薄荷內(nèi)生細菌的多樣性及組成分析

陳澤斌，李 冰，王定康，余 磊，徐勝光，張永福，任 禛

(1. 昆明學院 農(nóng)學院，云南 昆明 650214； 2. 云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，云南 昆明 650214； 3. 中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明 650223； 4. 昆明學院 生命科學與技術系，云南 昆明 650214)

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薄荷內(nèi)生細菌的多樣性及組成分析

陳澤斌，李 冰，王定康，余 磊，徐勝光，張永福，任 禛

(1. 昆明學院 農(nóng)學院，云南 昆明 650214； 2. 云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，云南 昆明 650214； 3. 中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明 650223； 4. 昆明學院 生命科學與技術系，云南 昆明 650214)

為了調(diào)查薄荷內(nèi)生細菌種類多樣性，應用高通量測序技術測定薄荷內(nèi)生細菌的16S rDNA-V4變異區(qū)序列，采用Qiime和Mothur等軟件整理和統(tǒng)計樣品序列數(shù)目和操作分類單元(OTUs)數(shù)量，分析物種的豐度、分布和α多樣性，以及物種豐富度的差異。研究獲得用于分析的有效序列和OTU數(shù)為60 034/226；稀疏曲線表明測序深度充分，OTU的數(shù)量接近于飽和。薄荷(樣品名BH)的Chao 1指數(shù)為226.0，Shannon多樣性指數(shù)為2.538。薄荷內(nèi)生細菌分布于以下10個屬：食酸菌屬(Acidovorax，65.34%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，17.32%)、土地桿菌屬(Pedobacter，5.88%)、甲基桿菌屬(Methylobacterium，4.33%)、Luteolibacter屬(1.94%)、土壤桿菌屬(Agrobacterium，1.53%)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium，1.30%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，0.92%)、黃桿菌屬(Flavobacterium，0.78%)、Dyadobacter屬(0.67%)；薄荷內(nèi)生細菌優(yōu)勢菌屬為食酸菌屬(Acidovorax，65.34%)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，17.32%)。Illumina MiSeq高通量測序技術為植物內(nèi)生細菌的研究提供了更加準確、科學的數(shù)據(jù)資源。

高通量測序；薄荷；內(nèi)生細菌；多樣性

現(xiàn)已從多種健康植物的根、莖、葉、果實、種子中分離出革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的植物內(nèi)生細菌，共達129種(隸屬于54個屬)[1]。目前研究比較系統(tǒng)的植物有棉花、小麥和花生。優(yōu)勢種類主要分布于假單胞屬(Pseudommonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)4個屬[2]。目前，還沒有發(fā)現(xiàn)不存在內(nèi)生細菌的植物種類或器官。

薄荷，土名“銀丹草”，為唇形科植物，即同屬其他干燥全草，多生于山野濕地河旁，根莖橫生地下，多生于2 100 m海拔高度，但也可在3 500 m海拔上生長，是一種有特種經(jīng)濟價值的芳香作物[3]。全株清氣芳香，葉對生，花小淡紫色，唇形，花后結(jié)暗紫棕色的小粒果。薄荷是中華常用中藥之一。它是辛涼性發(fā)汗解熱藥，治流行性感冒、頭疼、目赤、身熱、咽喉、牙床腫痛等癥[4]。外用可治神經(jīng)痛、皮膚瘙癢、皮疹和濕疹等。光棚溫室采摘的薄荷是春節(jié)餐桌上的鮮菜，清爽可口；平常以薄荷代茶，清心明目。在中國，薄荷主要以江蘇、安徽兩省產(chǎn)量最大[5]。

目前，關于薄荷內(nèi)生菌多樣性的研究均采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法[6-7]，采用非培養(yǎng)方法對其進行研究還未見報道。而許多研究已經(jīng)證實，通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物只占環(huán)境生物總數(shù)的0.1%～10%[8]，因此有必要采用非培養(yǎng)方法對薄荷內(nèi)生細菌的種類組成進行研究。本研究采用近年來興起的Illumina MiSeq第二代測序技術全面而準確地對薄荷內(nèi)生細菌種類組成進行研究，相較于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法及以16S rDNA為基礎的非培養(yǎng)方法，能夠產(chǎn)生測序覆蓋深度更大的數(shù)據(jù)量，檢測到傳統(tǒng)純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術未能發(fā)現(xiàn)的低豐度植物內(nèi)生細菌種類，為豐富植物微生態(tài)學理論及基因工程菌的研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

