Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠復(fù)合材料對兔半月板損傷修復(fù)作用的實驗研究

吳鵬飛，谷文光，戴志唐*

(1.淮安市第一人民醫(yī)院 骨科，江蘇 淮安223300；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院 外科，黑龍江 哈爾濱150001)

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Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠復(fù)合材料對兔半月板損傷修復(fù)作用的實驗研究

吳鵬飛1，谷文光2，戴志唐1*

(1.淮安市第一人民醫(yī)院 骨科，江蘇 淮安223300；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院 外科，黑龍江 哈爾濱150001)

目的探討Ⅰ型膠原-轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transform growth factor，TGF-β1)-纖維蛋白膠復(fù)合材料修復(fù)兔半月板無血運區(qū)損傷的臨床效果。方法選取健康新西蘭大白兔60只，在半月板損傷造模的基礎(chǔ)上隨機分為損傷對照組(A組)、TGF-β1組(B組)、Ⅰ型膠原-纖維蛋白膠組(C組)和Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠組(D組)。A組不做處理， C組與D組于關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別一次性注入Ⅰ型膠原-生物蛋白膠復(fù)合物、Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠復(fù)合材料至填充物與半月板表面相平為止；B組于關(guān)節(jié)腔內(nèi)連續(xù)注射3周TGF-β1。術(shù)后2周、4周、12周分批處死動物，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和組織學(xué)檢查。結(jié)果形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，損傷后各組新西蘭大白兔的半月板組織形態(tài)變小，顏色微黃，質(zhì)地較硬，脆性增加。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，B組對半月板無血運區(qū)損傷的愈合無明顯影響，僅對半月板邊緣滑膜中的成纖維細(xì)胞有明顯的促進(jìn)作用；C組半月板傷口較術(shù)前小，表面稍凹陷，愈合組織與鄰近半月板組織結(jié)合緊密；D組半月板表現(xiàn)為纖維軟骨樣愈合，但愈合部分與正常半月板仍有差異。A組、B組、C組，在4周、12周時與D組愈合情況比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論采用Ⅰ型膠原-TGF-β1-生物蛋白膠復(fù)合材料對半月板無血運區(qū)損傷治療是非縫合技術(shù)治療半月板損傷的一種可靠手段。

半月板；Ⅰ型膠原；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；纖維蛋白膠

(ChinJLabDiagn,2016,20:1436)

膝關(guān)節(jié)半月板損傷是一種常見的運動損傷，因半月板的血供特點而使半月板損傷成為臨床治療修復(fù)的難題。近年來，臨床上對與半月板的修復(fù)方法研究取得了飛躍式的進(jìn)展，出現(xiàn)了一系列革命式的修復(fù)半月板技術(shù)和生物材料，但卻被半月板縫合嚴(yán)格苛刻的手術(shù)適應(yīng)癥所禁錮[3-6]。半月板損傷縫合治療對發(fā)生在半月板外1/3血供區(qū)損傷的治療效果滿意，但對半月板紅白區(qū)或白區(qū)的損傷即使勉強能夠縫合，卻因血供影響而致愈合能力差。目前，生長因子和組織工程學(xué)研究給半月板修復(fù)和移植帶來新的希望，使半月板損傷后修復(fù)和移植成為可能。本實驗通過驗證一種細(xì)胞因子-轉(zhuǎn)化生子因子-β1(TGF-β1)與半月板愈合過程中的關(guān)聯(lián)性，探討TGF-β1復(fù)合材料對兔半月板損傷的修復(fù)作用。

1　材料和方法

1.1材料

實驗動物：新西蘭大白兔60只；雌雄不限，體重 2.0-2.5 kg，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗室提供。實驗材料：TGF-β1(sigma公司)；Ⅰ型膠原(sigma 公司)；生物蛋白膠(北京正清然有限公司)。

1.2方法

1.2.1Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠的制備Ⅰ型膠原粉劑稱重，由生物蛋白膠溶解配成3 mg/L纖維蛋白膠-Ⅰ型膠原復(fù)合物；將5 ng TGF-β1離心，用檸檬酸稀釋，再加凍存液分別配成25 mg/L的TGF-β1，用時用移液槍頭取出，并與纖維蛋白膠-Ⅰ型膠原復(fù)合物混勻即可使用。所有配置的混合物都是即用即配。

