利用GWAS篩選影響野豬被毛表型變異的候選功能基因

吳永龍，郭 娟

（貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

利用GWAS篩選影響野豬被毛表型變異的候選功能基因

吳永龍，郭 娟

（貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

識別野生動物群體內(nèi)潛在影響動物表型變異的相關(guān)基因是進化遺傳學(xué)研究的主要目的，而動物毛色是研究動物被毛表型形成遺傳機制的最佳模型之一。應(yīng)用Illumina公司提供的豬60 k SNP基因芯片對選取的62只不同被毛表型的野豬個體進行基因分型，利用SNP分析結(jié)果，通過對照全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）識別影響野豬被毛表型差異的相關(guān)變異。結(jié)果表明，識別了6個與野豬被毛表型相關(guān)的基因組變異區(qū)域， 分別位于 SSC1 （ALGA0001794，ASGA0006416）、SSC2（ASGA0011559）、SSC6（H3GA0018683）、SSC7（ASGA0035535）和 SSC14（ASGA0060641）；最顯著相關(guān)的 SNP（ALGA0001794）位于豬1號染色體上（SSC1）的27 899 596～27 899 696 bp區(qū)間（P=2.96×10-5）。該研究初步鑒定了6個與野豬毛色性狀相關(guān)的易感位點，為進一步研究野豬不同毛色性狀的形成機制提供了基礎(chǔ)。

野豬；被毛表型；全基因組關(guān)聯(lián)分析；基因組變異；單核苷酸多態(tài)性

了解動物的基因型與表型之間的聯(lián)系，可以闡明動物群體內(nèi)表型變異形成的遺傳進化機制［1］。建立基因型與表型之間的聯(lián)系，可以揭示野生動物和家養(yǎng)動物的起源以及維持動物表型變異的機制，也有助于了解動物馴化的歷史［2］。動物毛色是研究動物被毛表型形成遺傳機制的最佳模型之一［1］。野豬是一種重要的野生動物種質(zhì)資源，其是家豬的祖先。野豬的毛色通常從深灰色到黑色或褐色變化，并且不同地區(qū)分布的野豬存在毛色差異。在大多數(shù)野豬群體內(nèi)，所有個體享有相同的被毛表型是重要的品種特征。因此，野豬群體內(nèi)毛色表型的多樣性以及維持表型多樣性的遺傳基礎(chǔ)是值得深入研究的科學(xué)問題。

大部分動物的毛色多樣性主要由2種基本黑色素的相對量決定，即真黑素（黑/棕）和棕黑素（黃/紅）［3］。在野生型擴展等位基因存在的情況下，通常需要條紋等位基因的表達。有研究表明，MC1R和ASIP基因的突變與豬的不同毛色表型有關(guān)［4-5］。Ren等［6］研究發(fā)現(xiàn)，TYRP1基因突變能夠影響豬的棕褐色被毛表型。Johansson等［7］研究表明，豬至少存在7個KIT基因的等位基因位點，這些位點共同影響豬的不同被毛表型效應(yīng)。

將 MC1R、TYRP1、ASIP和KIT等基因作為候選基因，可以用來揭示野豬群體內(nèi)相關(guān)基因的突變對其不同被毛表型變異的效應(yīng)。同時，深入研究這些基因的突變特征，對于探討野豬種群體中不同毛色表型個體的出現(xiàn)機制及其復(fù)雜表型的模式具有重要意義。這些毛色基因的突變已經(jīng)在一些馴化豬種中引起了毛色表型的變異，但不會影響其野生近緣種的形態(tài)多樣性。雖然大多數(shù)與毛色表型相關(guān)的突變基因很可能出現(xiàn)在具有祖先特征的野生種群中，但是人工選擇導(dǎo)致了它們的固定和頻率的增加，因此，人工選擇是家養(yǎng)動物大量表型變異形成的主要因素。研究表明，一些相似的毛色表型可以由不同的基因突變所引起?；谙嚓P(guān)的文獻報道可以推測，家豬和野豬的類似毛色表型可能存在不同的遺傳變異基礎(chǔ)。

