人參皂苷Rb1對(duì)糖氧剝奪所致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

高　麗，興芝博，陸　斌，劉　磊,欒永昕*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 a.門診部;b.神經(jīng)外科,吉林 長(zhǎng)春130021；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部2013級(jí))

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人參皂苷Rb1對(duì)糖氧剝奪所致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

高麗1a，興芝博2，陸斌1b，劉磊1b,欒永昕1b*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 a.門診部;b.神經(jīng)外科,吉林 長(zhǎng)春130021；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部2013級(jí))

目的為了探討人參皂甙Rb1(GRb1)對(duì)糖氧剝奪(OGD)所致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及GRb1的保護(hù)作用機(jī)制。方法采用體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，應(yīng)用MTT法、TUNEL染色、流式細(xì)胞儀、Western Blotting等方法檢測(cè)GRb1對(duì)糖氧剝奪所致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用。結(jié)果GRb1預(yù)處理能增強(qiáng)OGD損傷細(xì)胞的生存能力，抑制OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究顯示GRb1能抑制由OGD線粒體膜電位的降低和線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C(cyct C)的釋放。結(jié)論研究表明GRb1對(duì)OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用與其對(duì)線粒體功能的保護(hù)有關(guān)。

人參皂苷Rb1;糖氧剝奪;線粒體;細(xì)胞色素c

(ChinJLabDiagn,2016,20:1425)

缺血性中風(fēng)是導(dǎo)致中老年人致死和致殘的主要原因之一。缺血再灌注是導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元損傷或死亡的主要因素。細(xì)胞凋亡在各種病理因素引起的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中起重要作用，而抗凋亡可以減輕缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。越來越多的證據(jù)表明，線粒體是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的細(xì)胞器。在應(yīng)激條件下，線粒體膜電位去極化，釋放線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C(cyct C)進(jìn)而啟動(dòng)了內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路[1]。

人參皂苷有抗感染、抗凋亡、誘導(dǎo)神經(jīng)性能改變等生物學(xué)功能，而GRb1可以抑制心、肝、腦細(xì)胞缺血再灌注損傷[2-4]。因此，GRb1可能是治療缺血再灌注引起腦損傷的潛在藥物。盡管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明GRb1能減緩局部缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，但它對(duì)線粒體功能的影響依舊不清楚。在本研究中，我們采用SH-SY5Y細(xì)胞的OGD模型模擬體內(nèi)神經(jīng)元缺血再灌注性損傷，探討GRb1對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1試劑

GRb1購(gòu)自國(guó)家藥品和生物制品檢測(cè)所，cyct C、細(xì)胞色素氧化酶IV(COX IV)單克隆抗體、山羊抗兔IgG和馬抗小鼠IgG購(gòu)自Cell Signaling公司，ECL購(gòu)自Amersham公司，PVDF膜購(gòu)自Millipore公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。其它試劑均購(gòu)自Sigma公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、糖氧剝奪及分組

人SH-SY5Y細(xì)胞從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所獲得。將制備好的SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分為以下幾組：對(duì)照組(正常SH-SYSY細(xì)胞常氧培養(yǎng)27 h)，OGD組(細(xì)胞糖氧剝奪3 h，然后常氧培養(yǎng)24 h)，OGD+GRb1組(分別用1.0 μmol/ L，10 μmol/ L和100 μmol/ L的GRb1與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育30 min，糖氧剝奪3 h，然后常氧培養(yǎng)24 h)。

1.3細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)

用酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值。細(xì)胞存活力的變化用各組的光吸收值與正常培養(yǎng)細(xì)胞的光吸收值的比值來表示。

1.4TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

通過計(jì)數(shù)帶綠色熒光的細(xì)胞與帶紅色熒光的細(xì)胞來定量細(xì)胞凋亡變化，并表示為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率。

1.5細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)試

用DCFH-DA評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)ROS的平均水平，其用任意單位/mg蛋白質(zhì)表示，作為對(duì)照。

1.6線粒體膜電位檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)羅丹明123細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.7差速離心

所收集的細(xì)胞經(jīng)差速離心后將沉淀用裂解液溶解后使用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組分的蛋白質(zhì)含量。

1.8凝膠電泳和Western印跡

等量蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜等過程，用柯達(dá)影像分析軟件分析光密度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1GRb1降低OGD引起的細(xì)胞凋亡