薄荷(樣品編號BH)樣品取自昆明學院農(nóng)學院果蔬實踐園，取樣時選擇生長性狀良好、無病害癥狀的健康葉片，取樣后立即放入樣品袋中，低溫保鮮，12 h內(nèi)處理[9]。

1.2 主要試劑與儀器

植物基因組DNA快速提取試劑盒DP305為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；GeneJET膠回收試劑盒為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；高保真PCR酶Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、Illumina建庫試劑盒NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit為New England Biolabs公司產(chǎn)品；MiSeq測序試劑盒v2、高通量測序儀(MiSeq System SY-410-1003)為美國Illumina公司產(chǎn)品；分光光度計(Nano drop 2000/2000C)為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 表面消毒

將薄荷葉片用自來水沖洗干凈，再用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分，參考文獻[10]檢驗表面消毒效果。

1.4 總DNA提取

[11]的方法提取薄荷葉片總DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的純度和濃度，取適量樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。

1.5 16S rDNA-V4區(qū)的PCR擴增

以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的16S rDNA-V4區(qū)特異引物515F(5’-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-CAGATCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，使用高效和高保真酶(New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer)進行PCR，確保擴增效率和準確性。

1.6 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.7 16S rDNA文庫構(gòu)建并測序

1.7.1 構(gòu)建文庫

使用New England Biolabs公司的NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建。通過3′-5′核酸外切酶及聚合酶的共同作用，修復帶有突出末端的DNA片段。在修復平整的DNA片段3′端引入單堿基“A”，接頭的3′末端含有單堿基“T”，從而保證DNA片段和接頭能夠通過“A”“T”互補配對連接，并防止接頭連接DNA片段的過程中，DNA片段彼此相連。在連接酶的作用下，孵育含有標簽的接頭與DNA片段，使其相連。利用PCR選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段，同時擴增DNA文庫。PCR應盡量使用較少的循環(huán)數(shù)，避免PCR擴增中文庫出現(xiàn)錯誤。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，合格后，使用MiSeq進行上機測序[12-15]。

1.7.2 均一化文庫

將樣品DNA文庫均一化至10 nmol·L-1后等體積混合。

1.7.3 上機測序

將混合好的文庫(10 nmol·L-1)逐步稀釋定量至4～5 pmol·L-1后用Illumina MiSeq測序儀測序，進行生物信息分析。本研究的測序和生物信息服務在北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.8 生物信息學分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)(dirty data)，為了使信息分析的結(jié)果更加準確、可靠，首先對原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、過濾、去嵌合體后，得到有效數(shù)據(jù)(effective tags)[16]，剔除宿主葉綠體和線粒體序列，然后對有效數(shù)據(jù)在97%水平上進行OUT聚類，并利用Greengene數(shù)據(jù)庫進行物種注釋[17]。通過對OTUs進行豐度、α多樣性、β多樣性以及物種在各個分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成[18-19]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用uparse(version 7.1 http:∥qiime.org/)軟件平臺進行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成；利用Mothur軟件做稀釋曲線分析；分別利用香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)和物種豐富度指數(shù)(ACE)公式計算細菌生態(tài)多樣性指數(shù)；利用Excel和 Mothur軟件制作Venn圖；利用Fasttree軟件+R語言制作熱圖；利用諾禾致源自主開發(fā)的軟件SVG制作特定物種分類樹圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列長度分布

BH樣品所測得的60 731條PE Reads長度分布在190～350 bp范圍內(nèi)，長度為250 bp的序列最多，有60 217條。從序列長度的分布來看，與16S rDNA-V4區(qū)序列長度大致吻合。

2.2 OTUs數(shù)目統(tǒng)計及物種注釋分析

BH樣品共獲得60 034條Tags(過濾后得到的拼接序列數(shù))，可分為226個OTUs(97%的序列相似性，下同)，包括58 414條可獲得分類信息的Tags，1 620條低頻Tags(圖1)。BH可以注釋到14 424個屬。圖2展示了BH樣品中相對豐度排名前10個屬細菌所對應的OTUs的系統(tǒng)發(fā)生關系數(shù)據(jù)，表明薄荷內(nèi)生細菌主要分布于以下10個屬：黃桿菌屬(Flavobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Luteolibacter屬、Dyadobacter屬、土地桿菌屬(Pedobacter)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、 食酸菌屬(Acidovorax)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、 土壤桿菌屬(Agrobacterium)；從OTUs豐度聚類圖來看(圖3)，在屬的分類水平上，相對豐度由大到小依次為：食酸菌屬(Acidovorax)>鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)>土地桿菌屬(Pedobacter)>甲基桿菌屬(Methylobacterium)>Luteolibacter屬>土壤桿菌屬(Agrobacterium)>鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)>金黃桿菌屬(Chryseobacterium)>黃桿菌屬(Flavobacterium)>Dyadobacter屬。