1.2.2動物實驗選取健康新西蘭大白兔60只，隨機分為損傷對照組(A組)、TGF-β1組(B組)、Ⅰ型膠原-纖維蛋白膠組(C組)和Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠組(D組)。用2%戊巴比妥鈉(2 mg/kg)靜脈全麻，取雙膝髕韌帶內(nèi)側(cè)弧形切口，沿髕骨內(nèi)上緣至脛骨結(jié)節(jié)處切開皮膚，用自制的半月板拉鉤顯露內(nèi)側(cè)半月板前角、體部及股骨髁軟骨面；用鐮狀刀片于內(nèi)側(cè)半月板前角和體部中央略靠近半月板的邊緣做一個長0.5 cm、寬0.2 cm的全層裂傷。然后將Ⅰ型膠原-生物蛋白膠復(fù)合物、Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠復(fù)合材料一次性注入裂口，至填充物與半月板表面相平為止；TGF-β1組于關(guān)節(jié)腔內(nèi)連續(xù)注射3周TGF-β1；A組不做任何處理。術(shù)后給予抗生素頭孢唑林鈉0.5 g肌肉注射，并于術(shù)后第一日仍給予肌注抗生素，并添加蔬菜等副食增強抵抗力。分別于術(shù)后2周、4周、12周處死動物，每組每個時間點5只10個半月板，行大體及形態(tài)學(xué)觀察和病理切片。

1.3觀察指標(biāo)

將半月板標(biāo)本進(jìn)行大體形態(tài)觀察后，再置入體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液中固定1-3 d，然后進(jìn)行脫水、石蠟包埋，標(biāo)本采用蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡檢查。

2　結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察

除1只外，其他新西蘭大白兔手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)均無切口感染和關(guān)節(jié)積液，無半月板與關(guān)節(jié)面軟骨粘連；僅C組有1例半月板術(shù)后出現(xiàn)關(guān)節(jié)粘連內(nèi)外側(cè)半月板消失，關(guān)節(jié)強直，股骨髁面、脛骨面關(guān)節(jié)面粗糙，成顆粒狀，軟骨破壞。A組、B組半月板裂口均未愈合、未見組織填充；C組半月板部分組織充填；D組全部半月板傷口均已被組織填充。2周時，A組、B組愈合0個、C組愈合1個、D組愈合1個，提示由于時間短，未達(dá)到臨床愈合時間。4周時，A組、B組、C組分別愈合0個、1個、1個，與D組愈合6個比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；12周時，A組、B組、C組分別愈合0個、3個、3個，與D組愈合8個比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但愈合組織的顏色較正常半月板組織微黃，整體形態(tài)變小，裂口較術(shù)前變窄，其表面稍向內(nèi)陷，愈合組織與鄰近半月板組織粘連緊密。

2.2組織學(xué)檢查

A組：術(shù)后2-12周共觀察半月板30個，各觀察期裂口均未見愈合，細(xì)胞排列紊亂，大量瘢痕增生，損傷邊緣無成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖，見圖1。

B組：觀察12周半月板始終未見纖維軟骨樣增生，僅邊緣滑膜中成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞明顯增生，血管也見增生，見圖2。

C組：4周時缺損大部分被幼稚軟骨樣結(jié)構(gòu)所充填，缺損底部軟骨細(xì)胞肥大，有少量骨小梁及血竇形成，缺損范圍縮??；8周時軟骨下骨形成活躍；12周時缺損區(qū)接近正常軟骨，軟骨細(xì)胞散在排列，見圖3。

D組：術(shù)后2周見缺損為紅色的膠原蛋白組織填充，充滿整個缺損區(qū)，亦可見少量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞；術(shù)后4周，鏡下見缺損內(nèi)被膠原纖維組織填充，成纖維細(xì)胞為其主要的細(xì)胞成分；術(shù)后12周，所有缺損均被纖維軟骨樣組織填充?？梢娷浌羌?xì)胞特有的軟骨陷窩及軟骨囊，但修復(fù)的組織與鄰近的正常半月板組織仍存在差異，愈合組織中仍可見成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，見圖4。

