不同類型牛GPR54基因啟動(dòng)子變異與其表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性

王學(xué)故，鄧丹妹，程　晉，王　揚(yáng)，李　彤，陳宏權(quán)，2*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036； 2.安徽畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036)

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不同類型牛GPR54基因啟動(dòng)子變異與其表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性

王學(xué)故1，鄧丹妹1，程晉1，王揚(yáng)1，李彤1，陳宏權(quán)1，2*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036； 2.安徽畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036)

旨在研究不同類型牛GPR54基因啟動(dòng)子的變異對(duì)其表達(dá)水平的影響，以揭示牛GPR54基因多態(tài)性與牛早熟性之間的關(guān)聯(lián)性。提取荷斯坦牛、皖東黃牛及江淮水牛3種牛血液白細(xì)胞總RNA，通過PCR、測(cè)序、RT-PCR和雙熒光素酶報(bào)告基因的方法，檢測(cè)不同牛GPR54基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性，啟動(dòng)子效率以及GPR54基因的表達(dá)水平，分析啟動(dòng)子變異在牛品種、年齡和性別間對(duì)GPR54基因表達(dá)的效應(yīng)。結(jié)果表明，GPR54基因啟動(dòng)子存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，3種牛的啟動(dòng)子型存在明顯的差異，其中荷斯坦牛GPR54基因啟動(dòng)子效率是江淮水牛的4.44倍，是皖東黃牛的1.99倍，而皖東黃牛啟動(dòng)子效率是江淮水牛的2.24倍。RT-PCR顯示，青年牛GPR54基因表達(dá)水平高于成年牛；荷斯坦牛高于皖東黃牛和水牛，水牛的GPR54表達(dá)水平最低；母牛的GPR54基因表達(dá)水平極顯著高于公牛(P<0.01)。綜上表明，不同牛的早熟性與GPR54啟動(dòng)子存在密切的關(guān)聯(lián)性。

牛；早熟性；GPR54基因；啟動(dòng)子效率

初情期(Puberty)是動(dòng)物性器官發(fā)育成熟度的標(biāo)志，其出現(xiàn)的早晚作為牛的一個(gè)重要性狀，與繁殖、生產(chǎn)壽命、經(jīng)濟(jì)效益等密切相關(guān)[1]。研究證實(shí)，初情期是在GnRH神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的促性腺激素脈沖分泌模式下啟動(dòng)[2]，此后生殖器官和附屬性腺發(fā)育成熟，達(dá)到性成熟(Sexual maturatity)，此時(shí)機(jī)體生長發(fā)育等重要經(jīng)濟(jì)性狀的發(fā)育已進(jìn)入成熟階段，為其經(jīng)濟(jì)利用奠定了基礎(chǔ)。不同類型牛的性成熟時(shí)間存在較大差異，生產(chǎn)性能千差萬別，很大程度上依賴于初情期的啟動(dòng)與調(diào)控模式[1-2]。

KISS-1/GPR54系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物生殖內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)中起著中樞調(diào)控作用，其對(duì)青春期啟動(dòng)意義引起研究者的高度關(guān)注[3-5]。研究表明，GPR54與kisspeptin結(jié)合，活化GnRH表達(dá)，打開下丘腦—垂體—性腺軸，啟動(dòng)青春期發(fā)育[6]。GPR54是G蛋白偶連受體，包含7個(gè)跨膜的疏水結(jié)構(gòu)域和N-端的3個(gè)糖基化作用位點(diǎn)，kisspeptin為其內(nèi)源性配體[7-8]。GPR54基因的表達(dá)水平直接決定與Kisspeptin的結(jié)合，影響性成熟。GPR54基因表達(dá)受其啟動(dòng)子的調(diào)控，研究表明，不同類型牛GPR54基因啟動(dòng)子GPR54-973區(qū)域存在3個(gè)特異SNP位點(diǎn)，形成不同類型牛的啟動(dòng)子基因型，如地方黃牛啟動(dòng)子型為AATTCC、荷斯坦牛和西門塔爾牛的啟動(dòng)子型為CCCCTT，以及地方水牛為CCTTCC[9]。但不同類型牛啟動(dòng)子差異與GPR54基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性卻鮮有報(bào)道，有關(guān)不同類型牛GPR54基因表達(dá)水平及其規(guī)律的研究也不多見。本研究基于不同類型牛GPR54基因的啟動(dòng)子變化，構(gòu)建其表達(dá)載體，利用雙報(bào)告基因檢測(cè)和qPCR等方法，研究不同類型牛血液白細(xì)胞GPR54基因的表達(dá)水平以及啟動(dòng)子效率，探討不同類型牛啟動(dòng)子與GPR54基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)牛與樣品采集

