丙肝感染宿主親嗜性基因OCLN和CD81在獼猴川西亞種組織中的分布

何 柳，陳正禮，羅啟慧，鄧 娟，夏 玉，史良琴，程安春

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型研究室，四川 溫江 611130； 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/動(dòng)物疾病與人類健康中心四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 雅安 625014)

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丙肝感染宿主親嗜性基因OCLN和CD81在獼猴川西亞種組織中的分布

何 柳，陳正禮，羅啟慧，鄧 娟，夏 玉，史良琴，程安春

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型研究室，四川 溫江 611130； 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/動(dòng)物疾病與人類健康中心四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 雅安 625014)

丙型肝炎動(dòng)物模型缺乏限制了丙型肝炎的研究，如果與人類基因背景相似的獼猴能作為丙型肝炎動(dòng)物模型將有重大意義。文章擬通過檢測決定HCV感染物種特異性的關(guān)鍵基因OCLN與CD81在獼猴不同組織的表達(dá)量，并以HCV易感的人肝癌細(xì)胞系Huh 7.5.1為對照，來探究獼猴作為丙型肝炎動(dòng)物模型的可能性。結(jié)果表明，OCLN與CD81在獼猴川西亞種的肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)和脊髓中均有表達(dá)，但表達(dá)量均極顯著低于在Huh 7.5.1細(xì)胞系中的表達(dá)量(P<0.01)。肝臟中的OCLN表達(dá)量略低于肺臟中的表達(dá)量，而肝臟CD81的表達(dá)量均高于其他組織。并且，OCLN在不同組織中的表達(dá)水平與人體OCLN表達(dá)規(guī)律相符合(脾<肝<肺)。該結(jié)果提示HCV感染的宿主親嗜性基因OCLN與CD81在獼猴中的低表達(dá)量可能導(dǎo)致HCV不能有效地結(jié)合組織靶細(xì)胞，因此推測，獼猴不能直接用于丙型肝炎動(dòng)物造?？赡芘c此有關(guān)。今后可通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)增強(qiáng)OCLN與CD81基因的表達(dá)，從而使獼猴獲得直接感染HCV的能力。

HCV；OCLN；CD81；獼猴川西亞種；動(dòng)物模型

咬合蛋白Occludin(OCLN)是構(gòu)成緊密連接(tight junctions，TJ)的組成成分之一，其進(jìn)化保守，小鼠、人類和犬的OCLN基因有90%的同源性[1]。在正常發(fā)育的肺、肝等組織中OCLN具有高表達(dá)水平[2]。研究表明，緊密連接蛋白OCLN是HCV進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵因素之一[3]。Cluster designation 81(CD81)是4次跨膜蛋白超家族成員之一，與細(xì)胞的吸附、激活、增殖與分化等有關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，CD81是HCV入胞的受體，其通過與HCV E2結(jié)合，使HCV吸附于細(xì)胞表面。Ploss等[5]將人CD81和OCLN以及鼠的CLDN1和SR-BI轉(zhuǎn)染到非肝來源的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)這些原本無法被HCV感染的細(xì)胞獲得了HCV易感性，進(jìn)而將可以感染HCV的Huh 7.5與HepB細(xì)胞中的OCLN，CD81分子表達(dá)沉默，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞感染HCVpp和HCVcc的能力均有下降。該結(jié)論證明，OCLN與CD81是介導(dǎo)HCV感染細(xì)胞的關(guān)鍵因素之一，并且可能與HCV感染的物種特異性有關(guān)[6-7]。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)只能感染人類與黑猩猩，丙型肝炎動(dòng)物模型的缺乏限制了丙型肝炎的研究。獼猴川西亞種作為中國特有的物種，分布廣泛，其親緣關(guān)系與人類非常相近，是良好的人類疾病模型動(dòng)物。然而Bukh[8]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴不能感染丙型肝炎。由于病毒特異性受體的表達(dá)和分布是影響HCV感染的宿主親嗜性的重要限制因素，并且其表達(dá)量低會(huì)限制HCV的感染，因此研究獼猴不同組織的OCLN與CD81表達(dá)量對分析獼猴作為丙型肝炎模型的潛力有重大意義。本試驗(yàn)通過對獼猴川西亞種的不同組織中OCLN與CD81的表達(dá)量進(jìn)行檢測，并將其與人類肝癌細(xì)胞系Huh 7.5.1的OCLN與CD81的表達(dá)量相比較，探究獼猴川西亞種作為丙型肝炎動(dòng)物模型的可能性。丁紅方等[9]發(fā)現(xiàn)，丙肝患者除了在肝臟組織中檢測到HCV陽性以外，在肺，脾，淋巴結(jié)等肝外組織中均可以檢測到HCV抗原陽性。因此，我們選取了獼猴的肝、脾、肺、淋巴結(jié)和脊髓作為材料，通過熒光定量PCR檢測OCLN和CD81在這些潛在HCV易感組織中的表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物本試驗(yàn)所用5只健康雄性成年獼猴川西亞種均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)中心/國家實(shí)驗(yàn)用獼猴種源基地(四川雅安)提供[SCXK(川)：2013-105]。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由四川省雅安市雅安普萊美生物科技有限公司倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)使用。實(shí)驗(yàn)操作于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)中心[SYXK(川)2014-187]進(jìn)行。Huh 7.5.1細(xì)胞系由武漢病毒研究所提供。