圖1 樣品的Tags和OTUs數(shù)目統(tǒng)計Fig.1 The statistics of Tags and OTUs number in sample BH

圖2 OTUs的系統(tǒng)發(fā)育關系及其物種注釋Fig.2 Phylogenetic relationship species annotation of OTUs

圖3 OTUs豐度聚類圖Fig.3 Abundance clustering figure of OTUs

2.3 多樣品中特定物種分類樹

從門的分類水平來看(圖4)，薄荷內(nèi)生細菌在擬桿菌門(Bacteroidetes，9.55%)、變形菌門(Proteobacteria，88.51%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，1.94%)中均有分布；從綱的分類水平來看(圖4)，薄荷內(nèi)生細菌在Flavobacteriia綱(1.70%)、Sphingobacteriia綱(7.85%)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria，23.17%)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria，65.34%)、疣微菌綱(Verrucomicrobiae，1.94%)中均有分布；從目的分類水平來看(圖4)，薄荷內(nèi)生細菌在黃桿菌目(Flavobacteriales，1.70%)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales，7.85%)、根瘤菌目(Rhizobiales，5.86%)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales，17.32%)、伯克氏菌目(Burkholderiales，65.34%)、疣微菌目(Verrucomicrobiales，1.94%)中均有分布；從科的分類水平來看(圖4)，薄荷內(nèi)生細菌在黃桿菌科(Flavobacteriaceae，1.70%)、屈撓桿菌科(Flexibacteraceae，0.67%)、鞘脂桿菌科(Sphingobacteriaceae，7.18%)、甲基桿菌科(Methylobacteriaceae，4.33%)、根瘤菌科(Rhizobiaceae，1.53%)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae，17.32%)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae，65.34%)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae，1.94%)中均有分布；從屬的分類水平來看(圖4)，薄荷內(nèi)生細菌在食酸菌屬(Acidovorax，65.34%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，17.32%)、土地桿菌屬(Pedobacter，5.88%)、甲基桿菌屬(Methylobacterium，4.33%)、Luteolibacter屬(1.94%)、土壤桿菌屬(Agrobacterium，1.53%)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium，1.30%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，0.92%)、黃桿菌屬(Flavobacterium，0.78%)、Dyadobacter屬(0.67%)中均有分布；由此可見，食酸菌屬(Acidovorax，65.34%)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，17.32%)為薄荷內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群。

2.4 樣品復雜度分析

從稀釋曲線來看(圖5)，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平坦，進入平臺期，說明再增加測序數(shù)量也只會產(chǎn)生少量新的OTUs；從Chao1指數(shù)曲線來看(圖6)，Chao1指數(shù)在8 000的測序數(shù)量范圍內(nèi)增幅最大，在8 000以后曲線斜率下降；從Shannon指數(shù)曲線來看(圖7)，Shannon指數(shù)在8 000的測序數(shù)量范圍內(nèi)增幅最大，在8 000以后曲線斜率下降。3條曲線在測序數(shù)量超過8 000后都趨近平緩，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息；從Rank Abundance曲線來看(圖8)，BH樣品在水平方向的跨度較大，在垂直方向的平滑程度高，說明薄荷內(nèi)生細菌的豐度大，且物種的分布較均勻。α多樣性分析表明，薄荷(樣品名BH)的Chao 1指數(shù)為226.0，Shannon多樣性指數(shù)為2.538。

數(shù)字表示該分類所占比例。圖4 樣品BH中特定物種分類樹Fig.4 Classification tree of particular species from sample BH