依據(jù)不同類型牛GPR54-973啟動(dòng)子基因型，采集中國地方皖東黃牛(16頭)和江淮水牛(7頭)、荷斯坦牛(15頭)血液樣品。采集試驗(yàn)牛血液樣品8 mL(分裝2管，Trizol保護(hù))和適量耳組織樣品，置于干冰保存，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2血液白細(xì)胞收集培養(yǎng)和總RNA提取

取3 mL抗凝血加入3倍體積的PBS緩沖液混勻，450 g離心15 min，棄上清，留下白細(xì)胞沉淀，再用1 mL PBS緩沖液沖洗1～2次。用含有10%胎牛血清的DEME Basic(Gibco)培養(yǎng)基重懸白細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移到25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5.0% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取1 mL血樣加入3 mL紅細(xì)胞裂解液，4 ℃，450 g離心15 min，去除紅細(xì)胞，留下白細(xì)胞沉淀，利用RNA提取試劑盒(Biomega)提取牛血液白細(xì)胞RNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的品質(zhì)，并用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度及純度。

1.3白細(xì)胞GPR54基因表達(dá)量測(cè)定

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen公司)，合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL。另取每頭牛的耳組織，用試劑盒(天根)提取耳組織DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的品質(zhì)。

根據(jù)牛GPR54 mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：NC-007305)和牛的β-actinmRNA序列(GenBank登錄號(hào)：NM_173979.3)利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物有限公司進(jìn)行合成，PAGE純化。引物WXG-1擴(kuò)增片段長度為222 bp，上游序列：5′-GGACGAAGAGGGTGGCAAT-3′，下游序列：5′-GGCAGATGACGAAGATGACC-3′；β-actin擴(kuò)增片段長度167 bp，上游序列：5′-CCAACGTGTCTGTTGTGGAT-3′，下游序列：5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。使用Qiagen公司的SYBR Green PCR Kit 試劑盒進(jìn)行定量試驗(yàn)，20 μL反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master 10 μL，QN ROX reference dye 2 μL，cDNA 1 μL，引物(F+R) 2.8 μL，RNase-free water 4.2 μL。熒光定量反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)4次。

1.4啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增與SNP檢測(cè)

用WXG-2引物(上游序列：5′-GGCAGGCAGATTCCTAACCACTAG-3′，下游序列：5′-TCAACCTTCCCAAGACTCTGATGC-3′)擴(kuò)增GPR54基因的啟動(dòng)子區(qū)(GPR54-973)，PCR反應(yīng)體系：ddH2O 34 μL，dNTPs 4 μL，10×Easy Taq Buffer 5 μL，Taq1 μL，WXG-2(上下游)共4 μL，DNA 2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)(95 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存產(chǎn)物。對(duì)PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠，緩沖液為1×TBE電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送華大生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，并分析其SNPs。

1.5啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因分析

1.5.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)牛5′啟動(dòng)子區(qū)序列(GenBank登錄號(hào)：GU289736.1)，用WXG-3引物克隆下含有酶切位點(diǎn)的牛5′啟動(dòng)子區(qū)片段，與空白質(zhì)粒連接，同時(shí)對(duì)陽性重組質(zhì)粒測(cè)序，鑒定重組質(zhì)粒。WXG-3引物序列：上游：5′-CGA-CGCGTGGCAGGCAGATTCCTAACCACTAG-3′，下游：5′-GCCTCGAGATTGCCACCCTCTTCGT-CCTGA-3′。

