol，Ⅵ)、β-谷甾醇(β-sitosterol，Ⅶ)、棕櫚酸(plamitic acid，Ⅷ)，其中5個(gè)是裂環(huán)烯醚萜苷類(lèi)生物堿，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ?yàn)槭状蔚玫降幕衔?。秦艽生物堿類(lèi)化合物均未見(jiàn)碳譜數(shù)據(jù)報(bào)導(dǎo)，該研究補(bǔ)充了秦艽丙素、西藏龍膽堿的碳譜數(shù)據(jù)。

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Artificial Alkaloids and Chemical Constituents ofGentianacrassicaulisDuthie ex Burk.

DU Peng

Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004)

[Objective] To study artificial alkaloids and other chemical constituents ofGentianacrassicaulisDuthie ex Burk.. [Method] After the crude total alkaloids were extracted with a solvent containing ammonia,the chemical constituents in the extract were isolated and purified by silica gel column chromatography and identified on the basis of their physiochemical and spectral data. [Result] Eight compounds were isolated and identified,including gentiocrasine A (Ⅰ),gentiocrasine B (Ⅱ),gentianine (Ⅲ),gentianal (Ⅳ),gentiatibetine (Ⅴ),daucosterol (Ⅵ),β-sitosterol (Ⅶ),and plamitic acid (Ⅷ). [Conclusion] Compounds Ⅰ and Ⅱ are new compounds.

GentianacrassicaulisDuthie ex Burk.; Alkaloid; Chemical constituents

2016-08-26

S 567

A

0517-6611(2016)26-0091-04

杜鵬(1979- )，男，寧夏銀川人，主管藥師，碩士，從事天然藥物及藥物臨床試驗(yàn)研究。