短葶山麥冬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的初步研究△

萬學(xué)鋒，賴鐘雄，陳菁瑛

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物資源研究所 藥用植物研究中心，福建 福州 350003；2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；3.福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363005)

短葶山麥冬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的初步研究△

萬學(xué)鋒1，2，3，賴鐘雄2，陳菁瑛1*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物資源研究所 藥用植物研究中心，福建 福州 350003；2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；3.福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363005)

短葶山麥冬莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織為松散型顆粒狀，接種量為0.45 g達(dá)到最大增長量的時間短，四種碳源(蔗糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇)對短葶山麥冬懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響差別不是很大，其中蔗糖的增殖率最高，達(dá)到252%，從成本上考慮，在以后的培養(yǎng)過程適合添加蔗糖作為碳源。短葶山麥冬懸浮細(xì)胞系的生長動態(tài)大致呈“S”形。短葶山麥冬懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)選擇的時間為10 d。

短葶山麥冬；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)；增殖

短葶山麥冬Liriopemuscari(Desne.) Bailey為百合科山麥冬屬植物，是《中華人民共和國藥典》1995年版新增品種山麥冬的原植物之一，其干燥塊根有養(yǎng)陰生津，潤肺清心功效[1]，有效成分麥冬多糖對增強免疫功能、保護(hù)腦缺血損傷、降血糖等具有重要的作用[2]。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(cell suspension culture)即單細(xì)胞群體或小的細(xì)胞聚集體在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，它是從愈傷組織的液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)[3]。培養(yǎng)物可以接種在培養(yǎng)瓶中在搖床上培養(yǎng)，也可以在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。這些細(xì)胞和小的聚集體來自愈傷組織、某個器官或組織，甚至幼嫩的植株，通過物理或化學(xué)的方法進(jìn)行分離而獲得[4-5]。對具有藥用價值的短葶山麥冬而言，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的研究對實現(xiàn)其藥用成分麥冬多糖的工廠化生產(chǎn)具有重要意義，因此，本試驗以短葶山麥冬莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織[6]為起始材料，研究了短葶山麥冬懸浮培養(yǎng)體系建立與保持的關(guān)鍵因素，希望建立懸浮培養(yǎng)體系，以期為短葶山麥冬遺傳轉(zhuǎn)化合細(xì)胞突變體帥選提供優(yōu)良的試驗體系。

1 材料與方法

1.1 材料

以短葶山麥冬莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織離體保持系為起始材料(圖2A)

1.2 方法

1.2.1 懸浮培養(yǎng)體系的建立 挑選經(jīng)過21 d愈傷組織培養(yǎng)，生長勢好，穩(wěn)定性相對一致的愈傷組織置于20 mL MS+0.5 mg·L-12，4-D中，附加蔗糖20 g·L-1的液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、110 r·min-1的條件下培養(yǎng)，并進(jìn)行觀察。

1.2.2 接種量對懸浮培養(yǎng)的影響 選取已建立的細(xì)胞分散、生長旺盛的懸浮培養(yǎng)系，在MS+0.5 mg·L-12，4-D培養(yǎng)基中，比較不同接種量對懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響。

1.2.3 碳源對懸浮培養(yǎng)體系的影響 選取已建立的細(xì)胞分散、生長旺盛的懸浮培養(yǎng)系，添加四種不同碳源(蔗糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇)的MS+0.5 mg·L-12，4-D培養(yǎng)基中，比較不同碳源對懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響。

1.2.4 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系的生長 選取生長穩(wěn)定，來源相同的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系，加入相同的液體培養(yǎng)基，每次移入材料采用5mL移液槍移入，比較不同碳源和接種量對短葶山麥冬懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系的影響；在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，懸浮培養(yǎng)物的鮮重為縱坐標(biāo)，繪制懸浮細(xì)胞生長曲線。

1.3 培養(yǎng)條件

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞于50 mL三角瓶中，置于普通搖床中，轉(zhuǎn)速12 h·d-1。試驗每處理重復(fù)三次，采用DPS v9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對懸浮細(xì)胞系生長的影響

短葶山麥冬莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織為松散型顆粒狀，在轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基后很快分散，其中有的顆粒較大，不利于直接作為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最終材料。因此，在初步培養(yǎng)的過程中，需要通過懸浮培養(yǎng)來選擇剔除顆粒較大的細(xì)胞，經(jīng)振蕩后選擇懸浮物上部細(xì)小的細(xì)胞繼代培養(yǎng)，21～28 d后可建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)物。經(jīng)過繼代培養(yǎng)后細(xì)胞能夠滿足懸浮培養(yǎng)的需要。

在MS+0.5 mg·L-12，4-D液體培養(yǎng)基15 mL上，每5 mL移液管里含有懸浮細(xì)胞約0.15 g，比較了不同接種量對短葶山麥冬懸浮細(xì)胞系生長的影響，見表1。

由表1可以看出，4個不同接種量對懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生長表現(xiàn)為明顯的區(qū)別。接種量為0.15 g時，培養(yǎng)基的材料過少，增殖達(dá)到最大增長量時所需要的時間過長，這樣就勢必會給材料帶來培養(yǎng)細(xì)胞生活力下降；當(dāng)接種量達(dá)到0.60 g時，所達(dá)到最大增長量時所需時間減少，但是培養(yǎng)基的營養(yǎng)元素不能滿足繼續(xù)增長的需求，限制了材料繼續(xù)增殖，容易形成大細(xì)胞團(tuán)，造成材料出現(xiàn)污染；當(dāng)接種量在0.30 g和0.45 g時，能夠滿足液體培養(yǎng)基生長的需求，所增殖的細(xì)胞也具有良好的生長勢，由于接種量為0.45 g所達(dá)到最大增長量的時間短，故選擇0.45 g來進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