圖1示，SH-SY5Y細(xì)胞存活力在OGD再?gòu)?fù)氧后24 h下降到68.5%±5.2%。但是，用1.0 μmol/L和10.0 μmol/L的GRb1處理，其存活能力分別上升到82.1%±5.8%(與OGD組相比，P<0.01)，87.3%±6.3%(與OGD組相比,P<0.01)，但100 μmol/L的GRb1對(duì)細(xì)胞存活沒有保護(hù)作用。結(jié)果表明，1.0-10.0 μmol/L的GRb1對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活是有保護(hù)作用的，而100 μmol/L的GRb1是沒有保護(hù)作用。因此1.0-10.0 μmol/L的GRb1被用于后面的實(shí)驗(yàn)來研究GRb1對(duì)OGD引起的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

2.2GRb1抑制OGD引起的細(xì)胞凋亡

TUNEL染色評(píng)估細(xì)胞凋亡。圖2示，OGD組TUNEL染色(綠色)陽(yáng)性細(xì)胞百分率是28.8%±7.1%，顯著高于對(duì)照組7.8%±1.9%，而當(dāng)用1.0 μmol/L和10.0 μmol/L的GRb1預(yù)處理時(shí)其上升的百分率分別減少到20.9%±3.8%(與OGD組相比P<0.05)，12.4%±4.1%(與OGD組相比P<0.01)，因此，TUNEL染色結(jié)果表明GRb1可抑制OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

2.3GRb1維持線粒體膜電位

線粒體功能障礙是以線粒體膜的去極化為特征。圖3示：OGD使SH-SY5Y細(xì)胞膜電位從90.41%降到75.96%。用1.0 μmol/L或10.0 μmol/L的GRb1處理可以抑制線粒體膜電位的下降，并分別維持在81.84%和87.58%，這說明GRb1可以減緩OGD誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降。該結(jié)果表明GRb1可以保護(hù)OGD造成的線粒體損傷。

圖1　MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

圖2　TUNEL染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖3　流式細(xì)胞儀測(cè)量線粒體膜電位

2.4GRb1抑制cyct C的釋放

線粒體內(nèi)的cyct C在啟動(dòng)內(nèi)在的細(xì)胞凋亡途徑中起重要作用。因此，我們通過差速離心分離亞細(xì)胞線粒體和細(xì)胞漿，并通過Western Blottting檢測(cè)線粒體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)cyct C的含量變化。圖4示：同對(duì)照組相比較，OGD后線粒體中cyct C水平顯著降低，但是細(xì)胞漿內(nèi)的cyct C顯著升高。而用1.0 μmol/L或10.0 μmol/L GRb1處理后則抑制了由OGD引起的cyct C的變化，GRb1降低線粒體內(nèi)cyct C釋放，并且減緩其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的增加，10.0 μmol/L效果較1.0 μmol/L更顯著。該結(jié)果提示了GRb1具有抑制線粒體損傷的作用。

圖4　Western印跡分析

3　討論

本研究表明無論是較低濃度(1.0 μmol/L)或是較高濃度(10.0 μmol/L)的GRb1都通過抑制細(xì)胞凋亡而顯著地減少OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，而且我們發(fā)現(xiàn)，GRb1的抗凋亡作用與其降低線粒體膜電位、防止cyct C從線粒體釋放等保護(hù)線粒體功能有關(guān)。這些結(jié)果表明GRb1對(duì)OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用是通過穩(wěn)定線粒體功能來完成的。

OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡常被用來模仿由腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[5]。預(yù)防或抑制細(xì)胞凋亡已成為保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的一種策略。GRb1通過多種途徑在細(xì)胞凋亡過程中起保護(hù)作用[2]。線粒體是公認(rèn)的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡至關(guān)重要的細(xì)胞器。越來越多的證據(jù)表明穩(wěn)定線粒體可以發(fā)揮其神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。Liang等人報(bào)道對(duì)由缺血再灌注引起的大腦損傷可以通過穩(wěn)定線粒體功能進(jìn)行缺血性后處理保護(hù)[6]。Jiang等人用帕金森病大鼠模型研究神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程中雷帕毒素的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)這與穩(wěn)定線粒體功能有關(guān)[7]。諸實(shí)驗(yàn)均表明穩(wěn)定線粒體功能是減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的一種途徑。