圖112周，損傷處半月板纖維軟骨細(xì)胞基本消失，不規(guī)則纖維成分增生、瘢痕化

圖212周，生物蛋白膠組半月板細(xì)胞不規(guī)則散落在纖維組織中，增生的組織吞沒了半月板細(xì)胞

圖34周，滑膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生，未見纖維軟骨樣細(xì)胞

圖412周纖維軟骨細(xì)胞明顯增多，軟骨周圍成纖維細(xì)胞增生，軟骨細(xì)胞呈束狀排列

3　討論

半月板的解剖特點為半月板紅區(qū)具有血液供應(yīng)，該部分具有愈合能力，其余區(qū)域愈合能力較差。但臨床上多數(shù)醫(yī)生無法對半月板是否在“紅區(qū)”或“白區(qū)”的撕裂作出定位診斷，因此，一旦發(fā)生損傷，應(yīng)盡量修復(fù)損傷的半月板，而不是放棄愈合的機會。本文探索半月板損傷后愈合所需的條件，試驗中損傷對照組自始至終都表現(xiàn)為半月板未愈合，與文獻(xiàn)報道相符，提示半月板無血運區(qū)的損傷很難自然愈合[6,7]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1組、Ⅰ型膠原-纖維蛋白膠組和Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠組在4周、12周時表現(xiàn)出與對照組不同程度的愈合。在半月板無血運區(qū)損傷后4周，裂傷邊緣有少量正常半月板組織的同源細(xì)胞群。不能產(chǎn)生愈合的原因可能是因為進(jìn)入分裂狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)少、所需營養(yǎng)不足，起不到有效作用所致。因此，筆者認(rèn)為半月板無血運區(qū)損傷不能自然愈合，但是可以通過改變外部條件來促使其愈合。本研究所用的Ⅰ型膠原-生物蛋白膠和Ⅰ型膠原-TGF-β1-生物蛋白膠復(fù)合物促進(jìn)了半月板的愈合，印證了前述假設(shè)。

Ⅰ型膠原是一種含糖蛋白質(zhì)，近年來Ⅰ型膠原作為一種生物性載體其應(yīng)用逐漸增多。以膠原為基質(zhì)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，因膠原凝膠的強度差，修復(fù)軟骨缺損達(dá)不到力學(xué)強度，有實驗研究發(fā)現(xiàn)膠原在高壓強度下4周左右就被完全破損降解，而纖維蛋白膠比Ⅰ型膠原具有良好的機械性和可塑性，利用纖維蛋白膠可以降低Ⅰ型膠原的降解速度和增加膠原的機械強度[8-11]。外源性纖維蛋白膠在半月板無血管區(qū)損傷愈合中成功地起到一種支架作用，借助這種支架，纖維軟骨細(xì)胞可長入其中，并不斷增生分化，分泌合成膠原基質(zhì)，之后纖維蛋白逐漸降解，而代之以纖維軟骨細(xì)胞合成的膠原基質(zhì)，形成一個完整的半月板原位修復(fù)過程。由于修復(fù)半月板的主質(zhì)細(xì)胞是纖維軟骨修復(fù)，而并非以纖維修復(fù)為特征的瘢痕修復(fù)，使得臨床上以半月板原位修復(fù)代替半月板切除術(shù)治療半月板損傷成為可能。本研究Ⅰ型膠原-生物蛋白膠組在4周、12周時有部分半月板愈合的表現(xiàn)，提示損傷處的充填物起到了支架作用，促使惰性的半月板纖維軟骨細(xì)胞增殖、分化。

