白菜型油菜亞種間雜種的合成

陳紀鵬，于恩廠，廖婷婷，朱一鳴

(1. 宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院/江西省植物生長發(fā)育調控重點實驗室，江西 宜春 336000； 2. 駐馬店農(nóng)業(yè)學校，河南 駐馬店 463000)

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白菜型油菜亞種間雜種的合成

陳紀鵬，于恩廠，廖婷婷，朱一鳴

(1. 宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院/江西省植物生長發(fā)育調控重點實驗室，江西 宜春 336000； 2. 駐馬店農(nóng)業(yè)學校，河南 駐馬店 463000)

采用蕾期人工去雄與輔助授粉的方式，以白菜型油菜十月紅菜薹和黃芽白進行正反交，以較高的頻率獲得了雜種后代。雜種后代葉型、株型和花等形態(tài)均表現(xiàn)為雙親的中間型。葉片顏色比黃芽白更深，均偏向十月紅菜薹的紫紅色；植株表現(xiàn)出較強的雜種優(yōu)勢，株高大于雙親，產(chǎn)生大量的分枝，角果數(shù)遠多于雙親。雜種后代花器官發(fā)育正常，可育花粉為99%以上，且自交結實率較高。花粉母細胞減數(shù)分裂比較正常，95%的花粉母細胞在終變期所有染色體進行同源配對，形成10個二價體，減數(shù)第二次分裂中期有部分出現(xiàn)染色體落后現(xiàn)象。雜種后代極強的雜種優(yōu)勢和較好的自交結實性為進一步選育具有優(yōu)良特性的新型白菜型油菜提供了可能。

紅菜薹；黃芽白；亞種間雜交；胚培養(yǎng)

通過人工雜交與輔助授粉的方式對作物近緣種進行雜交，可以獲得具有優(yōu)良特性的相應雜交新品種，進而改良原有作物的不良特性。人們從19世紀開始就對蕓薹屬種間的雜交及其與異屬間的雜交，獲得親緣關系較近的種間雜交種[1]、屬間雜交種[2]及親緣關系甚遠的族間雜交種[3]。通過把近緣種的優(yōu)良基因轉入到蕓薹屬栽培植物中，可以對栽培種進行改良，從而創(chuàng)造出新的作物品種；也可以運用雜交的方式對植物進行改造來獲取新的植物類型[4]。雖然現(xiàn)代生物技術發(fā)展較快，可以將外源基因通過轉基因方式直接導入農(nóng)作物中對作物進行遺傳改良。但由于當前克隆技術還不夠成熟，控制數(shù)量性狀的基因獲取難度較大。所以，種間和種內雜交依然是利用近緣物種的優(yōu)良基因來改良作物品種遺傳性狀的有效途徑[5-6]。伴隨著現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術中的幼胚培養(yǎng)、子房培養(yǎng)及體細胞融合等方法在遠緣雜交中的應用日益廣泛，通過這些方法獲得了相應的雜種后代，這解決了雜交過程中存在的一些生殖隔離障礙[7-8]。當前，雜交在蕓薹屬油料作物育種中的應用相當廣泛，如通過白菜型油菜與甘藍型油菜進行雜交，解決了甘藍型油菜的晚熟性問題；通過與黃籽油菜之間的雜交已獲得了具有黃色種皮的雜種后代，進而選育出優(yōu)良性狀的甘藍型油菜后代[9-10]。

白菜型油菜(Brassicacampestris， AA， 2n=20)是十字花科蕓薹屬小白菜的一個變種，它是蕓薹屬中重要的油料栽培作物，并且分布較為廣泛。其中，白菜型油菜的優(yōu)良性狀有：分枝性強、耐貧瘠、抗寒性強且生育期短等[11]。紅菜薹(B.campestrisL. ssp. Chinenses var. purpurea Bialey， 2n=20)是十字花科蕓薹屬蕓薹種的菜薹變種，又稱紫菜薹、紅油菜薹，是原產(chǎn)于中國的富有營養(yǎng)價值的蔬菜，備受人們喜愛，其中主要以武漢、長沙、成都3個地區(qū)種植最早[12]。十月紅是由紅菜薹品種胭脂紅通過天然雜交產(chǎn)生的后代中選育出來的具有穩(wěn)定遺傳性狀的晚熟品種。

