牦牛脾臟TF理化性質(zhì)和部分生物學(xué)特性的測(cè)定

文 英，寧 鵬，李 莉，常建軍

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

牦牛脾臟TF理化性質(zhì)和部分生物學(xué)特性的測(cè)定

文 英，寧 鵬，李 莉，常建軍

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

采用凍融—透析法提取了牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子（transfer factor，TF），并對(duì)其澄明度、pH值等理化性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定和分析，同時(shí)對(duì)牦牛脾臟TF進(jìn)行了無(wú)菌檢驗(yàn)、熱原檢驗(yàn)、安全性試驗(yàn)、過(guò)敏試驗(yàn)、體外抑菌試驗(yàn)等部分生物學(xué)特性檢測(cè)和分析。結(jié)果表明，用該方法提純的牦牛脾臟TF含有DNA、核苷酸等，無(wú)菌，無(wú)熱原，無(wú)毒性，無(wú)致敏性，無(wú)抗原性，符合生物制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該研究對(duì)牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子的開發(fā)利用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

轉(zhuǎn)移因子；理化性質(zhì)；生物學(xué)特性；脾臟；牦牛

轉(zhuǎn)移因子（transfer factor，TF）是從淋巴細(xì)胞中提取制得的一種多核苷酸和多肽小分子物質(zhì)，它能轉(zhuǎn)移多種抗原的細(xì)胞免疫，包括真菌、細(xì)菌、病毒、寄生蟲、組織相容性抗原和腫瘤抗原的細(xì)胞免疫，是一種新型免疫增強(qiáng)制劑［1］。實(shí)踐證明，該制劑對(duì)人體安全無(wú)毒，無(wú)藥殘，口服或注射同樣有免疫活性。近年來(lái)，我國(guó)已陸續(xù)開展了對(duì)畜禽TF的研究和應(yīng)用，先后試制了豬、羊、馬、兔、牛以及犬的非特異性TF和特異性TF［2］，在畜禽疾病的防治上已取得了可喜的成績(jī)，但對(duì)其他動(dòng)物來(lái)源的轉(zhuǎn)移因子研究很少。生活在青藏高原上的牛、羊，由于本地區(qū)自然生態(tài)因素的不斷作用和影響，形成了許多適應(yīng)特殊生態(tài)環(huán)境的生態(tài)學(xué)特征和生理特點(diǎn)，如耐寒怕熱、喜干燥怕潮濕、耐低壓和耐缺氧等，因而對(duì)其生活環(huán)境形成了很強(qiáng)的免疫能力。該試驗(yàn)依托青藏高原特有的牦牛物種為材料，提取具有激活機(jī)體細(xì)胞免疫功能效應(yīng)的轉(zhuǎn)移因子，并對(duì)其理化性質(zhì)及部分生物學(xué)活性進(jìn)行了測(cè)定，以期為牦牛轉(zhuǎn)移因子的開發(fā)應(yīng)用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料：牦牛脾臟，取材于青海省樂(lè)家灣屠宰場(chǎng)，-40℃冰箱保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明系小白鼠16只、體重18～22 g，由青海省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。兔6只、豚鼠6只，購(gòu)于青海省城北興惠養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備：FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）、TD24-WS低速臺(tái)式離心機(jī)、TDZ5-WS湘儀離心機(jī)、電熱手提式壓力蒸汽滅菌器（上海醫(yī)用核子儀器廠）、LRH系列生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）等。

1.1.4 菌株：金黃色葡萄球菌（P25）、大腸埃希菌（W18）、沙門菌（81050），由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系預(yù)防實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.5 培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH（A）培養(yǎng)基、肝塊肉湯培養(yǎng)基、血液瓊脂平板，均按常規(guī)方法制作。

1.1.6 濾紙片的制：用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm的圓形紙片，裝于潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，高壓滅菌后在溫箱中烘干。將無(wú)菌圓形濾紙片浸泡于制備的轉(zhuǎn)移因子中2 h，制成提取液濾紙片備用。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)移因子的制備：將凍存的牦牛脾臟取出融化，去脂肪、被膜，充分洗凈。用組織搗碎機(jī)絞碎，加適量生理鹽水后，用高速組織搗碎機(jī)高速（12 000 r/min）勻漿2次，每次1 min。將勻漿置-20℃反復(fù)凍融3次。最后一次融化后以3 000 r/min離心30 min，取上清液，將上清液置透析袋內(nèi)，用無(wú)熱原的冷生理鹽水在0～4℃環(huán)境下透析過(guò)夜，收集袋外透析液（即為制備的轉(zhuǎn)移因子）于-20℃保存?zhèn)溆茫?-4］。