1.5.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及雙熒光素酶檢測(cè)用FuGENE?6 Transfection Reagent(Promega)轉(zhuǎn)染試劑將鑒定正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入293T細(xì)胞內(nèi)，在培養(yǎng)24～48 h，用Dual-Glo?Luciferase Assay System(Promega)試劑檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.6數(shù)據(jù)處理

通過ABIStepOneTMSoftware V2.2 軟件以及SPSS 17.0軟件對(duì)定量結(jié)果和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，同時(shí)利用最小二乘法建立GPR54基因表達(dá)量與性別、年齡和種屬(品種)的線性建模：Yijkl=μ+Bi+Aj+Sk+eijkl。其中Y為表達(dá)水平RQ值，μ為群體平均值，Bi為牛的類型效應(yīng)值，Aj為牛年齡的效應(yīng)值，Sk代表牛性別的效應(yīng)值，eijkl為誤差。統(tǒng)計(jì)分析不同牛的啟動(dòng)子效率與GPR54基因的關(guān)聯(lián)性。

2　結(jié)　果

2.1不同類型牛GPR54基因啟動(dòng)子變異

預(yù)測(cè)3種牛GPR54基因啟動(dòng)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CDS上游973 bp片段(記為GPR54-973)中存在2個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域Promoter 1和Promoter 2，其中皖東黃牛和荷斯坦牛的2個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域均分別位于-888～-638 bp和-379～-130 bp，江淮水牛分別位于-885～-636 bp和-379～-130 bp；不同類型牛Promoter 1之間存在多處核苷酸差異，而Promoter 2中僅江淮水牛發(fā)生1處核苷酸替換。如果連接變異點(diǎn)作為基因型的話，則(小寫字母位于啟動(dòng)子區(qū)域，帶下劃線的核苷酸是皖東黃牛樣本群體內(nèi)SNP位點(diǎn)，帶*號(hào)為缺失)：皖東黃?；蛐蜑锳ATTtgccgacggcgCTGACTTCGTcGACAA，荷斯坦牛基因型為ACTTcgccgatagcgCTGACTTCGTcGACAA，江淮水?；蛐蜑镃C**ta*ttgctaaaA**TGGGACCaAGGGC。

比較牛群內(nèi)部的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，皖東黃牛GPR54-973片段存在3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，檢測(cè)出3種基因型CCCCTT、AATTCC和ACTCCT，分別位于-946、-816和-754 bp，荷斯坦牛(CCCCTT)和江淮水牛(CCTTCC)均為純合子。結(jié)果顯示皖東黃牛GPR54含有西門塔爾牛的遺傳背景。

2.2不同類型牛啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率分析

根據(jù)檢測(cè)出的基因型，利用皖東黃牛的3種基因型的SNP位點(diǎn)進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，其結(jié)果如表1。CCT基因組合啟動(dòng)效率是ATC組合的3倍，是ATC/CCT型的1.39倍。雜合型的啟動(dòng)子表現(xiàn)為中間效應(yīng)。該項(xiàng)啟動(dòng)子效率的測(cè)定與牛白細(xì)胞GPR54基因表達(dá)RQ值一致。

表1 皖東黃牛不同SNP型啟動(dòng)子對(duì)熒光素酶的啟動(dòng)效率

Table 1The efficiency of the promoters with different SNP genotypes to the luciferase expression in Wandong cattle

SNP-type報(bào)告基因Reportergene熒光值(螢火蟲/海腎)Fluorescencevalue(firefly/seakidney)相對(duì)ATC型/%RelativetoATCtype基因型Genotype白細(xì)胞GPR54基因表達(dá)RQ值ExpressionlevelofGPR54geneinleukocytes(RQvalue)ATC1.58±0.16C100.00AATTCC0.59±0.05CCCT4.74±0.08A300.00CCCCTT2.18±0.17AATC/CCT3.42±0.07B216.46CACTTC1.30±0.14B

A、B、C表示組間差異極顯著

A，B and C showed that the differences between SNP-types were very significant(P<0.01)

