不同方法處理的異種骨材料的生物力學(xué)比較

馮　衛(wèi)，李冬松，臧俊亭，付　莉

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

?

不同方法處理的異種骨材料的生物力學(xué)比較

馮衛(wèi)1，李冬松1，臧俊亭1，付莉2*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

目的比較不同處理方法對異種骨材料生物力學(xué)的影響。方法新鮮豬肋骨制成1.5 cm×0.5 cm×0.4 cm大小，隨機(jī)分成4組，A組為H2O2處理部分脫蛋白組，B組為深低溫冷凍組，C組為深低溫冷凍酶消化組，D組為新鮮異種骨移植，作為對照組。各組分別進(jìn)行軸向壓縮和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。結(jié)果在軸向壓縮試驗(yàn)中，D組最大，其次為C組、B組，A組最大載荷最小，明顯小于其他各組(P<0.05)，最大應(yīng)力和彈性模量D組、C組和B組沒有明顯差別(P>0.05)，而A組最大應(yīng)力和彈性模量明顯低于其他各組(P<0.05)。在三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)中，最大載荷和彈性模量B組、C組和D組沒有明顯差別，A組最大載荷和彈性模量明顯低于其他各組(P<0.05)。結(jié)論部分脫蛋白組對異種骨的生物力學(xué)影響最大，而深低溫冷凍和酶消化法對異種骨的生物力學(xué)影響較小，是保存異種骨生物力學(xué)的良好的方法。

異種；移植；骨；生物力學(xué)

(ChinJLabDiagn,2016,20:1442)

骨移植是目前臨床常見的組織移植[1]，尤其在創(chuàng)傷骨科和關(guān)節(jié)翻修等領(lǐng)域應(yīng)用更加廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年約有200萬例病人接受骨移植手術(shù)用于修復(fù)骨缺損[2]。盡管自體骨具有最佳的骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)和成骨能力[4]，但自體骨移植骨量少，需要增加新的手術(shù)切口，感染風(fēng)險(xiǎn)增加。同種異體骨移植同樣也面臨著來源短缺，存在病毒傳播和免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[5]。異種骨移植是目前有望替代自體骨移植和同種異體骨移植的有效方法之一。本研究通過不同方法處理內(nèi)江豬骨，并觀察處理后的骨材料的力學(xué)性能變化，比較不同處理方法對異種骨生物力學(xué)性能的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料的制備

近交系雄性豬，50 kg，無菌條件下取新鮮肋骨，剔除骨膜和周圍軟組織，取肋骨中段，保留一側(cè)骨皮質(zhì)，制成1.5 cm×0.5 cm×0.4 cm大小的骨材料。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及異種骨處理

根據(jù)異種骨的不同處理方法，將上述實(shí)驗(yàn)材料分為4組：

A組(H2O2處理部分脫蛋白組)：沖洗去除骨髓和血細(xì)胞，95%乙醚浸泡24小時(shí)脫脂，沖洗12小時(shí)，0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.2，含NaN310 mmol/L)37℃孵育72小時(shí)，37℃，20% H2O2處理48小時(shí)，每12小時(shí)換液1次，-20℃冷凍保存。

B組(深低溫冷凍組)：沖洗去除骨髓和血細(xì)胞，95%乙醚浸泡脫脂24小時(shí)，沖洗后液氮冷凍4月，-80℃深低溫繼續(xù)冷凍1月。

C組(深低溫冷凍酶消化組)：沖洗去除骨髓和血細(xì)胞，95%乙醚脫脂24小時(shí)，沖洗，液氮冷凍處理4月，-80℃深低溫保存1月。梯度緩慢復(fù)溫，37℃水浴條件下，0.25%胰蛋白酶和100 U/ml的α-Gal糖苷酶分別消化48小時(shí)和72小時(shí)。

D組(對照組)：沖洗骨髓腔，新鮮異種骨材料作為對照，-20℃冰箱保存。

1.3材料的力學(xué)檢測

各組骨材料分別進(jìn)行生物力學(xué)檢測，檢測內(nèi)容包括軸向壓縮試驗(yàn)和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，上述試驗(yàn)均在INSTRON 8874生物力學(xué)測試系統(tǒng)下完成。壓縮試驗(yàn)和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)的加載速度分別為0.5 mm/min和5 mm/min。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，各組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組骨材料軸向壓縮測試結(jié)果