圖5 稀釋曲線Fig.5 Rarefaction curve

圖6 Chao1指數(shù)曲線Fig.6 Chao1 indexes curve

圖7 Shannon多樣性指數(shù)曲線Fig.7 Shannon indexes curve

圖8 Rank abundance曲線Fig.8 Rank abundance curve

3 討論

16S rRNA基因很早就應用在微生物菌種鑒定上，但利用高通量測序進行16S rRNA分析最早開始于2006年，Sogin等[20]應用該技術對深海微生物群落進行了分析，隨后該技術在腸道微生物領域得到了廣泛應用[21]。目前該技術應用于植物內(nèi)生微生物的研究尚未見報道。本研究首次將近幾年迅速發(fā)展并成為主流的Illumina MiSeq第二代測序技術應用于植物內(nèi)生細菌研究，克服了傳統(tǒng)分子生物學方法通量低的缺陷，從基因組水平上解析微生物群落結(jié)構(gòu)，突破了很多厭氧內(nèi)生微生物尚不能被分離培養(yǎng)的技術瓶頸[22-23]，相較于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)和以16S rDNA為基礎的非培養(yǎng)方法，Illumina MiSeq第二代測序技術可以檢測到以往沒有檢測到、同樣扮演著重要角色的低豐度植物內(nèi)生細菌種類，豐富植物內(nèi)生細菌資源，例如Dyadobacter屬(0.67%)。本研究對植物中好氧、厭氧和兼性厭氧內(nèi)生微生物群落的種類、豐度和分布進行了分析，顯示出高通量技術在植物內(nèi)生微生物研究中的明顯優(yōu)勢，相較于傳統(tǒng)分子生物學的研究結(jié)果，高通量測序技術覆蓋了整個內(nèi)生微生物群落的信息，能更準確地反映植物內(nèi)生微生物中不同豐度菌群的組成和真實比例，本研究可為今后其他研究者使用該技術開展同類研究提供參考。

就植物組織而言，葉綠體和線粒體與細菌在系統(tǒng)發(fā)育上具有高度的同源性[24]。在對薄荷內(nèi)生細菌的16S rDNA-V4變異區(qū)序列進行Illumina MiSeq高通量測序后，確實發(fā)現(xiàn)部分序列歸屬于宿主葉綠體和線粒體，存在一定比例的宿主污染現(xiàn)象，為了使細菌多樣性分析結(jié)果更加準確、可靠，本研究剔除了宿主葉綠體和線粒體序列。只選擇16S rDNA-V4區(qū)作為測序區(qū)域，若要將高通量測序技術更好地應用于植物內(nèi)生微生物研究，下一步應在不同高通量測序平臺上針對16S rDNA不同可變區(qū)的選擇及組合做嘗試，評估樣品的復雜程度以及宿主的污染情況，選擇合理的測序區(qū)域或設計特異性更高的引物，制定更好的測序策略，以避免線粒體和葉綠體的干擾。

本研究結(jié)果只能將內(nèi)生細菌注釋到屬的分類水平，而第一代Sanger測序可以將細菌注釋到種的水平，這是因為16S rRNA總長約1 540 bp，包含9個可變區(qū)，第一代測序讀長長、準確率較高，所以能根據(jù)測得的全長16S rRNA序列注釋到種，但第一代Sanger測序通量較低，大規(guī)模測序成本高。Illumina MiSeq高通量測序技術，一般每個樣品可以保證測定4～6萬個序列數(shù)，由于覆蓋深度非常大，對物種多樣性的分析十分有利，但是通量的增加是以犧牲序列讀長為代價，由于高通量測序讀長短，不可能將16S rRNA的9個可變區(qū)全部測序，所以往往只選擇1～3個可變區(qū)作為測序區(qū)域，單端測序長度可達到250 bp，雙端測序長度可達到500 bp，測序片段越短，在后續(xù)對序列進行物種注釋時的分辨度越低。

