17α-甲基睪酮對(duì)斑馬魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)的影響

劉少貞，呂文琪，呂小也

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

17α-甲基睪酮對(duì)斑馬魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)的影響

劉少貞，呂文琪，呂小也

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

為評(píng)價(jià)17α-甲基睪酮（17α-methyltestosterone，MT）對(duì)斑馬魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)的影響，利用MT處理斑馬魚雌、雄魚7 d，采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)雌、雄魚肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，MT處理雌魚7 d，25 ng/L處理組肝臟vtg基因的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），50 ng/L和100 ng/L的MT處理組肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量極顯著降低 （P＜0.01）；MT處理雄魚7 d，25 ng/L處理組肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比差異不顯著 （P＞0.05），50 ng/L的MT處理組肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量顯著升高 （P＜0.05），100 ng/L的MT處理組肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）。斑馬魚肝臟vtg基因?qū)T比較敏感，可以作為監(jiān)測(cè)環(huán)境中MT的生物標(biāo)志物。

17α-甲基睪酮；斑馬魚；肝臟；vtg

環(huán)境中的雄激素主要有3個(gè)來源：造紙廠生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生雄激素，隨著造紙廠污水的排放從而進(jìn)入環(huán)境中；污水處理廠會(huì)產(chǎn)生一定量的雄激素；農(nóng)業(yè)活動(dòng)中會(huì)有一定量的雄激素排放到環(huán)境中［1］。17α-甲基睪酮（17α-methyltestosterone，MT）是天然雄激素睪酮的17-α位甲基衍生物，也是一種重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。研究表明，MT能夠顯著降低底鱂雄魚體內(nèi)的睪酮（T）和11-酮基睪酮（11-KT）的含量，并能夠顯著提高底鱂雌魚卵巢中芳香化酶基因的表達(dá)［1］。雌魚對(duì)MT的敏感程度顯著高于雄魚［2］。MT在魚類體內(nèi)會(huì)被芳香化成 17α-甲雌二醇，從而發(fā)揮雌激素功能［3］。因此，暴露在含有MT環(huán)境中的雌魚，其卵巢中雌激素的分泌量會(huì)降低［4］。雄激素在體內(nèi)的作用機(jī)理尚未明確，但由雄激素受體AR介導(dǎo)的外源性激素作用途徑被多數(shù)學(xué)者認(rèn)可［5］。卵黃蛋白原（vitellogenin，VTG）是卵黃蛋白的前體，其生成是通過下丘腦—垂體—性腺（hypothalamicpituitary-gonadal，HPG）軸激活雌激素受體來實(shí)現(xiàn)的［6］。在雄魚和幼魚中，VTG的生產(chǎn)可以作為生物標(biāo)志物來檢測(cè)環(huán)境中的雌激素［7］。該研究利用MT暴露斑馬魚，采用qRT-PCR的方法檢測(cè)了肝臟vtg基因mRNA表達(dá)的變化情況，旨在為闡明MT在斑馬魚體內(nèi)的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚成魚，購(gòu)自山西省太谷縣東苑水族同一批繁殖的4月齡斑馬魚，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周后進(jìn)行暴露試驗(yàn)。

1.2 主要儀器和藥品 17α-甲基睪酮（Sigma），Trizol Reagent、RACE 試 劑 盒 （Invitrogen），Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas），6×Loading Buffer、Taq DNA 聚合酶（Sigma），dNTP mix、DNA Marker Ladder （DL 2 000）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）。

微量移液器（Eppendorf），VORTEX-6 漩渦混合器 （上海川翔生物科技有限公司），超低溫冰箱Fouma 700 SERIES（Thermo），紫外分光光度計(jì)（NanoPhotometer），冷凍低溫離心機(jī)（Pimor），PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 MT處理斑馬魚 斑馬魚成魚在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)2周后進(jìn)行暴露試驗(yàn)，MT暴露分為3個(gè)濃度處理組，分別為 25、50、100 ng/L，按 0.001%（V/V）的濃度分別溶解在無水乙醇中，對(duì)照組用0.001%（V/V）無水乙醇水溶液處理，MT暴露時(shí)間為7 d。每個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組各15尾魚，雌、雄魚分開暴露。每天定時(shí)、定量飼喂飼料。試驗(yàn)組和對(duì)照組的8個(gè)魚缸中水的體積均為30 L，采用半靜水暴露方法［8］，每天定時(shí)更換一半體積的水及相應(yīng)的暴露物質(zhì)。光照周期為 14 h/10 h（明/暗），水溫控制在（25±2）℃。

1.4 總RNA的提取、檢測(cè)和反轉(zhuǎn)錄 測(cè)量MT暴露后斑馬魚的生物學(xué)指標(biāo)，然后進(jìn)行解剖，取其性腺和肝臟。應(yīng)用Trizol一步法進(jìn)行總RNA的提取，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。反轉(zhuǎn)錄按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，Canada）試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.5 qRT-PCR 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）技術(shù)檢測(cè)雌、雄斑馬魚暴露MT 7 d后肝臟中vtg 基因的 mRNA 表達(dá)量［9］。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用 2-ΔΔCt對(duì)獲得的 qRT-PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。試驗(yàn)結(jié)果以Mean±SD表示。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件中的單因素方差分析 （Oneway ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，P＜0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。