圖1 野豬毛色表型

除了上述報道的突變頻率較高的基因外，其他的毛色表型相關(guān)基因也逐漸被發(fā)現(xiàn)和研究，特別是在野生動物群體中。研究表明，某些被新發(fā)現(xiàn)的毛色表型相關(guān)基因在不同的脊椎動物群體內(nèi)具有很高的保守性，并經(jīng)常影響動物適應(yīng)性毛色表型的形成［8］。 全基因組關(guān)聯(lián)方法（GWAS）已被成功地應(yīng)用于多個相關(guān)性狀的功能基因定位和因果基因的鑒別，例如，Karlsson等［9］應(yīng)用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響犬毛色變異的單基因性狀，包括白色和斑點毛色分布表型。該研究旨在通過利用GWAS技術(shù)篩選與野豬不同毛色表型形成相關(guān)的候選基因，為揭示野豬的被毛顏色表型的遺傳變異機制，闡明候選功能基因的相互作用分子機制提供理論基礎(chǔ)，同時也為野豬種質(zhì)資源的保護和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和表型記錄 共選取來自不同群體的62只野豬，其中黑色毛色5只、棕黃色毛色5只、褐紅色毛色3只、黑棕色毛色18只，深黑棕色毛色14只、銀棕色或銀色毛色10只、灰褐色毛色7只（見圖1）。野豬的個體被毛表型通過直接肉眼觀察鑒定和戶外拍攝照片確定。同時采集野豬的耳組織樣品，于-20℃儲存，用于基因組DNA的提取。

1.2 SNP分型和質(zhì)量控制 利用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚/氯仿提取法或使用DNA提取試劑盒 （天根生化科技有限公司）從耳組織樣品中提取DNA。樣品DNA質(zhì)量用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。所提取的DNA樣品均稀釋至100 ng/μL。樣品DNA的濃度和質(zhì)量達到Illumina公司的豬60k SNP基因芯片分析要求后，根據(jù)產(chǎn)品說明書進行野豬全基因組SNP基因型的判定。在進行統(tǒng)計分析之前，嚴(yán)格控制樣本的SNP檢出質(zhì)量，以確保試驗結(jié)果的可靠性。根據(jù)試驗要求，所有SNP質(zhì)量檢測成功率＜98%的基因分型個體在分析時被排除。此外，檢測的SNP次等位基因頻率 （MAF）＜3%、哈迪溫伯格平衡 P值＜0.00001或試驗個體有超過10%的基因型丟失，該類樣本個體也在分析時被排除。

1.3 種群分層評估 利用STRUCTURE 2.0軟件推測種群結(jié)構(gòu)和群體混雜度。使用多座位基因型來評估個體和群體，推算一個特定群體內(nèi)的所有個體的親本群體數(shù)（K）。對用于模擬數(shù)據(jù)得到的K的代表值，進行9次獨立的程序運行（2≤K≤10）。所估計的個體成員系數(shù)使用DISTRUCT軟件顯示，其代表了祖先亞群中的小部分基因組 （Q矩陣）。通過SPAGeDi軟件，應(yīng)用SNP基因型構(gòu)建一個標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)性矩陣（K矩陣），用以說明群體層化和樣本結(jié)構(gòu)（http∶//ebe.ulb.ac.be/ebe/SPAGeDi.html）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 充分考慮所構(gòu)建的群體結(jié)構(gòu)（Q矩陣）和親屬矩陣（K矩陣）所出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象。使用基因組控制方法（GC）調(diào)整群體層化現(xiàn)象。隨后，對關(guān)聯(lián)性分析所得的顯著性P值使用GC參數(shù)進行校正。用于糾正群體層化的GC方法一般在單個群內(nèi)使用。該試驗研究的野豬是單個群體，但是出現(xiàn)了顯著的亞群結(jié)構(gòu)，因此，再次實施EIGENSTRAT分析方法，校正2個主要遺傳變異的組成。