1.1.2 主要試劑TaKaRa RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、ExTaq酶、dNTPs與SYBRⅡ均購自寶生物工程(大連)有限公司；DEPC、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇為國產(chǎn)分析純試劑。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Bio-Rad CFX96TM。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)參照GenBank中注冊的獼猴OCLN，CD81及內(nèi)參β-actin基因序列(序列號(hào)分別為XM_002804403.1，NM_001266249.1與NM_001033084.1)，分別選取種屬間保守序列，參考PCR引物設(shè)計(jì)原則，借助計(jì)算機(jī)軟件Primer 6設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。OCLN上游引物：5′-ATGACCCGCAGACCACCAA-3′，下游引物：5′-CCAGGAAGCCGACGAACATC-3′；CD81上游引物：5′-ATGACCCGCAGACCACCAA-3′，下游引物：5′-CCAGGAAGCCGACGAACATC-3′；β-actin上游引物：5′-AAGGAGAAGCTGTGCTACG-TCG-3′，下游引物5′-TGCCCAGGAAGGAAGGTT-

G-3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 標(biāo)本采集解剖獼猴，采集肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)和脊髓，凍存于-20 ℃冰箱中以備使用。

1.2.3 RNA提取

取0.1 g組織，置于預(yù)冷的經(jīng)DEPC水處理的滅菌研缽中，液氮研磨后加入1 mL Trizol混合，并移至2 mL滅菌離心管中，按照操作說明分別從獼猴的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)以及脊髓組織中提取總RNA。離心收集培養(yǎng)好的Huh 7.5.1細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄獲得模板cDNA分別將提取的獼猴組織和細(xì)胞的總RNA用RNase-free水溶解后，采用以下體系去除基因組DNA：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL， gDNA Eraser 1 μL， 總RNA 3 μL， RNase Free dH2O 4 μL配置成10 μL體系，42 ℃水浴2 min，置于冰上冷激。抽取上述反應(yīng)液，采用反轉(zhuǎn)錄體系：反應(yīng)液10 μL， PrimerScriptRT Enzyme Mix1 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimerScript Buffer 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL配置成20 μL體系，37 ℃保溫15 min，85 ℃加熱5 s，置于冰上冷激后得到可用于熒光定量PCR的cDNA。

