復(fù)方柴芩顆粒對(duì)鴨黃曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影響

李 楊，高 祝，榮 茜，楊曉敏，張 睿，李英倫

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

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復(fù)方柴芩顆粒對(duì)鴨黃曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影響

李 楊，高 祝，榮 茜，楊曉敏，張 睿，李英倫

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

建立肉鴨aflatoxin B1(AFB1)慢性中毒模型，設(shè)立正常組、模型組、亞硒酸鈉組、復(fù)方柴芩顆粒(中藥)高、中、低劑量組。造模后第7，14和21天處死肉鴨取肝，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)肝標(biāo)本中CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性。結(jié)果表明，與模型組相比，中藥高、中、低劑量組用藥7和14 d后肝臟微粒體細(xì)胞色素P450酶系CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性顯著降低；用藥21 d后CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性升高，但與模型組相比差異不明顯。說明前期復(fù)方柴芩顆粒通過抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性，減少AFB1前體物質(zhì)代謝激活，降低其化學(xué)性肝臟損傷達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。而用藥后21 d CYP450活性升高的原因可能是AFB1蓄積較多，需要更多的CYP450代謝AFB1。

細(xì)胞色素CYP1A2；細(xì)胞色素CYP3A4；細(xì)胞色素CYP2E1；復(fù)方柴芩顆粒；黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素B1(AFB1)是已知霉菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種。長(zhǎng)期采食含有此類毒素的飼料可對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生化學(xué)性肝損傷，嚴(yán)重的甚至產(chǎn)生肝癌等病變[1-2]。1993年世界衛(wèi)生組織癌癥機(jī)構(gòu)就將黃曲霉素列為Ⅰ類致癌物[3]。肝微粒體(liver microsomes)細(xì)胞色素P450酶系(cytochrome P450，CYP450)為一類亞鐵血紅素—硫醇鹽蛋白的超家族[4]，依次可分為家族、亞家族和亞型[5]。其參與內(nèi)源性、外源性和其他合成化合物的代謝和生物轉(zhuǎn)化，在解毒和生物活化等方面起了重要作用[6]。肝臟是黃曲霉素(aflatoxin)在動(dòng)物體內(nèi)的重要靶器官，黃曲霉素必須經(jīng)過體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化才能表現(xiàn)出劇毒性，主要與CYP450的氧化作用有關(guān)[7-8]。研究報(bào)道與AFB1代謝活化有關(guān)的CYP450超家族成員主要有CYP3A4，CYP2E1，CYP1A2等[9]。大量文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)大鼠的AFB1慢性中毒過程中CYP450超家族的影響，而對(duì)肉鴨的研究報(bào)道幾乎處于空白狀態(tài)。所以本實(shí)驗(yàn)利用肉鴨肝微粒體混合酶體外代謝體系，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)肉鴨AFB1慢性中毒過程中CYP1A2，CYP3A4，CYP2E1活性變化，并借此探討“復(fù)方柴芩顆?！痹谥委熑怿咥FB1慢性中毒的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物1日齡健康櫻桃谷肉鴨126羽(四川省雅安市洪池天府肉鴨養(yǎng)殖示范基地提供)。

1.1.2 試劑和藥品黃曲霉毒素B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)品(MSS1003，Pribolab北京泰勒棋科技公司代理)；分析純亞硒酸鈉；“復(fù)方柴芩顆?！?(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，由柴胡、黃芩、黃芪、五味子和澤瀉為原料制成)；鴨細(xì)胞色素P450亞酶CYP3A4，CYP1A2及CYP2E1活性檢測(cè)試劑盒(ELISA法)(上海哈靈生物科技有限公司)；甘必應(yīng)-鴨病毒性肝炎弱毒活疫苗(CH60株)(哈藥集團(tuán))；禽流感(H5+H9)二價(jià)滅活疫苗(H5N1 Re-5+H9N2 Re-2株)(哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司)。