檢測(cè)3種類型牛GPR54基因啟動(dòng)子的雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果見表2。表2表明，3種牛啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率存在著極顯著的差異，其中荷斯坦牛GPR54基因啟動(dòng)子效率是江淮水牛的4.44倍，是皖東黃牛的1.99倍；皖東黃牛啟動(dòng)子效率是江淮水牛的2.24倍。

表2不同類型牛GPR54基因啟動(dòng)子效率比較

Table 2Efficiency comparison ofGPR54 gene promoters to the luciferase expression in different types of bovines

GPR54-973熒光值(螢火蟲/海腎)1Fluorescencevalue(firefly/seakidney)相對(duì)江淮水牛/%RelativetoJianghuaibuffalo荷斯坦牛Holstein6.54±0.79A444.90皖東黃牛2Wandongcattle3.29±1.18B223.81江淮水牛Jianghuaibuffalo1.47±0.10C100.00

1.字母A、B、C表示組間差異極顯著；2.混合啟動(dòng)子型

1.A，B and C showed that the differences between types of bovines were very significant(P<0.01)；2.Mixed promoter types

2.3不同類型牛白細(xì)胞GPR54基因的表達(dá)水平

利用線性模式分析荷斯坦牛、皖東黃牛和江淮水牛血液白細(xì)胞GPR54基因的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。所有牛GPR54基因表達(dá)的群體RQ均值為1.48，荷斯坦牛、皖東黃牛和江淮水牛的遺傳效應(yīng)分別為0.70、0.17和-0.87。荷斯坦牛和皖東黃牛的GPR54基因的表達(dá)水平分別是江淮水牛的4.34和2.25倍(P<0.01，圖1A)，表明不同類型牛啟動(dòng)子差異對(duì)GPR54基因的表達(dá)具有顯著的影響，并且與所發(fā)現(xiàn)的3個(gè)SNP位點(diǎn)存在明顯的關(guān)聯(lián)性。

年齡和性別對(duì)GPR54基因的表達(dá)水平也具有明顯的影響。<24月齡和>24月齡年齡效應(yīng)分別為0.39和-0.39；<24月齡牛表達(dá)水平比>24月齡牛高出90.84%(P<0.01，圖1B)，顯示年輕牛GPR54基因表達(dá)水平較年長牛高。公牛和母牛的效應(yīng)分別為-0.28和0.28；在不同性別牛間，母牛的表達(dá)水平是公牛的3.75倍(P<0.01，圖1C)。

**.P<0.01圖1　不同類型牛血液白細(xì)胞GPR54基因表達(dá)水平Fig.1　Changes of GPR54 gene expression in the blood leukocytes of different types of bovines

3　討　論

牛的早熟性是一個(gè)重要生產(chǎn)性狀，通過其初情期早晚來體現(xiàn)。初情期受到營養(yǎng)、年齡和遺傳因素的影響，其中遺傳因素決定著早熟性的一系列激素調(diào)控過程[1]，環(huán)境因素的改變可能會(huì)影響初情期正常來臨的具體時(shí)間，但這種生理變化只是性狀變異的一種環(huán)境組分。早熟性是不同類型牛種質(zhì)特性的重要組成部分，不同類型牛通過進(jìn)化形成了特定的早熟性，其中乳牛早于肉牛，水牛較晚[10]，基于比較基因組學(xué)研究早熟性的物種間差異對(duì)探明性狀形成的原因具有重要意義。已經(jīng)證實(shí)青春期啟動(dòng)在物種間存在相同的機(jī)制，包括KISS1、GPR54、GnRH1和GnRHR等在內(nèi)的多種激素及受體是青春期啟動(dòng)的關(guān)鍵基因[11]，其中GPR54的激活能觸發(fā)GnRH的釋放[12]。有關(guān)相同的啟動(dòng)機(jī)制在不同類型牛間產(chǎn)生青春期早晚差異問題，有研究證實(shí)與GPR54啟動(dòng)子多態(tài)性有關(guān)[13-14]。