GWAS是在所有的SNP次等位基因頻率＞0.05和檢測率＜95%的基礎(chǔ)上進行。應(yīng)用一般線性模型或線性混合模型進行GWAS分析。全基因組顯著性經(jīng)過了10萬次的表型和基因型間的運算。最顯著性關(guān)聯(lián)分析結(jié)果使用似然比檢驗進行評價，顯著性P值的閾值＜10-6，使用Bonferroni校正多重檢驗［（0.05/42174）=1.19×10-6］。 獲得的預(yù)期全基因組 P值的分布用分位數(shù)圖（QQ圖）表示。用R軟件中自主編寫的QQ圖對群體分層效應(yīng)進行評估。若觀測曲線趨于預(yù)期置信度，說明群體分層效應(yīng)得到了很好的控制；若觀測曲線線尾顯著高于預(yù)期曲線度，則表明該SNP位點可能是影響野豬被毛表型變異相關(guān)的易感位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP數(shù)據(jù) 該研究使用的豬60k SNP基因芯片含有62 163個SNP，利用該基因芯片對62頭野豬的DNA進行基因分型。按照SNP質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，共獲得了42 174個有效的SNP用于后續(xù)分析。所有SNP基于當(dāng)前豬基因組10.2版本注釋的基因組位置（http∶//www.sanger.ac.uk/Projects/S_scrofa/）。

2.2 群體層化分析 在最初分析沒有進行任何參數(shù)校正的情況下，存在系統(tǒng)偏差的事實。通過QQ校正后（見圖2），對42 174個SNP進行全基因組關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，在QQ圖尾部有6個位點顯著偏離零假設(shè)分布，提示存在影響野豬被毛表型相關(guān)的易感基因位點。經(jīng)GC法調(diào)整后也獲得了類似的結(jié)果。

圖2 QQ圖

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS） 野豬的被毛表型顯示極端差異變化，從暗灰色至黑色或褐色。為了識別與野豬毛色表型性狀相關(guān)的基因位點，利用Illumina公司的豬60k SNP基因芯片分型結(jié)果，進行了GWAS分析。結(jié)果表明，通過Bonferroni校正后，沒有發(fā)現(xiàn)基因組水平顯著相關(guān)的位點，但存在一些潛在相關(guān)的位點，例如位于SSC1（ALGA0001794，ASGA0006416）、SSC2（ASGA0011559）、SSC6（H3GA0018683）、SSC7（ASGA0035535）和SSC14（ASGA0060641）的相關(guān)突變，最顯著相關(guān)的SNP（ALGA0001794）位于 1 號染色體（SSC1）的27 899 596～27 899 696 bp 區(qū)間（P=2.96×10-5）（見表1、圖3）。

3 討論

野豬的馴化以及隨后的人工選擇是造成野豬和家豬的表型性狀之間存在極端差異的主要原因，尤其是二者被毛表型性狀之間的差異。遺傳學(xué)研究表明，動物的毛色性狀變異伴隨著整個動物馴化的歷程。從動物的馴化到當(dāng)前的育種規(guī)劃，人類不僅塑造了動物表型的多樣性，更重要的是改變了動物基因組的變異。動物的某種特殊表型性狀的出現(xiàn)，是由于某些特定的基因變異已經(jīng)在該種動物群體內(nèi)固定了下來。

表1 GWAS篩選的影響野豬被毛表型相關(guān)的易感基因位點

圖3 GWAS掃描野豬的被毛顏色模式

為了解野豬群體內(nèi)潛在影響被毛表型變異的基因組突變區(qū)域，該研究利用Illumina公司提供的豬60k SNP基因芯片分型結(jié)果，進行了GWAS分析。利用該種方法共發(fā)現(xiàn)了6個顯著的相關(guān)位點，分 別 位 于 SSC1 （ALGA0001794，ASGA0006416）、SSC2（ASGA0011559）、SSC6（H3GA0018683）、SSC7（ASGA0035535）和 SSC14（ASGA0060641），最顯著相關(guān)的SNP（ALGA0001794）位于1號染色體（SSC1） 的 27 899 596～27 899 696 bp 區(qū)間 （P=2.96×10-5）。該研究結(jié)果為進一步闡明豬毛色基因的功能及揭示豬毛色的遺傳機理提供了科學(xué)依據(jù)，也為研究其他種屬動物的毛色調(diào)控機理提供了理論基礎(chǔ)。