1.2.2 澄明度：肉眼直接觀察牦牛脾臟TF提取物的澄明度，辨識(shí)其氣味。

1.2.3 pH值：用精密pH試紙測(cè)定。

1.2.4 蛋白質(zhì)反應(yīng)：取少量透析外液用25%磺基水楊酸檢測(cè)，觀察有無(wú)白色渾濁物出現(xiàn)。

1.2.5 提取液生物學(xué)活性檢測(cè)：無(wú)菌檢驗(yàn)、熱原檢驗(yàn)、安全性試驗(yàn)及過(guò)敏試驗(yàn)均按《中國(guó)生物制品規(guī)程 2000 版暫行規(guī)程》［5］要求進(jìn)行。

1.2.5.1 無(wú)菌檢驗(yàn)：將提取液接種于普通肉湯、血液瓊脂斜面、普通瓊脂斜面、肝塊肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7 d，觀察有無(wú)細(xì)菌等微生物生長(zhǎng)。

1.2.5.2 熱原檢驗(yàn)：兔子6只，隨機(jī)分為2組，測(cè)其體溫正常后15 min內(nèi)耳靜脈緩緩注入溫?zé)嶂良s38 ℃的 TF 樣品，劑量為 3 mL/（kg·BW），然后，每隔1 h測(cè)1次體溫，共測(cè)3次，觀察并判斷結(jié)果。

1.2.5.3 安全性試驗(yàn)：取小鼠16只，隨機(jī)等分為4組。第1組腹腔注射待檢TF液0.5 mL/只；第2組腹腔注射待檢TF液1.0 mL/只；第3組腹腔注射待檢TF液2.0 mL/只；第4組注射生理鹽水2.0 mL/只作對(duì)照。觀察7 d，全部剖殺，檢查各組織臟器情況。

1.2.5.4 過(guò)敏試驗(yàn)：取豚鼠6只，隔日腹腔注射供試品0.5 mL/只，連續(xù)3次；然后將其中4只豚鼠隨機(jī)分成2小組作為試驗(yàn)組，每組2只，分別于第1次注射后14 d及21 d靜脈注射供試品0.5 mL/只，注射后15 min內(nèi)觀察并判斷結(jié)果。剩余2只作對(duì)照。

1.2.5.5 體外抑菌試驗(yàn)：按劉湘新等［6］介紹的方法進(jìn)行操作，按一般制備培養(yǎng)基方法無(wú)菌培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌。挑取3株菌株的MH純培養(yǎng)物，分別用滅菌的生理鹽水洗下稀釋并與麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，選取5×107～5×108個(gè)/mL濃度，15 min內(nèi)用無(wú)菌棉拭子蘸取已校正的菌液，涂布在4 mm厚MH（A）平板表面，每塊平板涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)60°，均勻接種，干燥平板3～5 min后。每個(gè)培養(yǎng)皿按梅花形放5個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)中放入浸有TF注射液的圓形濾紙片，37℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果。結(jié)果判定：抑菌直徑＞15 mm為高敏（S），抑菌直徑 10～15 mm 為中敏（I），抑菌直徑＜10 mm為低敏（L），無(wú)抑菌圈為不敏感（R）［7］。

1.2.5.6 牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子活性分析：采用白細(xì)胞黏附抑制試驗(yàn)測(cè)定牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子活性。

2 結(jié)果

2.1 澄明度 牦牛脾臟TF提取物為透明、淡黃色、微腥味的液體。

2.2 pH值 經(jīng)檢測(cè)牦牛脾臟TF提取物的pH值在7.0左右，符合制劑要求。

2.3 蛋白質(zhì)反應(yīng) 蛋白質(zhì)反應(yīng)未出現(xiàn)混濁或沉淀，說(shuō)明牦牛脾TF中不含大分子蛋白質(zhì)。

2.4 無(wú)菌檢驗(yàn) 將提取液接種于普通肉湯、血液瓊脂斜面、普通瓊脂斜面、肝塊肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7 d后，觀察均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.5 熱原檢驗(yàn) 經(jīng)注射牦牛脾臟TF提取液的兔體溫沒有升高現(xiàn)象，熱原試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.6 安全性試驗(yàn) 注射牦牛脾臟提取液小鼠與對(duì)照組小鼠一樣，精神、食欲、毛色及活動(dòng)狀況均正常，無(wú)一例死亡。剖檢后內(nèi)部臟器無(wú)異常變化，表明安全性試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.7 過(guò)敏試驗(yàn) 6只豚鼠第14天及第21天靜脈注射供試品后15 min內(nèi)未見連續(xù)干咳、呼吸困難、虛脫等明顯病理癥狀及死亡等現(xiàn)象，注射部位也未見異?，F(xiàn)象，說(shuō)明過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.8 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌對(duì)牦牛脾臟TF均呈中度敏感（見表1）。

