MITE類轉(zhuǎn)座子mPing在水稻不同亞種間的差異分析

張寧1*，阮亞男1*，王姍姍1,2，劉洋1，趙宸1，王晶晶1，王凱璽3，王艷麗1，王紅艷1

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MITE類轉(zhuǎn)座子m在水稻不同亞種間的差異分析

張寧1*，阮亞男1*，王姍姍1,2，劉洋1，趙宸1，王晶晶1，王凱璽3，王艷麗1，王紅艷1

1 遼寧大學(xué)生命科學(xué)院植物表觀遺傳與進化實驗室，遼寧沈陽110036 2 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所品種資源研究室，西藏拉薩850000 3 遼寧省水土保持研究所，遼寧朝陽 122000

m是水稻中第一個被鑒定出的有活性的MITE類轉(zhuǎn)座子，為了探索m在水稻粳稻品種日本晴和秈稻品種93-11基因組中的分布差異，本研究首先運用Southern雜交的方法初步檢測m在兩個亞種中拷貝數(shù)的差異，然后通過同源性探尋方法發(fā)現(xiàn)，m在水稻亞種日本晴和93-11基因組中拷貝數(shù)分別為52和14，并且日本晴基因組中的m均為m-1，93-11中m-1的拷貝數(shù)為3，m-2的拷貝數(shù)為11。通過分析m上下游5 kb側(cè)翼序列發(fā)現(xiàn)m在日本晴和93-11中分別與23和3個已知基因相關(guān)聯(lián)。本研究為闡明以m的分布多樣性為主要原因的粳稻和秈稻之間的遺傳差異提供初步理論基礎(chǔ)。

粳稻，秈稻，轉(zhuǎn)座子，m，水稻

轉(zhuǎn)座子(Transpososable elements或transposons)是指基因組中可移動或復(fù)制自身DNA并整合到新位點的DNA片段[1]。轉(zhuǎn)座子在基因組中常常具有很多拷貝，是真核生物基因組重要的組成部分[2]。人類基因組中轉(zhuǎn)座子約占整個基因組的45%，植物中約為50%?90%[3]。由于轉(zhuǎn)座子激活可造成基因的失活或缺失、基因組重排、甚至是著絲粒區(qū)序列的進化和分 化[4-7]，因此對于研究基因組結(jié)構(gòu)、側(cè)翼基因表達(dá)調(diào)控以及物種進化等都起到重要作用[3]。

根據(jù)轉(zhuǎn)座方式可將轉(zhuǎn)座子分為兩類：Class I稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(Retrotransposon)，是利用RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座[8]。根據(jù)其是否包含有長末端重復(fù)序列(LTR)，分為LTR類反轉(zhuǎn)座子(LTR retrotransposon) 和非LTR類反轉(zhuǎn)座子(Non-LTR retrotransposon)，由于其利用復(fù)制/插入方式實現(xiàn)轉(zhuǎn)座，因此可改變基因組的大小[3]。Class II稱為轉(zhuǎn)座子(Transposons)，是利用DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)座。根據(jù)其轉(zhuǎn)座的自主性，可分為自主性轉(zhuǎn)座子(Autonomous element)、非自主性轉(zhuǎn)座子(Non-autonomous element) 及微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子(Miniature inverted-repeat transposable element, MITE)，由于其利用切除/修復(fù)方式實現(xiàn)轉(zhuǎn)座，因此基因組大小一般不會發(fā)生改變[9-10]。

MITE類轉(zhuǎn)座子是一類在植物中分布廣泛的非自主性轉(zhuǎn)座子，自身不具編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，序列只有100?500bp[11]，常常位于基因組的常染色質(zhì)區(qū)[12-13]。水稻中第一個被鑒定的有活性的MITE類轉(zhuǎn)座子是m(GenBank AccessionNo. BK000588)，序列長430 bp[14]，m的結(jié)構(gòu)中包括15 bp的TIRs (Terminal inverted repeats)，但不帶有ORF (Open reading frame)，它的轉(zhuǎn)座依靠自主類轉(zhuǎn)座子或的ORF2編碼的轉(zhuǎn)座酶進行轉(zhuǎn)座[15-17]。m在水稻中的突變體有兩種類型：m-1和m-2，其中m-1序列長430 bp，m-2序列長419 bp[18]。