1.2.5 PCR擴(kuò)增為鑒定引物的擴(kuò)增特異性，采用上述合成的特異性擴(kuò)增引物，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，分別進(jìn)行丙肝感染關(guān)鍵基因OCLN和CD81、內(nèi)參基因β-actin的PCR擴(kuò)增。將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2 %瓊脂糖電泳，并將PCR產(chǎn)物送至上海生工測序。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對5只獼猴的各個(gè)組織cDNA進(jìn)行定量擴(kuò)增，采用25 μL熒光定量體系如下：cDNA模板2 μL， SYBR ?PremixExTaqTMⅡ 12.5 μL，上下游引物各1 μL，RNase free dH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，58.6 ℃延伸30 s，72 ℃復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1OCLN，CD81與β-actin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果與測序分析用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別從獼猴組織細(xì)胞系中得到約169，126與179 bp的目的片段，與預(yù)期的條帶大小一致，見圖1。將PCR產(chǎn)物送檢測序，將其測序結(jié)果與GenBank進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果證實(shí)該擴(kuò)增產(chǎn)物與基因模板序列同源性為100%。

泳道1為DL 2 000 marker； 泳道2為以獼猴川西亞種組織cDNA為模板擴(kuò)增出的β-actin片段(169 bp)； 泳道3為以獼猴川西亞種組織cDNA作為模板擴(kuò)增出的CD81片段(126 bp)； 泳道4為以獼猴川西亞種組織cDNA作為模板擴(kuò)增出的OCLN片段(179 bp)。圖1 OCLN和CD81基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification product of OCLN and CD81 genes

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用實(shí)時(shí)定量PCR對獼猴川西亞種的肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)和脊髓組織，以及Huh7.5.1細(xì)胞中的OCLN，CD81和β-actin進(jìn)行擴(kuò)增，所有的樣品均出現(xiàn)單一的S型擴(kuò)增曲線，且重復(fù)性好，結(jié)果見圖2。

2.3 熔解曲線分析

所有樣品中OCLN的熔解溫度為79.5～80.0 ℃，差值范圍≤0.5 ℃，屬于正常差值范圍，CD81的熔解溫度為86 ℃，β-actin的熔解溫度為88.5 ℃。所有基因的熔解曲線有一個(gè)特異峰，說明實(shí)驗(yàn)所用引物特異性好，見圖3。

2.4 相對表達(dá)量分析

采用Fold=2-△△CT對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Huh7.5.1中，CD81的表達(dá)量是OCLN的3.84倍(圖4)。獼猴不同組織中OCLN基因表達(dá)量明顯不同，一般肺部表達(dá)量最高，而淋巴結(jié)中最少，均極顯著低于Huh7.5.1中兩種基因的表達(dá)量(P<0.01)。針對OCLN在肝、脾和肺這3個(gè)主要臟器的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，5只獼猴符合以下規(guī)律：脾<肝<肺。淋巴結(jié)中OCLN的表達(dá)量最低，僅為Huh 7.5.1細(xì)胞中表達(dá)量的0.13%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Huh 7.5.1細(xì)胞中的表達(dá)量。獼猴肝臟中OCLN的表達(dá)量僅為Huh 7.5.1細(xì)胞中OCLN表達(dá)量的2.0%～3.5%，所檢測的所有肝臟樣品中，最高表達(dá)量是最低表達(dá)量的2.2倍，個(gè)體之間具有明顯差異(圖5、圖6)。而CD81在獼猴肝臟中的表達(dá)量最高，為Huh 7.5.1細(xì)胞中CD81表達(dá)量的4%～14%，最高表達(dá)量是最低表達(dá)量的3.5倍，不同個(gè)體之間差異明顯。在脊髓中表達(dá)量最低，脊髓中的CD81表達(dá)量僅為Huh 7.5.1細(xì)胞中表達(dá)量的1%，個(gè)體差異不明顯。與Huh 7.5.1細(xì)胞中CD81的表達(dá)量相比，淋巴結(jié)與脾臟中CD81表達(dá)量分別為Huh 7.5.1細(xì)胞的1%～6%與2%～5%，兩者表達(dá)量相當(dāng)(圖5、圖6)。