1.1.3 儀器和材料Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；Sorvall Stratos型冷凍高速離心機(jī)(Thermo Scientific公司)；imark型酶標(biāo)儀(Bio-rad公司)；FSH-2A型組織勻漿機(jī)(無錫沃信儀器有限公司)；FuheHH-6型恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)；GNP-9270型隔水式CO2培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；pHs-25型酸度計(jì)(成都方舟科技開發(fā)公司)；各種型號(hào)移液槍(Thermo Scientific)；一次性注射器；各種型號(hào)離心管；手術(shù)剪等。

1.2 方法

1.2.1 分組及飼養(yǎng)管理

(1)將126羽1日齡健康櫻桃谷肉鴨隨機(jī)分成6組。分別為正常健康組(A組)、AFB1組(B組)、亞硒酸鈉組(C組)、高劑量藥物組(D組)、中劑量藥物組(E組)和低劑量藥物組(F組)。用未添加亞硒酸鈉的基礎(chǔ)配合日糧飼喂6 d。第7天開始使用不同飼喂計(jì)劃。

(2)第7天開始，正常健康組再繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)配合日糧，并給予每日每只肉鴨5 mL生理鹽水灌服。AFB1組飼喂含有AFB1 40 μg·kg-1的基礎(chǔ)配合日糧，同樣給予每日每只肉鴨灌服5 mL生理鹽水。三種劑量藥物組在飼喂含有AFB1 40 μg·kg-1的基礎(chǔ)配合日糧的同時(shí)，分別按高中低劑量灌服含“復(fù)方柴芩顆?！?2.0 g·mL-1，1.0 g·mL-1，0.5 g·mL-1(按原生藥計(jì))的藥液5 mL。亞硒酸鈉組飼喂含AFB1 40 μg·kg-1的基礎(chǔ)配合日糧并每日每只按肉鴨體重1 mg·kg-1溶于5 mL水后灌服[10]。實(shí)驗(yàn)開始前1周，動(dòng)物房需徹底打掃，使用的所有器具要清洗干凈并熏蒸消毒1 d，之后開門窗散味5 d后動(dòng)物入住。在實(shí)驗(yàn)過程中，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供適宜溫度、24 h光照和干凈充足的水源，2日齡時(shí)接種鴨病毒性肝炎弱毒活疫苗，14日齡時(shí)接種禽流感滅活疫苗。

1.2.2 樣品采集處理造模后第7，14，21天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別在每組取7羽肉鴨，放血致死?？焖偃〕龈闻K，即用冰冷的生理鹽水反復(fù)沖洗。放在冰盒中備用。

1.2.3 肉鴨肝微粒體制備在已取出的每個(gè)肝臟中準(zhǔn)確稱取2 g組織，將組織剪碎，按照1 g組織加4 mL TMS緩沖液(pH=7.5)標(biāo)準(zhǔn)，加入8 mL TMS緩沖液，入組織勻漿機(jī)中，制成20%(m/V)勻漿。然后置低溫高速離心機(jī)12 000g，4 ℃離心15 min，舍棄沉淀部分，移上清部分于2 mL EP管中，每管裝1.2 mL上清液，保留4管。每管上清液中加入88 mmol·L-1CaCl2，使終濃度為8 mmol·L-1，混勻后放置5 min后25 000g，4 ℃離心15 min取沉淀；用200 μL Tris-HCl(PH=7.4)將沉淀重懸， 并加入200 μL 20%甘油于-80 ℃凍存，用于檢測(cè)CYP3A4，CYP1A2，CYP2E1活性[11]。

1.2.4 CYPs活性檢測(cè)按照鴨細(xì)胞色素P450亞酶CYP3A4，CYP1A2及CYP2E1活性檢測(cè)試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 各組CYP3A4活性

與模型組相比，造模后第7和14天，正常組、高、中、低劑量組CYP3A4活性顯著降低；第21天時(shí)，正常組活性顯著低于模型組，高、中劑量組活性與模型組無顯著差異，低劑量組的CYP3A4活性顯著高于除陽(yáng)性對(duì)照組外的所有組。復(fù)方中藥3種劑量組的CYP3A4活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，造模后第21天的上升幅度最大。在數(shù)值上看，中劑量組更接近于正常值，尤其是造模后第21天。亞硒酸鈉組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CYP3A4活性均顯著高于其余5組。差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體見表1。