本研究發(fā)現(xiàn)，薄荷內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群為食酸菌屬(Acidovorax，65.34%)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，17.32%)。這與前人通過培養(yǎng)方法得出植物優(yōu)勢類群為芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌的結(jié)果不同[25]，這是因為培養(yǎng)方法分析的細菌只限于那些能夠在人工培養(yǎng)基上生長的細菌，而許多研究已經(jīng)證實，通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物只占環(huán)境生物總數(shù)的0.1%～10%[22-23]，因此通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的結(jié)果并不能真實地反映出內(nèi)生細菌多樣性，這就使得用傳統(tǒng)方法研究植物內(nèi)生細菌的種群結(jié)構(gòu)、多樣性及與宿主之間的相互作用受到了極大的限制。Illumina MiSeq高通量測序技術可為植物內(nèi)生細菌的研究提供了更加準確、科學的數(shù)據(jù)資源。已有研究表明，鞘氨醇單胞菌屬細菌能夠利用的底物廣泛，從多環(huán)芳烴類化合物、聚乙烯醇等高聚物到簡單無機物N2+都能利用，某些種屬還能產(chǎn)生有價值的生物高分子(如β-胡蘿卜素、結(jié)冷膠)[26]。說明薄荷內(nèi)生細菌可為復雜有機物的降解提供良好的微生物來源；還有研究表明，定殖生長于植物組織中的內(nèi)生細菌，有些能夠產(chǎn)生細胞壁降解酶類[27]。這些物質(zhì)對植物抵抗病原菌侵入、潛伏、擴展蔓延等都是非常重要的。真菌細胞壁的主要組成成分是葡聚糖和幾丁質(zhì)，某些內(nèi)生細菌產(chǎn)生細胞壁降解酶如葡聚糖酶 (β-glucanse)和幾丁質(zhì)酶 (Chitinase)，使真菌細胞水解或死亡，從而達到防病效果。例如，一種用于防治棉花黃萎病的內(nèi)生菌，可產(chǎn)生某些蛋白酶降解毒素達到防病的效果[27]。因此，推測薄荷內(nèi)生細菌的優(yōu)勢類群鞘氨醇單胞菌屬細菌能夠降解某些病原菌的細胞壁或毒素，與寄主植物的抗病性直接相關。食酸菌屬作為內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群尚屬首次報道，關于食酸菌屬細菌的功能、代謝的研究目前還未見報道。

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(責任編輯 張 韻)

Diversity and structure of endophytic bacteria in Menthae Haplocalycis Herba

CHEN Ze-bin1，2， LI Bing3，*， WANG Ding-kang4， YU Lei1， XU Sheng-guang1， ZHANG Yong-fu1， REN Zhen1

(1.AgricultureCollege，KunmingUniversity，Kunming650214，China; 2.EngineeringResearchCenterforCharacteristicsAgricultureofYunnanProvince，Kunming650214，China; 3.KunmingInstituteofZoology，ChineseAcademyofSciences，Kunming650223，China; 4.LifeScienceandTechnologyDepartment，KunmingUniversity，Kunming650214，China)

In order to investigate the endophytic bacterial community， leaves samples were collected from Menthae Haplocalycis Herba. The 16S rDNA-V4 region of leaves collected from Menthae Haplocalycis Herba were sequenced by Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology. Using Qiime and Mothur softwares， the number of sequences and operational taxonomic units (OTUs) for sample was sorted and calculated， the species abundance and distribution， Alpha diversity index and difference in species abundance among samples were analyzed. The number of effective sequences and OTUs for each sample were 60 034/226. The rarefaction curves showed that adequate sampling was achieved. The number of OTUs was close to saturation. The chao 1 and Shannon indexes of sample BH were 226.0 and 2.538, respectively. The species of endophytic bacteria in Menthae Haplocalycis Herba belonged toAcidovorax(65.34%)，Sphingomonas(17.32%)，Pedobacter(5.88%)，Methylobacterium(4.33%)，Luteolibacter(1.94%)，Agrobacterium(1.53%)，Sphingobacterium(1.30%)，Chryseobacterium(0.92%)，F(xiàn)lavobacterium(0.78%) andDyadobacter(0.67%). The dominant species wereAcidovoraxandSphingomonaswith a percentage of 65.34% and 17.32% respectively. Illumina high-throughput sequencing technology provided more accurate and scientific data resources for the study of endophytic bacteria in Menthae Haplocalycis Herba.

high-throughput sequencing; Menthae Haplocalycis Herba; endophytic bacteria; diversity

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.10

2015-06-12

國家自然科學基金項目(31460491)；云南省科技廳應用基礎研究計劃青年項目(2013FD040)；云南省教育廳科學研究項目(2014Y390)；昆明學院人才引進項目(YJL14005)；云南省高校優(yōu)勢特色重點學科(生態(tài)學)建設項目

陳澤斌(1985—)，男，云南昆明人，博士，副教授，主要從事環(huán)境微生物的教學及科研工作。E-mail: zbchenkmu@163.com

*通信作者，李冰，E-mail: libing@mail.kiz.ac.cn

S182

A

1004-1524(2016)01-0056-08

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):56-63

陳澤斌，李冰，王定康，等. 薄荷內(nèi)生細菌的多樣性及組成分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28(1)：56-63.