TGF-β主要通過兩種途徑促進(jìn)缺損的修復(fù)：一方面發(fā)揮軟骨誘導(dǎo)作用，促進(jìn)干細(xì)胞分化為軟骨；另一方面，促進(jìn)軟骨特異性基質(zhì)的合成。大量體外研究證實，適當(dāng)濃度的TGF-β1具有促進(jìn)半月板纖維軟骨細(xì)胞增殖的作用。本文Ⅰ型膠原-TGF-β1-纖維蛋白膠復(fù)合物可增強TGF-β1的生物學(xué)活性，其實驗結(jié)果比單用Ⅰ型膠原-生物蛋白膠或TGF-β1的結(jié)果要好，可形成纖維軟骨樣愈合。單獨應(yīng)用TGF-β1治療半月板損傷發(fā)現(xiàn)對無血運區(qū)半月板的損傷愈合無明顯影響，考慮主要是因為TGF-β在體外作用時間短，體外實驗的要求苛刻，體內(nèi)實驗不能完全模擬，且TGF-β在體內(nèi)容易被吸收、稀釋、降解、半月板創(chuàng)口內(nèi)無橋架材料以及TGF-β1無保護(hù)劑型和載體，因此，體外實驗利用TGF-β1對半月板愈合無影響。半月板損傷后，半月板的新陳代謝發(fā)生變化，很多復(fù)雜因素相互作用影響半月板愈合，如存在白細(xì)胞介素1(IL-1)或腫瘤壞死因子α(TNF-α)，內(nèi)在的半月板修復(fù)在體外顯著抑制，而合成代謝的生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)，雖然加強半月板修復(fù)，他們不能完全克服維護(hù)IL-1介導(dǎo)的抑制[12]。

膝關(guān)節(jié)半月板損傷是一種常見的運動損傷，因半月板的血供特點使半月板損傷成為臨床上治療修復(fù)的難題。本文驗證了轉(zhuǎn)化生子因子-β1與半月板愈合過程中的關(guān)聯(lián)性，采用Ⅰ型膠原-TGF-β1-生物蛋白膠復(fù)合材料對半月板無血運區(qū)損傷治療是非縫合技術(shù)治療半月板損傷一種可靠的治療手段。

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Experimental study on the effect of collagen type -TGF- I beta 1- fibrin sealant on the repair of meniscus injury in rabbits

WUPeng-fei,GUWen-guang，DAIZhi-tang.

(Departmentoforthopedics,Huai'anFirstPeople'sHospital,Huaian223300,China)

ObjectiveTo explore the type I collagen-transforming growth factor-β1 (Transform growth factor of TGF-β1) - fibrin glue composite repair rabbit meniscus injury effect of avascular zone.MethodsHealthy New Zealand white rabbits 60,the first unified damage model avascular zone in rabbits meniscus.Randomly divided into control group,TGF-β1 group,type I collagen-the fibrin glue group,and collagen type I-TGF-β1 in-fiber protein glue group.Control group did not deal with.Type I collagen fibrin glue complex,type-TGF-collagen I beta 1-fibrin glue composite material one-time injection gap,to the filler and the surface of the meniscus so far;TGF-beta 1 group of joint cavity for three weeks of continuous injection.2 weeks,4 weeks,12 weeks after surgery,respectively,were sacrificed animals,mainly for the observation of gross morphology and histological examination.ResultsMorphologically,the morphology of the meniscus of New Zealand white rabbits was smaller,and the color of New Zealand white rabbits was slightly yellow,and the texture was hard and brittle.Histological examination,B group of avascular area damage healing without obvious effect,only the synovial membrane at the edge of the meniscus into fiber cells have a significant role in promoting; meniscus wound in group C compared with preoperative small surface is slightly concave,healing tissue and adjacent meniscus tissue closely; group D meniscus showed fibrous cartilage healing,but partially healed with normal meniscus still has the difference.A,B,C group,in 4 weeks,12 weeks,compared with the D group,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionCollagen type I-TGF-β1 in-fibrin glue composite materials for the treatment of meniscus injury in the non blood circulation area is a reliable treatment method for the treatment of meniscus injury.

Menisci；the type I collagen；transforming growth factor-β1；fibrin glue

國家自然科學(xué)基金(81472512)

1007-4287(2016)09-1436-04

R684

A

2015-05-06)