GPR54基因多態(tài)性在動(dòng)物中廣泛存在，豬[15]和羊[16-17]等具有幾乎與牛相同的啟動(dòng)子多態(tài)位點(diǎn)，這種多態(tài)性已經(jīng)由選擇的作用加以固定，成為物種的一個(gè)特性。如本研究GPR54啟動(dòng)子3個(gè)SNP位點(diǎn)分別在荷斯坦牛(CCCCTT)和江淮水牛(CCTTCC)表現(xiàn)為純合型，而皖東黃牛存在3種基因型可能與其形成過程混雜地方純種黃牛(AATTCC)和西門塔爾牛(CCCCTT)[14]血緣有關(guān)。調(diào)控試驗(yàn)證實(shí)，荷斯坦牛GPR54啟動(dòng)子型增加GPR54表達(dá)的效率最高，本地黃牛次之，水牛最低，顯示在超越牛種屬間早熟性差異仍然與GPR54基因的多態(tài)性密切相關(guān)。

本研究的結(jié)果同時(shí)也揭示GPR54的調(diào)控作用不僅僅發(fā)生在牛的初情期，與后期性狀的發(fā)育存在很大的關(guān)聯(lián)性。在小鼠、大鼠、猴和豬等多種動(dòng)物的研究中，GPR54基因在下丘腦中的表達(dá)量在初情期是明顯增加的，且體內(nèi)注射Kisspeptin能促進(jìn)LH的分泌[18-19]；小尾寒羊母羊發(fā)情期其下丘腦GPR54基因表達(dá)量顯著高于發(fā)情周期的其他階段[20]。這表明GPR54的表達(dá)在生長發(fā)育的不同階段雖然存在差異，但對(duì)促進(jìn)GnRH、FSH和LH的釋放[21]仍然具有重要意義。在本研究結(jié)果中，牛血液白細(xì)胞中GPR54基因表達(dá)水平與年齡和性別存在顯著關(guān)聯(lián)性，其中，2歲以下牛顯著高于2歲以上牛，母牛高于公牛。

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(編輯 程金華)

The Relationship between the Expression Variations ofGPR54 Gene and the Polymorphisms ofGPR54 Promoters in Different Types of Bovines

WANG Xue-gu1，DENG Dan-mei1，CHENG Jin1，WANG Yang1，LI Tong1，CHEN Hong-quan1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China；2.KeyLaboratoryofAnhuiLocalLivestockandPoultryGeneticResourcesConservationandBiobreedingofAnhuiProvince，Hefei230036，China)

The aim of the study is to investigate the impact of the variations ofGPR54 promoter on the expression levels ofGPR54 gene in Holstein (HT)，Wandong cattle (WD) and Jianghuai buffalo (JH)，therefore further unveil the association between the polymorphisms ofGPR54 gene promoter and the sexual precocity.Total RNAs in leukocytes of HT，WD and JH were extracted and the polymorphism of the promoter region were detected by PCR and sequencing.Furthermore，the efficiency of the promoters were determined via RT-PCR and luciferase expression from the fusion reporter gene.Various SNPs were detected in the promoter regions ofGPR54 genes in HT，WD and JH with significant difference.Moreover，it was shown that the promoter efficiency of HT was 4.44 times and 1.99 times higher compared to JH buffalo and WD respectively.Meanwhile the promoter efficiency of WD was 2.24 times higher than JH.Notably，the RT-PCR results showed thatGPR54 gene expression levels in youngsters were dramatically higher than that of the adults especially in HT than in WD and JH.JH showed the weakest expression level ofGPR54 while the cows exhibited the strongestGPR54 expression level compared to ox (P<0.01).These results indicated that the polymorphisms ofGPR54 promoter and the bovine sexual precocity were evidently correlated.

bovine；sexual precocity；GPR54 gene；promoter efficiency

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.010

2016-03-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272402)

王學(xué)故(1991-)，男，安徽利辛人，碩士生，主要從事動(dòng)物分子遺傳育種研究，E-mail：1055069260@qq.com

陳宏權(quán)，教授，博導(dǎo)，主要從事動(dòng)物分子遺傳育種研究，E-mail：chqchq@ahau.edu.cn

S823.2

A

0366-6964(2016)09-1824-06