表1 牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.9 牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子活性分析 牦牛脾臟TF提取物黏附白細(xì)胞抑制指數(shù)（NAI）為31%，NAI≥20%，判定為活性合格。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)采用的透析方法［6］簡(jiǎn)便、低廉、易于操作，不需要特殊的設(shè)備和器材，制得的牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子為成分復(fù)雜的混合物，含有DNA、核苷酸等，具有和其他動(dòng)物脾TF相似的理化性質(zhì)，無(wú)菌，無(wú)毒性，無(wú)熱原，無(wú)致敏性，無(wú)抗原性，符合獸醫(yī)臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)。該結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子提供了試驗(yàn)依據(jù)。

體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，牦牛脾臟TF對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌有一定的抑制作用，呈中度敏感，與喬宏興等［8］抑菌試驗(yàn)結(jié)果比較，該試驗(yàn)結(jié)果敏感程度不高，這與所用判定標(biāo)準(zhǔn)不同有一定關(guān)系。而牦牛轉(zhuǎn)移因子對(duì)細(xì)菌病的預(yù)防和臨床治療效果則有待進(jìn)一步研究。

［1］朱其太.轉(zhuǎn)移因子及其在動(dòng)物疾病防治中的應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，1992，22（1）：4-6.

［2］劉潤(rùn)珍，李世雄，姜力，等.毛皮動(dòng)物用轉(zhuǎn)移因子的研究與應(yīng)用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，1996（8）：4-6.

［3］孔慶波，陳進(jìn)軍，常建軍，等.豬犬脾TF的提取及理化性質(zhì)和部分生物學(xué)特性測(cè)定 ［J］.中國(guó)獸藥雜志，2007，41（5）：5-9.

［4］孔慶波，陳進(jìn)軍，常建軍，等.豬轉(zhuǎn)移因子對(duì)犬中性粒細(xì)胞數(shù)量和活性的影響［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（1）：47-51.

［5］中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).中國(guó)生物制品規(guī)程2000版暫行規(guī)程［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［6］劉湘新，劉進(jìn)輝，何湘蓉，等.轉(zhuǎn)移因子的制備與生物活性研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2005（6）：33-35.

［7］CONWAY P L.Development of intestinal microbiota［M］//MACKIE R I，WHITE B A，ISAACSON R E.Gastrointestinal Microbiology.Volume 2：Gastrointestinal Microbes and Host Interactions.New York：Chapman&Hall，1996：3-38.

［8］喬宏興，白靜.豬脾轉(zhuǎn)移因子的制備及臨床應(yīng)用［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（7）：203-205.

Physical and Chemical Properties of Transfer Factor（TF） in Yak Spleen and Determination of Its Selected Biological Characteristics

WEN Ying，NING Peng，LI Li，CHANG Jian-jun
（College of Agricultural and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining 810016，China）

In this study，the transfer factor （TF） in yak spleen was extracted by using freezing-thawing-dialysis method.The physical and chemical properties of the extracts,such as clarity and pH values,were determined and analyzed.The sterility test,pyrogen test,safety test,allergy test and in vitro antibacterial test were carried out to biologically characterize the extracted TF.The results revealed that the TF extracted by the method contained DNA and nucleotide acid,and it was germ free,non-pyrogen,non-toxic,non-allergic,non-antigenic.All of the tested indicators of the extracted TF complied with the quality standard of biological preparation.The results of the study provide experimental basis for the development and application of TF in yak spleen.

transfer factor；physical and chemical properties；biological characteristics；spleen；yak

S859.79；S852.4

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）05-0001-02

2016-05-12

項(xiàng)目來(lái)源：青海省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（2014-HZ-801）。

文英（1974—），女，副教授，碩士，主要研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。

常建軍（1969—），男，教授，碩士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品衛(wèi)生檢驗(yàn)和安全性。

（責(zé)任編輯：錢英紅）