水稻作為世界一半人口的食物來源，對人類的生存與發(fā)展有著重要的意義，在其9 000多年的馴化歷史中[18-19]，有20多個稻屬物種，其主要分化為秈稻和粳稻兩種生態(tài)型[20]。秈稻和粳稻有著形態(tài)、生理、遺傳等方面的差異。比如秈稻植株一般高于粳稻植株，抗倒伏能力較強，發(fā)芽較快，分蘗數(shù)較強，但秈稻比粳稻有更高的凈光合速率[21]；蔡星星 等[20]利用秈稻93-11和粳稻日本晴基因組序列的差異片段進行研究，結(jié)果顯示這兩種生態(tài)型全基因序列具有很大的差異性。m的拷貝數(shù)差異就是其中的一個原因，為了更加完整地探尋m在水稻亞種分化以及基因組形成中的可能作用，本研究主要運用Southern雜交分析并結(jié)合生物信息學(xué)的方法，利用日本晴和93-11全基因組信息，對m在水稻兩個亞種基因組中的結(jié)構(gòu)特點、分布特征、以及m的插入對側(cè)翼基因的影響進行研究，探尋m在水稻亞種形成過程中的可能作用。本研究為闡明粳稻和秈稻之間的遺傳差異、探索粳稻和秈稻的進化歷史提供初步理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本研究采用的實驗材料為粳稻品種日本晴(cv.) 和秈稻品種93-11 (cv.)。

1.2 Southern雜交

利用dIII (購自New England Biolabs公司) 分別對日本晴和93-11的DNA樣品進行酶切，選取這個酶的目的在于m中不存在d III的酶切位點，因此我們可以估測m在這兩個水稻亞種中的拷貝數(shù)。根據(jù)Shan等[5]提供的方法進行Southern雜交分析，以m-1 (AB087615) 全長設(shè)計探針引物(由上海生工生物技術(shù)有限公司合成)，具體序列為m-1 (positions 6–430)：forward，5’-GTCACAATGGG GGTTTCACT-3’，reverse，5’-GGCCAGTCACA ATGGCTAGT-3’。

1.3 生物信息學(xué)及比較基因組學(xué)

m-1 (AB087615) 的基因序列在NCBI網(wǎng)站(http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/) 中下載，根據(jù)m-1的序列，可得到m-2的序列[18]。根據(jù)GRAMENE (http://www.gram ene.org) 網(wǎng)站，做Blast分析獲得m在日本晴和93-11中的拷貝信息，根據(jù)RICE-MAP (http://www.ricemap.org/) 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，可得到該m拷貝所在染色體的上下游5 kb的堿基序列信息，再根據(jù)KOME數(shù)據(jù)庫(http://cdna01. dna.affrc.go.jp/cDNA/)，E值設(shè)為0，即只有100%同源序列才被挑選出來，以此方法進行同源性探尋可得到側(cè)翼序列的外顯子信息及表達(dá)蛋白的功能信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本晴和93-11的Southern雜交分析

通過dIII酶切的Southern雜交分析可保守估測m在日本晴和93-11中的拷貝數(shù)。由結(jié)果可知(圖1)，m在日本晴中和93-11中均存在，且m在兩亞種中的數(shù)量是不同的，在日本晴中的拷貝數(shù)明顯多于93-11，說明m在水稻亞種的分布有明顯的差異，暗示其在物種分化中可能存在某些作用。

圖1 mPing在日本晴和93-11中的Southern雜交分析

2.2 m不同拷貝在秈稻品種93-11和粳稻品種日本晴基因組中的定位情況

為了進一步確定m在兩個亞種中的差別信息，通過同源性探尋方法，對m進行定位分析。結(jié)果表明，m在水稻亞種中分布數(shù)量和位置均不相同(表1，表2)，m在93-11中的拷貝數(shù)是14 (圖2)，在日本晴中的拷貝數(shù)是52 (圖3)。其中93-11中m-1的拷貝數(shù)是3，m-2的拷貝數(shù)是11，日本晴中的m均為m-1，m在日本晴中的拷貝數(shù)是93-11的3.7倍。此外，日本晴每條染色體均有m的分布，拷貝數(shù)最多的是10號染色體，最少的是1號染色體，93-11中7、8、10號染色體沒有m的拷貝，1號染色體上的拷貝數(shù)最多，為3個拷貝。m在日本晴和93-11基因組中結(jié)構(gòu)特點和分布特征的多樣性，進一步說明它們是導(dǎo)致水稻不同亞種間基因組差異的原因。