最大載荷各組比較，D組最大，其次為C組、B組，A組最大載荷最小，明顯小于其他各組(P<0.05)，而最大載荷B、C、D組間無明顯差別(P>0.05)。最大位移各組比較，A組、B組和C組間無明顯差別(P>0.05)，D組明顯高于其他各組(P<0.05)。在最大應(yīng)力和彈性模量方面各組比較，A組明顯小于其他各組(P<0.05)，而B組、C組和D組間無明顯差別(P>0.05)，見表1。

表1　各組材料壓縮生物力學(xué)比較±s)

2.2各組骨材料三點(diǎn)彎曲測試結(jié)果

最大載荷和彈性模量方面，B組、C組和D組間無明顯差別(P>0.05)，A組明顯小于其他各組(P<0.05)。最大應(yīng)力方面，D組應(yīng)力最大，其次依次為C組、B組和A組，各組間差別明顯(P<0.05)，D組最大應(yīng)力明顯高于其他各組(P<0.05)。最大位移方面，B組和C組無明顯差別(P>0.05)，而與其他各組間比較差別明顯(P<0.05)，見表2。

表2　各組材料三點(diǎn)彎曲生物力學(xué)比較±s)

3　討論

為了解決自體骨移植和同種異體骨移植來源短缺的問題，異種骨移植被認(rèn)為是目前最為有效的方法之一，而豬作為異種移植理想的供體已經(jīng)得到廣泛的關(guān)注[4]。異種骨移植同樣需要克服免疫排斥反應(yīng)，而在不同的異種骨處理過程中會降低異種骨的傳導(dǎo)性能[1]。

骨的基本組成是羥基磷灰石和Ⅰ型膠原，Ⅰ型膠原占骨的有機(jī)成分90%，羥基磷灰石的含量決定了骨的硬度和強(qiáng)度，而膠原的含量決定了骨的韌性[6,7]。目前去除異種骨抗原的處理方法主要包括脫脂去蛋白、物理深低溫冷凍、酶消化等方法。

H2O2作為化學(xué)氧化劑直接影響骨的結(jié)構(gòu)蛋白，可以有效降低異種骨的免疫排斥反應(yīng)，但異種骨的生物力學(xué)強(qiáng)度也隨之下降[8]。本試驗(yàn)中，采用20%H2O2處理的異種骨材料軸向壓縮中最大載荷最小，僅為對照組新鮮異種骨的21.92%，同時(shí)在軸向壓縮試驗(yàn)中的最大應(yīng)力和最大應(yīng)變也最小。同樣在三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)中，經(jīng)H2O2處理的異種骨材料最大應(yīng)力和最大應(yīng)變也最小，與其他各組比較差別明顯(P<0.05)。文獻(xiàn)報(bào)道骨的力學(xué)強(qiáng)度與H2O2處理的時(shí)間呈反比[9]，本研究結(jié)果也表明采用20%H2O2處理過的異種骨材料生物力學(xué)性能顯著下降。

有研究認(rèn)為深低溫冷凍會增加骨的脆性[10]，但Kang[11]研究認(rèn)為反復(fù)凍融對骨的生物力學(xué)性能影響不大，經(jīng)深低溫冷凍處理的異種骨材料力學(xué)性能無明顯改變[12]。本研究中經(jīng)深低溫冷凍處理的異種骨材料，其彈性模量、最大位移、最大載荷等接近新鮮對照組，結(jié)果顯示深低溫冷凍對異種骨的生物力學(xué)無明顯影響。

與H2O2強(qiáng)氧化劑不同，酶水解過程溫和，可以去除異種骨表面抗原，且對骨的生物力學(xué)影響較小[13]。本研究中在深低溫冷凍降低異種移植免疫排斥反應(yīng)的基礎(chǔ)上，希望采用作用溫和的胰蛋白酶和α-Gal糖苷酶進(jìn)一步去除異種骨移植抗原，降低異種骨移植免疫排斥反應(yīng)，結(jié)果表明經(jīng)上述處理后的異種骨材料的生物力學(xué)性能接近于新鮮對照組，明顯優(yōu)于經(jīng)H2O2處理的脫脂部分脫蛋白方法。

綜上所述，在軸向壓縮和三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)中，脫脂部分脫蛋白法對異種骨的生物力學(xué)影響最大，而深低溫冷凍和酶消化法對異種骨的生物力學(xué)影響較小，是未來保存異種骨生物力學(xué)的一種有效方法。

[1]VanHeestA,SwiontkowskiM.Bone-graftsubstitutes[J].Lancet,1999,353(Suppl1):SI28.