2.2 各組CYP1A2活性

與模型組相比，造模后第7天和第14天，正常組和“復(fù)方柴芩顆?！备咧械蛣┝?組的活性顯著降低；造模后第21天，中藥高中低劑量3組活性高于模型組但差異并不顯著。在相同造模時(shí)間的組間對(duì)比下，從數(shù)值上看均為中藥高劑量組最小，相對(duì)更接近正常值，但是3種劑量組的對(duì)比未呈現(xiàn)顯著差異。從造模后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)看，亞硒酸鈉組的活性均顯著高于其余5組。整個(gè)實(shí)驗(yàn)處于動(dòng)態(tài)學(xué)觀察各組的CYP1A2活性，復(fù)方中藥3種劑量組的CYP1A2活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，造模后第21天的上升幅度最大。差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體見表2。

表1 復(fù)方柴芩顆粒對(duì)CYP3A4活性的影響 (單位：U·L-1)

Table 1 Effect of compound chai qin particles on CYP3A4 activity (Unit: U·L-1)

投藥時(shí)間/dA組B組C組D組E組F組737.64±1.20c60.02±0.83b70.71±1.21a41.69±0.65Bc43.12±0.43c43.22±0.61c1437.82±1.34c61.54±0.99b73.29±1.40a43.80±1.03Bc45.51±0.80c45.51±0.84c2138.08±0.73c61.08±1.09b73.26±0.62a55.01±1.40Bb61.68±0.62b71.38±1.00a

注：同行數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

表2 復(fù)方柴芩顆粒對(duì)CYP1A2活性的影響(單位：U·L-1)

Table 2 Effect of compound chai qin particles on CYP1A2 activity (Unit: U·L-1)

投藥時(shí)間/dA組B組C組D組E組F組737.43±1.07c60.77±1.31b72.43±0.76a42.17±0.94c43.25±0.47c43.73±0.51c1439.59±0.93c61.23±1.13b73.21±0.89a43.37±0.61c44.96±0.31c45.45±0.68c2137.00±0.62c59.81±0.64b77.92±0.68a59.91±0.83b61.85±0.60b65.88±1.07b

2.3 各組CYP2E1活性

與模型組相比，造模后第7天和第14天，正常組、高、中、低劑量組CYP2E1的活性顯著降低，其中高劑量組活性下降趨勢(shì)更明顯；造模后第21天，中藥高中低劑量3組活性卻在數(shù)值上高于模型組，但差異并不顯著。正常組依舊顯著低于模型組。在3個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)數(shù)值上看均為中藥高劑量組最小，相對(duì)更接近正常值。整個(gè)實(shí)驗(yàn)處于動(dòng)態(tài)學(xué)觀察各組的CYP2E1活性，發(fā)現(xiàn)高中低劑量3組的活性隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)而升高，第21天活性升高趨勢(shì)最明顯。從造模后第7，14，21天這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞硒酸鈉組的CYP2E1活性一直顯著高于其余5組。差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體見表3。

表3 復(fù)方柴芩顆粒對(duì)CYP2E1活性的影響(單位：U·L-1)

Table 3 Effect of compound chai qin particles on CYP2E1 activity (Unit: U·L-1)

投藥時(shí)間/dA組B組C組D組E組F組737.39±1.07c58.59±0.61b72.69±2.07a41.49±0.76c42.40±0.80c44.02±1.09c1438.52±1.07c60.01±1.35b72.00±1.38a43.73±0.32c44.18±0.55c45.00±1.87c2137.64±0.89c57.74±0.84b73.23±1.57a59.22±0.84b62.11±0.61b64.24±1.09b

3 討論

本實(shí)驗(yàn)證明，AFB1慢性中毒雛鴨肝細(xì)胞腫大，膽管上皮增生及空泡變性，胞質(zhì)疏松，失去完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。血清中GOT，GPT，AKP活性升高，SOD活性顯著下降， MDA含量大幅升高?！皬?fù)方柴芩顆?！备咧械?種劑量組雖然也出現(xiàn)不同程度的膽管上皮增生、肝細(xì)胞腫大和輕微空泡變性等病變，但總體較模型組有緩解。一些血清生化酶和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)是反映動(dòng)物機(jī)體肝功能最重要最直接的指標(biāo)，“復(fù)方柴芩顆?！焙蛠單徕c能顯著降低雛鴨AFB1慢性中毒引起的GOT，GPT，AKP活性升高趨勢(shì)。顯著升高SOD活性，降低MDA含量[12]。說明“復(fù)方柴芩顆?！蹦苡行У胤乐稳怿嘃S曲霉毒素B1慢性中毒。