表1 不同接種量對短葶山麥冬懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系生長的影響

注：達(dá)到最大密度時間以培養(yǎng)物鮮重不再增加時為準(zhǔn)，生長量指達(dá)到最大密度時每個處理培養(yǎng)物的鮮重

2.2 不同碳源對短葶山麥冬懸浮培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的影響

將不同碳源添加到懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計鮮重，比較不同的增殖率。結(jié)果見表2。

表2 不同碳源對短葶山麥冬懸浮培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的影響

從表2中可出四種碳源對短葶山麥冬懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響差別不是很大，其中蔗糖的增殖率最高，達(dá)到252%，高于其他三種碳源；添加甘露醇的增殖率最低，為202%。最高與最低的區(qū)別不算太大。從成本上考慮，在以后的培養(yǎng)過程適合添加蔗糖作為碳源，因為蔗糖的成本價最低。

2.3 短葶山麥冬懸浮細(xì)胞系生長曲線繪制

選取生長穩(wěn)定、來源相同的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞分為20瓶并進(jìn)行編號，每隔2 d，共10個不同培養(yǎng)時期進(jìn)行觀察統(tǒng)計。每個時期共有鮮重0.9 g，分別加入MS+0.5 mg·L-12，4-D液體培養(yǎng)基15 mL進(jìn)行培養(yǎng)，從第3 d開始依次40目不銹鋼網(wǎng)濾去水分直接稱鮮重，繪制懸浮細(xì)胞系的生長，見圖1所示。

圖1 短葶山麥冬懸浮細(xì)胞系的生長曲線

圖1表明，短葶山麥冬懸浮細(xì)胞系的生長動態(tài)大致呈“S”形曲線。在2～6 d時生長緩慢，為延滯期，該時期細(xì)胞數(shù)目基本不增加(圖2B)；在6～14 d時，細(xì)胞生長迅速，其為對數(shù)期(圖2C、D)；14～20 d時，細(xì)胞數(shù)目有所增加，但隨著培養(yǎng)液的消耗，生長速度減慢，細(xì)胞生長受到抑制。因此短葶山麥冬懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)選擇的時間為10 d(圖2E)。

A.愈傷組織；B.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)前期；C-D.中期；E.后期；F.懸浮培養(yǎng)過程中細(xì)胞污染死亡圖2 短葶山麥冬懸浮培養(yǎng)體系

3 討論

3.1 短葶山麥冬懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立和保持

對于懸浮培養(yǎng)物的建立，起始材料的選擇對試驗的繼續(xù)深入有著很關(guān)鍵的作用[7-8]，短葶山麥冬松散的愈傷組織是建立優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的理想的起始材料。經(jīng)懸浮培養(yǎng)數(shù)代后，即可建立優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，從而提高生長勢。

在培養(yǎng)過程中，愈傷組織經(jīng)多代(>8代)連續(xù)培養(yǎng)后，則出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，生長勢能力下降。因此有待于探索出能夠獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的培養(yǎng)機制。

3.2 接種量對生長的影響

當(dāng)初步探索短葶山麥冬懸浮培養(yǎng)接種量大小時，選取了三個不同的生長量。生物產(chǎn)量隨著接種量的增加而增大，但是隨著接種量倍數(shù)的增加，生物產(chǎn)量的生長速率卻反而下降。一般而言，加大接種量可提高生物產(chǎn)量，但是，由于一定量的培養(yǎng)液只能提供有限的營養(yǎng)成分，所以試驗中隨著接種量的增大，凈增生物量卻不一定增加。在懸浮培養(yǎng)過程中，要避免因為小細(xì)胞團(tuán)形成大細(xì)胞團(tuán)，這樣會增加污染的概率。

3.3 懸浮培養(yǎng)的利用

懸浮培養(yǎng)可以時培養(yǎng)物均勻、充分的接觸培養(yǎng)基，供給充足的養(yǎng)分，而且可以保持良好的通氣狀況，從而使培養(yǎng)物得到最大限度的生長。此外，液體懸浮培養(yǎng)具有接種量大、生長速率快、勞動強度小的特點，有利于組織細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)?；凸S化。液體振蕩培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、原生質(zhì)體、愈傷組織的培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。短葶山麥冬懸浮培養(yǎng)在其他山麥冬離體培養(yǎng)中沒有涉及到，本研究是短葶山麥冬第一次的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，短葶山麥冬塊根具有藥用價值，在進(jìn)一步的研究中可以探討，在懸浮培養(yǎng)環(huán)境條件下，探索次生代謝產(chǎn)物與懸浮培養(yǎng)的關(guān)系。

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APreliminaryStudyofCellSuspensionsinLiriopemuscari(Desne.)Bailey

Wan Xuefeng1，2，3，LaiZhongxiong2，ChenJingying1*

(1.AgriculturalBio-resourcesInstitute，MedicinalPlantResearchCenterofFujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou350003，China；2.InstituteofHorticulturalBiotechnology，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，China；3.ZhangzhouinstituteofAgriculturalsciences，Zhangzhou363005，China)

The callus from stem was incompact，the inoculation amount of callus was 0.45 g.The difference among the four carbon sources (sucrose，glucose，mannitol and sorbitol) for suspension cell culture was not significant，sugar was the optimal carbon sources，and the highest growth rate was 252%，and sugar was the cheapest.The line of growth on suspension cells was approximately S-shaped.Suspension cultured cell needed 10 days to achieve the optimization.

Liriopemuscari(Desne.) Bailey；cell suspension culture；miacropropagation

2015-11-18)

福建省農(nóng)科院藥用植物科技創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目(STIT-2-0351)

*

陳菁瑛，研究員，研究方向：藥用植物資源與植物生物技術(shù)；E-mail：cjy6601@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.017