表1 mPing在日本晴基因組中的定位信息

表2 mPing在93-11基因組中的定位信息

圖2 mPing在93-11基因組染色體上的定位

圖3 mPing在日本晴基因組染色體上的定位

2.3 日本晴與93-11的m插入位點側(cè)翼序列分析

轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座會影響其側(cè)翼基因的表達(dá)，在基因的結(jié)構(gòu)和進化過程中具有重要的作用[8]。因此對m所有拷貝的側(cè)翼序列上下游5 kb進行功能基因的同源性探尋。研究發(fā)現(xiàn)，m插入到了日本晴基因組中的某些基因的上游、下游以及內(nèi)部，93-11基因組中的某些基因的上游和下游。日本晴中有23個m側(cè)翼序列與已知功能基因有100%的同源性，這些已知基因中有與擬南芥相關(guān)的轉(zhuǎn)座酶蛋白基因、與抗性相關(guān)的蛋白基因等(表3)。同時，m插入到了1號染色體中的AK073838，11號染色體中的AK109523，12號染色體中的AK243131基因的內(nèi)部。93-11中有3個m側(cè)翼序列與已知的功能基因有100%的同源性，且m均插入到了基因的上游區(qū)域(表4)。

表3 日本晴中mPing的側(cè)翼序列分析

表4 93-11中mPing的側(cè)翼序列分析

3 討論

轉(zhuǎn)座子的移動會影響宿主基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進化[2-5,22-26]。在本研究中，我們以MITE類轉(zhuǎn)座子為研究對象，探討了以其多樣性為主要原因的水稻亞種間的基因組差異。結(jié)果表明，在日本晴和93-11基因組中，m的分布和類型均有較大差異。日本晴基因組中只存在m-1一種類型，共有52個拷貝；93-11基因組中有m14個，包括3個m-1和11個m-2。這與Hu等的研究結(jié)果，粳稻品種中m-1所占比例高于m-2，而秈稻品種m2所占比例高于m-1一致[18]。m在水稻亞種基因組中分布比例和位置的差異，暗示m在水稻馴化歷史中有著不可忽視的作用；同時，m有望作為一種分子標(biāo)簽來快速鑒別水稻亞種。另一方面，m往往會插入到基因中或者基因附近[14]，為了研究m與側(cè)翼基因的關(guān)系，本研究對m所在位置的上下游延伸5 kb序列進行功能基因的同源性探尋，發(fā)現(xiàn)日本晴中有24個序列與已知基因序列100%同源，93-11中有3個序列與已知基因100%同源，并且日本晴中有3個基因內(nèi)部插入了m，這3個基因與抗性基因、漆酶基因和細(xì)胞分裂基因有關(guān)，暗示著m在調(diào)控這3類基因表達(dá)的過程中存在一定的潛在影響。同時，日本晴和93-11中除了1個已知基因相同，剩余基因不相同，說明這些原因可能是導(dǎo)致日本晴和93-11基因組差異性的原因。然而m的插入機制、它在宿主基因組中對側(cè)翼基因表達(dá)的影響、及其在水稻進化歷史中的作用，有待進一步探索和研究。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Comparison of MITE transposons min different rice subspecies

Ning Zhang1*, Yanan Ruan1*, Shanshan Wang1,2, Yang Liu1, Chen Zhao1, Jingjing Wang1, Kaixi Wang3, Yanli Wang1, and Hongyan Wang1

1,,110036,,2,850000,,Liaoning Institute of Soil and Water ConservationChaoyangLiaoningChina

The mfamily is the first active MITE TE family identified in rice genome. In order to compare the compositions and distributions of mfamily in the genomes of two rice subspecies(cv. Nipponbare) and(cv. 93-11), we initially estimated the copy numbers of mfamily in those two subspecies using Southern blot and then confirmed the results by searching homologous copies in each reference genome using Blastn program, which turned out to have 52 and 14 mcopies in corresponding reference genome, respectively. All mmembers in Nipponbare genome belong to m-1, while there are 3 m-1 and 11 m-2 copies in 93-11 genome. By further investigating the 5-kb flanking sequences of those mcopies, it was found that 23 and 3 protein-coding genes in Nipponbare and 93-11 genome are residing adjacent to those mcopies respectively. These results establish the preliminary theoretical foundation for further dissecting the genetic differences of japonica and indica rice in terms of the diversities and distributions of their component m.

,, transposon, m, rice

December 25, 2015; Accepted:April 12, 2016

Hongyan Wang. Tel: +86-24-62202232; E-mail: hongyan2003@126.com *These authors contributed equally to this work.

Supported by:Natural Science Foundation of China (No. 31100172), Program for Liaoning Excellent Talents in University (No. LJQ2013003), Youth Foundation of Liaoning University (No. 2010LDQN04).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31100172)，遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃(No. LJQ2013003)，遼寧大學(xué)青年科研基金 (No. 2010LDQN04) 資助。

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