肝臟是動(dòng)物體內(nèi)、外源性物質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所，是物質(zhì)的蓄積和解毒器官，是AFB1重要的靶器官。AFB1在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化與CYP450有密切關(guān)系。CYP450超家族參與外源性和內(nèi)源性毒性物質(zhì)的生物激活，還參與藥物的氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)藥物、毒物的代謝[13]。整個(gè)超家族中參與外源性物質(zhì)和毒物代謝的具體關(guān)鍵酶根據(jù)底物不同而不同。其中參與AFB1代謝的最主要的關(guān)鍵酶是CYP3A4[14]。

目前，關(guān)于AFB1對(duì)CYPs超家族中CYP3A4影響的研究最多，研究表明AFB1進(jìn)入體內(nèi)后，代謝酶CYP3A4被刺激呈逐漸升高的趨勢(shì)[15]。而對(duì)其他亞型鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)造模后第7，14，21天CYP2E1，CYP3A4，CYP1A2活性都顯著升高，且活性均先升高后降低，在造模后第14天達(dá)到高峰。說明AFB1能顯著升高CYPs活性，可能是因?yàn)轶w內(nèi)外源性毒物AFB1進(jìn)入體內(nèi)，需要更多藥物代謝酶代謝而引起活性升高。在AFB1慢性中毒過程是肝臟損傷逐漸加深，之后損傷降低或趨于穩(wěn)定的狀態(tài)。

不同中藥對(duì)CYPs家族中不同基因型的成員活性影響不盡相同。在大鼠AFB1慢性中毒誘癌中，金花茶濃縮液顯著降低了CYP3A4活性，提示我們金花茶降低肝損的機(jī)制是通過降低CYPs活性來減少前致癌物的代謝，從而降低由AFB1引起的化學(xué)性肝損傷，達(dá)到保護(hù)肝臟的作用[16]。同樣，銀杏葉提取物顯著抑制CYP3A4活性，減少前致癌物代謝，達(dá)到保護(hù)肝組織的作用[17]。本次實(shí)驗(yàn)中，“復(fù)方柴芩顆?！痹谠炷：蟮?天和14天時(shí)能顯著抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性升高的趨勢(shì)，而第21天，CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性有升高的趨勢(shì)，且與模型組對(duì)比差異并不明顯。對(duì)比已報(bào)道的文獻(xiàn)推測(cè)原因可能是前期“復(fù)方柴芩顆粒”通過抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性，減少AFB1前體物質(zhì)代謝激活，降低其化學(xué)性肝臟損傷達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。由于本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明，“復(fù)方柴芩顆?！备咧械?種劑量組在用藥后7～21 d能有效地防治肉鴨黃曲霉毒素B1慢性中毒[12]，所以本實(shí)驗(yàn)中用藥第21天，CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性反而升高的原因可能是因?yàn)橛盟帟r(shí)間增加，代謝AFB1毒性的CYP450超家族也相應(yīng)地增多來滅活和代謝體內(nèi)增加的AFB1，從而降低AFB1對(duì)肝的損傷。在數(shù)值上分析，“復(fù)方柴芩顆?！?種劑量組的CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性，高劑量組更接近于正常組，效果最好，但是3種劑量差異效果實(shí)際并不顯著。