圖2 Huh7.5.1細(xì)胞系與獼猴不同組織中OCLN，CD81和β-actin擴(kuò)增曲線Fig.2 Quantitative PCR amplification plot of OCLN， CD81 and β-actin mRNA in Huh7.5.1 cells and different tissues of macaque

圖3 OCLN，CD81和β-actin熔解曲線Fig.3 Melting curve of OCLN， CD81 and β-actin

圖4 Huh 7.5.1中OCLN與CD81的表達(dá)量Fig.4 The expression of OCLN and CD81 in Huh 7.5.1

圖5 OCLN和CD81在Huh7.5.1與不同獼猴組織中的表達(dá)量Fig.5 The expression level of OCLN and CD81 in Huh7.5.1 and different macaque tissues

圖6 不同獼猴個(gè)體肝臟中OCLN和CD81的表達(dá)量Fig.6 The expression level of OCLN and CD81 in macaque liver

對比發(fā)現(xiàn)，獼猴組織中OCLN與CD81的表達(dá)量均遠(yuǎn)低于Huh7.5.1細(xì)胞中的基因表達(dá)量。

3 討論

OCLN蛋白是介導(dǎo)丙型肝炎病毒(HCV)入侵細(xì)胞并且完成完整增殖周期的關(guān)鍵蛋白，其異常表達(dá)會(huì)降低HCV以及HCVpp對人體細(xì)胞的感染[3，10]。丙型肝炎由于其多突變型而難以治愈，疫苗研制困難。由于HCV具有感染物種特異性，從而大大限制了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型種類[11]，故尋找可替代的染病狀態(tài)與人類盡可能接近的新的模型動(dòng)物是近年來研究的熱點(diǎn)。普遍認(rèn)為黑猩猩模型是最為理想的動(dòng)物模型，因?yàn)楹谛尚傻腍CV感染、致病和免疫等過程與人類相似，但是由于倫理爭議而被限制使用。盡管已有的樹鼩模型和人鼠嵌合肝模型等均可用于HCV感染的研究，但是由于感染陽性率低，肝臟病理變化輕微等原因而限制其使用[12-13]。

Kohaar等[6]研究發(fā)現(xiàn)，OCLN在人體不同組織的表達(dá)具有明顯的差異。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，獼猴川西亞種也具有該特點(diǎn)，但是組織中OCLN的表達(dá)量均顯著低于Huh 7.5.1中OCLN的表達(dá)量。除此之外，OCLN在獼猴川西亞種不同組織之間表達(dá)量明顯不同，這可能與HCV感染的組織特異性有關(guān)。本研究結(jié)果表明，OCLN在獼猴組織中表達(dá)量大小為脾<肝<肺，該結(jié)果也與Kohaar等[6]測得人類的OCLN表達(dá)規(guī)律相符合。Sourisseau等[14]研究發(fā)現(xiàn)，豚尾猴OCLN與獼猴OCLN的E2區(qū)氨基酸排布一致，兩者與人類OCLN的E2區(qū)僅有一個(gè)氨基酸差別，但是該差別并不影響HCV入胞過程，OCLN的表達(dá)量低則是限制HCV感染豚尾猴的原因。因此推測，獼猴OCLN可能具有介導(dǎo)HCV感染細(xì)胞的能力，但是由于其表達(dá)量極低，HCV感染可能受到限制。