線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)活性氧的主要來源，而且也是活性氧攻擊目標(biāo)?；钚匝醯墓艨蓪?dǎo)致線粒體膜電位的衰減，膜電位是反映線粒體功能的指示器。因此，在本研究中我們檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的變化。我們發(fā)現(xiàn)用GRb1預(yù)處理能顯著將線粒體膜電位維持在一個(gè)較高的水平。Kong等人證明了GRb1通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，防止新生大鼠氯化鈷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[8]。我們的結(jié)論和先前的研究均表明GRb1對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用與其保護(hù)線粒體功能有關(guān)。

cyct C從線粒體釋放反映出線粒體功能障礙。在本研究中，我們證實(shí)GRb1可以有效地抑制cyct C由線粒體釋放。該結(jié)果與缺血模型中抗氧化劑可以抑制凋亡誘導(dǎo)因子和cyct C的釋放一致[9]。抑制cyct C的釋放表明GRb1預(yù)處理可以保護(hù)線粒體功能并抑制胱天蛋白酶依賴和胱天蛋白酶非依賴途徑的激活。Hashimoto等人證明GRb1通過刺激雌激素受體與ERK1/2，Akt的后續(xù)活化和抑制SAPK/ JNK，p38蛋白的活性減弱MPP+(1-甲基1-4-苯基吡啶)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。因此，這些先前的研究都表明，GRb1可以通過多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用

在本研究中，我們證明GRb1通過調(diào)節(jié)線粒體功能，包括維持線粒體膜電位、抑制凋亡誘導(dǎo)因子向細(xì)胞核移位和cyct C向細(xì)胞質(zhì)移位、提高線粒體內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2水平和降低促凋亡蛋白 Bax水平來抑制細(xì)胞凋亡。這些可能有助于我們理解GRb1抗凋亡作用的機(jī)制。

[1]Jordan J,de Groot PW,Galindo MF.Mitochondria:the headquarters in ischemia-induced neuronal death[J].Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2011,11(2):98.

[2]Wu Y,Xia ZY,Dou J，et al.Protective effect of ginsenoside Rb1 against myocardial ischemia/reperfusion injury in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Mol Biol Rep，2011,38(7):4327.

[3]Guo Y,Yang T,Lu J，et al.Rb1 postconditioning attenuates liver warm ischemia-reperfusion injury through ROS-NO-HIF pathway[J].Life Sci，2011,88(13-14):598.

[4]Lim JH,Wen TC,Matsuda S，et al.Protection of ischemic hippocampal neurons by ginsenoside Rb1,a main ingredient of ginseng root[J].Neurosci Res，1997,28(3):191.

[5]Marutani E,Kosugi S,Tokuda K，et al.A novel hydrogen sulfide-releasing N-methyl-D-aspartate receptor antagonist prevents ischemic neuronal death[J].J Biol Chem，2012,287(38):32124.

[6]Liang JM,Xu HY,Zhang XJ，et al.Role of mitochondrial function in the protective effects of ischaemic postconditioning on ischaemia/reperfusion cerebral damage[J].J Int Med Res，2013,41(3):618.

[7]Jiang J,Jiang J,Zuo Y，et al.Rapamycin protects the mitochondria against oxidative stress and apoptosis in a rat model of Parkinson's disease[J].Int J Mol Med，2013,31(4):825.

[8]Kim GS,Jung JE,Narasimhan P，et al.Release of mitochondrial apoptogenic factors and cell death are mediated by CK2 and NADPH oxidase[J].J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(4):720.

[9]James D,Parone PA,Terradillos O，et al.Mechanisms of mitochondrial outer membrane permeabilization[J].Novartis Found Symp,2007,287:170.

Ginsenoside Rb1 attenuates oxygen-glucose deprivation-induced apoptosis in SH-SY5Y cells via protection of mitochondria

GAOLi,XINGZhi-bo,LUBin,etal.

(DepartmentofPoliclinic,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the role of mitochondria in the protective effects of ginsenoside Rb1 on cellular apoptosis caused by oxygen-glucose deprivation.Methodsin this study,MTT assay,TUNEL staining,flow cytometry,immunocytochemistry and western blotting were used to examine the cellular viability.ResultsWe found that pretreatment with GRb1 improved the cellular viability damaged by OGD.Moreover,GRb1 inhibited apoptosis in SH-SY5Y cells induced by OGD.Further studies showed that the elevation of cellular reactive oxygen species levels and the reduction of mitochondrial membrane potential caused by OGD were both counteracted by GRb1.ConclusionOur study indicates that the protection of GRb1 on OGD-induced apoptosis in SH-SY5Y cells is associated with its protection on mitochondrial function and inhibition of release of AIF and cytochrome c.

ginsenoside Rb1;oxygen-glucose deprivation;mitochondria;cytochrome c

1007-4287(2016)09-1425-04

R392R743.3

A

2015-04-19)