圖1 MT暴露7 d后斑馬魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量的變化情況

2 結(jié)果與分析

該研究利用qRT-PCR方法檢測(cè)了斑馬魚雌、雄魚MT暴露7 d后，其肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，25、50、100 ng/L的MT暴露7 d后，雌魚肝臟中vtg基因的mRNA 表達(dá)均被顯著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01），尤其是50 ng/L的MT，其對(duì)雌魚肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)抑制作用最為顯著（P＜0.01，見圖1A）；對(duì)于斑馬魚雄魚，50 ng/L的MT暴露7 d后，雄魚肝臟vtg基因的 mRNA表達(dá)量顯著升高 （P＜0.05），100 ng/L的MT暴露7 d后，雄魚肝臟vtg基因mRNA的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），而25 ng/L的MT暴露7 d后，雄魚肝臟vtg基因的mRNA表達(dá)未受到顯著影響（P＞0.05，見圖 1B）。

3 討論

該試驗(yàn)研究了MT處理斑馬魚成魚7 d后雌、雄魚肝臟vtg基因mRNA表達(dá)量的變化情況，結(jié)果表明，利用50 ng/L或100 ng/L的MT處理7 d后，可引起斑馬魚雄魚肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01），提示雄激素可能參與雄魚肝臟VTG的合成。研究表明，利用4.5 ng/L的MT暴露斑馬魚雄魚7 d后，其肝臟VTG的含量顯著升高［10］。 高濃度的 MT 暴露（0.2～200 μg/L）同樣可以使黑頭軟口鰷雄魚體內(nèi)的VTG含量顯著升高［3，11］。 有學(xué)者推測(cè)，MT 之所以可以使魚類體內(nèi)的VTG含量升高，可能是由于MT被芳香化成了甲雌二醇（ME2），隨后，ME2作為雌激素通過肝臟中的雌激素受體使得vtg基因的表達(dá)升高［3］。在該研究中，利用25～100 ng/L的MT暴露7 d后，雌魚肝臟中vtg基因mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào) （P＜0.05或P＜0.01），該結(jié)果與大多數(shù)已經(jīng)報(bào)道的相關(guān)研究結(jié)果一致。Seki等［12］將日本青鱂幼魚從孵化開始一直暴露于 MT（0.35～9.98 ng/L）中直至孵化后 60 d，結(jié)果表明，雌魚體內(nèi)的VTG水平受到顯著抑制。利用MT處理羅非魚雌魚后，其肝臟中vtg基因的mRNA表達(dá)水平和VTG的水平均下降［13］。斑馬魚幼魚暴露于100、260、500 ng/L的MT后，雌魚體內(nèi)的VTG含量顯著降低［14］。 Korsgaard［15］研究表明，100 ng/L的MT能夠顯著降低綿鳚雌魚體內(nèi)的VTG水平。但是，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，利用MT（0.2 mg/L和2 mg/L）暴露黑頭軟口鰷雌魚21 d，其體內(nèi)VTG含量呈升高趨勢(shì)［11］，推測(cè)這可能是由于種間差異造成的VTG/vtg對(duì)MT有不同的響應(yīng)。綜上所述，50 ng/L的MT對(duì)斑馬魚雌魚肝臟vtg基因mRNA的表達(dá)產(chǎn)生最為顯著的影響，可以作為檢測(cè)環(huán)境中MT的生物標(biāo)志物。

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Effect of 17α-methyltestosterone(MT)on mRNA Expression of vtg Gene in Liver of Brachydanio rerio

LIU Shao-zhen，Lü Wen-qi，Lü Xiao-ye
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

This study aimed to evaluate the effect of 17α-methyltestosterone（MT） on mRNA expression of vtg gene in liver of Brachydanio rerio.The male and female Brachydanio rerio were treated with different concentrations of MT for 7 days,and qRTPCR assay were used to determine the mRNA expression of vtg gene in their livers.For female Brachydanio rerio,the mRNA expression of vtg gene in 25 ng/L MT treatment group was significantly reduced after 7 days （P＜0.05）,and that in 50 and 100 ng/L MT treatment group was extremely significantly reduced（P＜0.01）.For male Brachydanio rerio,there were no significant differences in the mRNA expression of vtg gene between 25 ng/L MT treatment group and control group after 7 days （P＞0.05）.However,the mRNA expression of vtg gene in 50 and 100 ng/L MT treatment groups was significantly and extremely significantly increased （P＜0.05 and P＜0.01）,respectively.The results suggest that the vtg gene in liver of Brachydanio rerio is sensitive to MT,and it is potential to serve as a biomarker for MT monitoring in environment.

17α-methyltestosterone；Brachydanio rerio；liver；vtg

X171.5

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）05-0009-03

2016-05-03

項(xiàng)目來源：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才博士科研啟動(dòng)費(fèi)項(xiàng)目（2014YJ08）。

劉少貞（1983—），女，講師，博士，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)。

（責(zé)任編輯：趙俊利）