硒(Se)是生物體必需且毒性極強(qiáng)的微量元素，其本身比較特殊，具有一定的毒性，并且治療劑量與中毒劑量非常接近。內(nèi)服或注射劑量過大或多次連續(xù)使用，就會(huì)造成動(dòng)物中毒[18]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于Se對(duì)CYP450的影響一直存在不一致的報(bào)道，其對(duì)CYP450不同亞型的影響不盡相同。Gregory等[19]的實(shí)驗(yàn)證明，在含AFB1 750 ng·g-1日糧中添加2.0 mg·kg-1的Se對(duì)CYP450無影響。另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示，Se誘導(dǎo)老鼠肝臟細(xì)胞CYP2B活性，但對(duì)CYP1A無影響[20]。而本實(shí)驗(yàn)中亞硒酸鈉組的3種酶活性在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都高于正常組和AFB1組，說明Se誘導(dǎo)了CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性。由于無文獻(xiàn)報(bào)道明確解釋該現(xiàn)象，故推測(cè)原因可能是亞硒酸鈉連續(xù)投用21 d，由于Se蓄積造成影響，使得CYPs不得不通過提高活性或含量來提高肝臟的自身代謝能力來清除包括硒在內(nèi)的體內(nèi)蓄積的毒素。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)揭示了“復(fù)方柴芩顆?！狈乐稳怿咥FB1慢性中毒的部分作用機(jī)理，即前期是通過抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性減少AFB1前體物質(zhì)代謝激活，降低化學(xué)性肝臟損傷。后期隨著投用時(shí)間增加，中藥組的AFB1被代謝成AFBO的量少，用藥時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)使AFB1的量高于模型組，蓄積在體內(nèi)的AFB1增多，此時(shí)“復(fù)方柴芩顆?！眴?dòng)激活CYP3A4，CYP1A2和CYP2E1活性系統(tǒng)來代謝、滅活A(yù)FB1產(chǎn)物，達(dá)到降低肝損的目的。這也提示我們?cè)谂c其他藥物聯(lián)合使用時(shí)要避免拮抗作用。

正如很多研究者所說，CYP450是一把雙刃劍，它們既可以活化毒物，又可以滅活有害物質(zhì)，因此，誘導(dǎo)與抑制CYP450活性與動(dòng)物體損傷的發(fā)生或防治有很密切的關(guān)系[21]。這些特性使CYP450酶活性受到的影響呈現(xiàn)復(fù)雜性，再加上中藥組方中幾味中藥配伍以及不同組分的作用使得CYP450的變化顯得更加復(fù)雜。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Effects of compound Chai Qin particles on enzymic activity of CYP450 in duck with aflatoxicosis

LI Yang， GAO Zhu， RONG Qian， YANG Xiao-min， ZHANG Rui， LI Ying-lun*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

An aflatoxin B1 (AFB1) poisoning model was firstly established in the present study. Ducks were divided into control group， Na2SeO3group， model group， low/medium/high-dose compound Chai Qin particles group. 7， 14， 21 d after treatment， liver tissues of ducks were taken to detect of the activities of CYP3A4， CYP1A2 and CYP2E1. Compared with model group， activities of CYP3A4， CYP1A2 and CYP2E1 in liver after 7， 14 d decreased significantly in three compound Chai Qin particles groups regardless of doses. Then， the activities of CYP3A4， CYP1A2 and CYP2E1 increased in these three groups after 21 d. But， there were no significant differences in the activities of CYP3A4， CYP1A2 and CYP2E1 among model group and compound Chai Qin particles groups. It was suggested that compound Chai Qin particles could effectively decrease activities of CYP1A2， CYP2E1 and CYP3A4 in the early treatment of aflatoxicosis by decreasing the activation of AFB1， which could reduce the chemical liver injury， and the increasing activities of CYP450 after 21 d treatment with compound Chai Qin particles might be caused by the increasing demand of CYP450 to metabolize AFB1.

cytochrome CYP1A2; cytochrome CYP3A4; cytochrome CYP2E1; compound Chai Qin particles; aflatoxin B1

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.06

2015-05-27

四川省科技廳重大項(xiàng)目(201378017)

李楊(1991—)，女，內(nèi)蒙古滿洲里人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹蝎F醫(yī)與中獸藥。E-mail：liyangkimi@163.com

*通信作者，李英倫，E-mail：liyinglun01@163.com

S834；S853.23

A

1004-1524(2016)01-0033-05

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):33-37

李楊，高祝，榮茜，等. 復(fù)方柴芩顆粒對(duì)鴨黃曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(1):33-37.