[2]GiannoudisPV,DinopoulosH,TsiridisE.Bonesubstitutes:anupdate[J].Injury,2005,36 (Suppl3):S20.

[3]CostantinoPD,FriedmanCD.Syntheticbonegraftsubstitutes[J].OtolaryngolClinNorthAm,1994,27(5):1037.

[4]CypherTJ,GrossmanJP.Biologicalprinciplesofbonegrafthealing[J].JFootAnkleSurg,1996,35(5):413.

[5]PatelR,TrampuzA.Infectionstransmittedthroughmusculoskeletal-tissueallografts[J].NEnglJMed,2004,350(25):2544.

[6]SeemanE,DelmasPD.Bonequalitythematerialandstructuralbasisofbonestrengthandfragility[J].NEnglJMed,2006,354(21):2250.

[7]NiyibiziC,EyreDR.Structuralcharacteristicsofcross-linkingsitesintypeVcollagenofbone.ChainspecificitiesandheterotypiclinkstotypeIcollagen[J].EurJBiochem,1994,224(3):943.

[8]DePaulaCA,TruncaleKG,GertzmanAA.Effectsofhydrogenperoxidecleaningproceduresonbonegraftosteoinductivityandmechanicalproperties[J].CellTissueBank,2005,6(4):287.

[9]羅卓荊,胡蘊(yùn)玉,王茜，等.30%H2O2浸漬對牛松質(zhì)骨力學(xué)特性的影響[J].中華骨科雜志,1997,17 (11):714.

[10]張朝春，張發(fā)惠，鄭和平 等.超深低溫冷凍對大鼠骨力學(xué)性能影響的生物力學(xué)研究[J].中國臨床解剖學(xué)雜志,2004,22(3):315.

[11]KangQ,AnYH,FriedmanRJ.Effectsofmultiplefreezing-thawingcyclesonultimateindentationloadandstiffnessofbovinecancellousbone[J].AmJVetRes,1997,58(10):1171.

[12]MatterHP,GarrelTV,BilderbeekU,etal.Biomechanicalexaminationsofcancellousboneconcerningtheinfluenceofdurationandtemperatureofcryopreservation[J].JBiomedMaterRes,2001,55(1):40.

[13]ActisAB，ObwegeserJA，BertolottoP.Effectsofenzymatictreatmentsonthebiomechanicalpropertiesofscrewsmadeofbone[J].JBiomaterAppl,2003,17(3):207.

Biomechanical Comparison of Xenogeneic Bone Material Treated with Different Methods

FENGWei,LIDong-song,ZANGJun-ting,etal.

(TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveThe aim of this study was to compare the influence of different treatment methods on the biomechanical characteristics of porcine bones.MethodsFresh ribs of pig were cut into 1.5 cm×0.5 cm×0.4 cm specimens,which were randomly divided into four groups:group A by degreasing and partial deproteinization,group B by cryopreservation,group C by cryopreservation and enzyme digestion and group D was a control group using fresh bone.Axial compression and three point bending tests were performed for all groups.ResultsIn axial compression test,values for maximum load were:group D>group C>group B>group A.The maximum load of group A was significantly lower than that of the other groups (P<0.05).There was no difference among group D,group C and group B for the maximum stress and elastic modulus(P>0.05),The maximum stress and elastic modulus of group A were significantly lower than those in the other groups(P<0.05).In three point bending test,the maximum load and elastic modulus of group B,group C and group D were not significantly different (P>0.05).Maximum load and elastic modulus of group A was significantly lower than that of the other groups(P<0.05).ConclusionThe results indicated that xenogeneic bone treated with degreasing and partial deproteinization had the worst biomechanical properties.Cryopreservation and cryopreservation with enzyme digestion had little effects on the biomechanical properties,that means cryopreservation with or without enzyme digestion maybe a useful method to preserve the biomechanical properties of bone xenograft.

xenogeneic;transplantation;bone;biomechanics

吉林省科技廳課題(20160101131JC)；吉林省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會課題(2015Z031)

1007-4287(2016)09-1442-03

R687.3+4

A

馮衛(wèi)(1973-)，醫(yī)學(xué)博士，副教授，吉林大學(xué)第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，主要研究方向?yàn)楣巧锊牧霞瓣P(guān)節(jié)外科。

2015-07-22)