［1］HUBBARD J K，UY J A，HAUBER M E，et al.Vertebrate pigmentation：from underlying genes to adaptive function［J］.Trends Genet，2010，26（5）：231-239.

［2］FANG M Y，LARSON G，RIBEIRO H SOARES，et al.Contrasting mode of evolution at a coat color locus in wild and domestic pigs［J］.PLoS Genet，2009，5（1）：e1000341.

［3］SEARLE A G.Comparative Genetics of Coat Colour in Mammals［M］.Logos Press：London，1968.

［4］KIJAS J M，WALES R，T?RNSTEN A.et al.Melanocortin receptor 1 （MC1R）mutations and coat color in pigs［J］.Genetics，1998，150（3）：1177-1185.

［5］KIJAS J M，MOLLER M，PLASTOW G，et al.A frameshift mutation in MC1R and a high frequency of somatic reversions cause black spotting in pigs［J］.Genetics，2001，158（2）：779-785.

［6］REN J，MAO H，ZHANG Z，et al.A 6-bp deletion in the TYRP1 gene cause the brown colouration phenotype in Chinese indigenous pigs［J］.Heredity，2011，106（5）：862-868.

［7］JOHANSSON A，PIELBERG G，ANDERSSON L，et al.Polymorphism at the porcine Dominant white/KIT locus influence coat colour and peripheral blood cell measures［J］.Anim Genet，2005，36（4）：288-296.

［8］CIESLAKM，REISSMANN M，HOFREITER M，etal.Colours of domestication ［J］.Biol Rev Camb Philos Soc，2011，86（4）：885-899.

［9］KARLSSON E K，BARANOWSKA I，WADE C M，et al.Efficient mapping of mendelian traits in dogs through genome-wide association［J］.Nat Genet，2007，39 （11）：1321-1328.

Screen of Functional Candidate Genes Associated with Variation of Coat Traits of Wild Boars by Genome-wide Association Study（GWAS）

WU Yong-long，GUO Juan
（College of Life Sciences，Guizhou Normal University，Guiyang 550025，China）

To identify the genes that potentially influencing the phenotypic characteristics variation of wild animals was the main objective of evolutionary genetics related research.Coat color was one of the optimum models that were commonly used in investigation of genetic mechanism associated with formation of animal coat traits.In this study,genetic typing test of 62 wild boars with varied coat traits was conducted by using Illumina pig 60 k SNP chips.Based on the SNP typing results,the genes associated with the variation of wild boars coat traits were identified by genome-wide association study （GWAS）.We found 6 genome variation areas associated with wild boars coat traits,locating in SSC1 （ALGA0001794，ASGA0006416）,SSC2（ASGA0011559）,SSC6 （H3GA0018683）,SSC7 （ASGA0035535）and SSC14 （ASGA0060641）,respectively.The most significantly correlated SNP was found in SSC1 and located in the region of 27 899 596-27 899 696 bp （P=2.96×10-5）.Six susceptibility gene loci associated with coat color traits of wild boars were preliminarily identified,which provides a basis for the genetic mechanism associated with formation of varied coat color traits of wild boars.

wild boar；coat traits；GWAS；genome variation；SNP

S828.2；S818.9

A文章順序編號：1672-5190（2016）04-0014-04

2016-03-05

吳永龍（1992—），男，所學(xué)專業(yè)為園藝。

郭娟（1979—），女，副教授，博士，主要研究方向為種質(zhì)資源調(diào)查與遺傳育種。

（責(zé)任編輯：趙俊利）