Sourisseau等[14]發(fā)現(xiàn)，豚尾猴與人類CD81共有4個(gè)氨基酸的差別，而該差別導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)差異則是限制HCV入胞以及限制HCV感染物種特異性的重要因素，其表達(dá)量低也是影響HCV感染豚尾猴肝細(xì)胞的因素。而獼猴與豚尾猴CD81的HCV結(jié)合區(qū)域氨基酸排序一致，因此推測獼猴CD81與HCV結(jié)合過程可能受到限制。我們發(fā)現(xiàn)，CD81在獼猴組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量顯著低于Huh 7.5.1中的表達(dá)量，CD81在肝臟的表達(dá)量相比其他組織最高，也僅為4%～14%。我們推測，獼猴CD81表達(dá)量低以及其結(jié)構(gòu)變異可能阻礙HCV結(jié)合過程，可能是導(dǎo)致獼猴無法直接感染HCV的因素之一。Bitzegeio等[15]發(fā)現(xiàn)，小鼠CD81與HCV的結(jié)合效率低，但是突變型HCV則可以有效地與小鼠CD81結(jié)合，進(jìn)而感染細(xì)胞。因此，可在提高獼猴CD81表達(dá)量的同時(shí)，培養(yǎng)出適應(yīng)獼猴CD81的突變型HCV，用以感染獼猴進(jìn)行造模。

Dorner等[16]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了能夠表達(dá)人類OCLN，CD81分子的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，Ouyang等[17]建立了具有完整免疫功能的人鼠嵌合肝模型，Wu等[18]通過免疫組化證明了在該模型中有人類蛋白的存在，并且支持HCV復(fù)制及感染。但是上述兩種模型均不能用于免疫機(jī)制方面的研究[19-21]。與小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，獼猴擁有與人更加相近的基因背景和生理狀態(tài)，是良好的用于人類疾病造模的動(dòng)物。針對OCLN在獼猴川西亞種的組織中表達(dá)量相比于Huh 7.5.1極低，可能不易感染HCV這一問題，或許可以從基因角度進(jìn)行研究，通過提高OCLN的表達(dá)量來解決。由于結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的獼猴CD81可能無法有效與HCV結(jié)合這一問題，可以通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)解決，從而得到可以直接感染HCV的獼猴個(gè)體。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Distribution of HCV infection related OCLN and CD81 in different tissues of Macaca mulatta lasiotis

HE Liu1，CHEN Zheng-li1，2，LUO Qi-hui1，2，*，DENG Juan1，XIA Yu1，SHI Liang-qin1，CHENG An-chun2

(1.LaboratoryofExperimentalAnimalDiseaseModel，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince/CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

The study on hepatitis C virus (HCV) was restricted by lack of suitable animal model.Macacamulattalasiotis， known as macaque which has the similar genetic background with human， may be a suitable animal model for studying HCV infection. By testing the expression level of species tropism geneOCLNandCD81 in different macaque tissues， the possibility of using macaque as an effective animal model was explored with the expression level of HCV-susceptible human liver cancer cell line of Huh 7.5.1 as the control. The results showed thatOCLNandCD81 were expressed in liver， spleen， lungs， lymph nodes and spinal cord of macaque， but the expression levels were significantly lower than that in Huh 7.5.1(P<0.01). The expression ofOCLNin liver was lower than that in lung， butCD81 expression in liver was higher than other tissues. In addition， the expression ofOCLNin different tissues of macaque showed a similar pattern as that in human， with a decreasing order of lung>liver>spleen. It was concluded that the low expression level ofOCLNandCD81 in macaque could lead to the ineffective combination of HCV and target tissue， which was possibly related to the inefficiency of macaque as a suitable animal model for HCV. In future， the expression level of OCLN and CD81 in macaque may be enhanced by genetic manipulation， so as to improve the HCV-infection of macaque.

HCV; OCLN; CD81;Macacamulattalasiotis; animal model

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.08

2015-07-16

國家科技支撐計(jì)劃課題(2014BAI03B01)；國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2013YQ49085906)；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2013TD0015)

何柳(1994—)，女，河南許昌人，在讀本科生，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型方向。E-mail：heliu.july@gmail.com

*通信作者，羅啟慧，E-mail：lqhbiology@163.com

S852

A

1004-1524(2016)01-0044-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):44-50

何柳，陳正禮，羅啟慧，等. 丙肝感染宿主親嗜性基因OCLN和CD81在獼猴川西亞種組織中的分布[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(1)：44-50.