目前，國內很多學者對紅菜薹的研究集中在傳統(tǒng)的品種選育[13]與雄性不育的利用[14-18]等方面，也進行了甘藍型油菜與紅菜薹的雜種后代的遺傳分析[19]。因為紅菜薹屬于異化授粉植物，花器官較小，不便于單花授粉結實，所以表現(xiàn)出較強的雜種優(yōu)勢。伴隨雜交育種工作大量進行，紅菜薹雜交種的推廣較為廣泛。所以一些優(yōu)良的品種種質資源也將面臨丟失或已經(jīng)丟失，迫切需要對其種質資源進行收集、保護及研究?；谀戏桨撞诵陀筒舜蠖嗍亲越徊挥H和性的類型，本項試驗通過人工去雄、輔助授粉的方法將紅菜薹與黃芽白進行正反交，研究雜交親和性，并對其雜種后代進行遺傳分析，一方面可以解決白菜型油菜自交不親和或親和力低的問題，另一方面擴充了紅菜薹的遺傳基礎，進而為選育出其他新品種提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料白菜型油菜十月紅菜薹與黃芽白作親本進行正反交。十月紅菜薹是在天然雜交后代中選育出的常規(guī)品種，長勢好，莖葉呈紫紅色，可食用部分味微甜，具有較強的耐旱和耐漬性，抗病毒病和霜霉病。黃芽白(B.campestrisssp. pekinensis)是十字花科白菜型油菜的白菜亞種，在全國范圍內廣泛種植。為了滿足上述材料的生長發(fā)育特性，選擇在10月上旬的適宜天氣分別播種于田間。第二年春季進行雜交，進行胚培養(yǎng)或直接收取成熟種子。將雜交種子種植用于雜種形態(tài)學觀察和花粉育性觀察，并進行花粉母細胞減數(shù)分裂觀察。

1.2 方法

1.2.1 亞種間雜交在雜交前1 d對父本進行套袋處理。在母本盛花期時選擇晴天上午，用經(jīng)酒精處理過的鑷子把母本的雄蕊剝除干凈徹底，并套上紙袋。次日上午，在已套袋的父本上選擇剛剛開放的新鮮花粉均勻地涂于相應的雜交母本柱頭上。授粉完全后，再將紙袋套上防止相互串粉。授粉7 d左右，將紙袋摘掉，以便植株更好地生長。授粉15～20 d 時取部分膨大的角果進行胚培養(yǎng)，剩余角果成熟后收獲種子。每10朵花為一個重復，重復3次。計數(shù)每一雜交組合所獲得的結角數(shù)、飽滿種子數(shù)及出芽率，并采用Excel 2007進行單因素方差分析比較正反交之間的差異。

1.2.2 胚培養(yǎng)授粉15～20 d時，從母本植株上取下人工授粉后膨大的角果。將取下的角果放在裝有75%酒精的燒杯中處理2～3 min后取出，再放入0.1%升汞溶液中處理15 min，對角果進行表面消毒。將角果從升汞中取出用蒸餾水漂洗3遍，洗凈殘留在角果表面的有毒物質。在無菌操作臺上用已消好毒的鑷子、刀片輕輕地剝開角果，再將幼胚從胚珠中取出并接種于MS培養(yǎng)基表面，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

待幼胚長出芽后，將幼芽轉接在MS+0.25 mg·L-1NAA+1.5 mg·L-16-BA培養(yǎng)基上進行快速繁殖。得到足夠的新幼芽后轉入不加激素的MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；待幼芽生出較多根時即可將組培苗從培養(yǎng)基中取出移栽至田間。

1.2.3 花粉育性觀察選擇上午氣溫較高的晴好天氣、花粉活力最強的時候分別在每個待檢測的植株上各取5朵花，取下其花藥并用鑷子將花藥擠破使花粉散發(fā)出來，并把花藥壁殘片去除。用膠頭滴管滴加少量1%醋酸洋紅染色液，并把蓋玻片輕輕蓋上。顯微鏡10倍物鏡下觀察其花粉形態(tài)和顏色，其中，可育花粉的形狀是大而圓且被染成紅色，不育花粉的形狀是小而癟著色淺或不著色。

1.2.4 細胞遺傳學觀察有絲分裂觀察：于雜種植株現(xiàn)蕾初期取下其幼嫩花蕾，挑取子房，用0.1% 8-羥基喹啉溶液處理3～4 h，使其有絲分裂停留于中期。然后，將其放入卡諾固定液(無水乙醇和冰乙酸體積比為3∶1)中固定24 h以上，固定完全后轉入75%酒精中，并貯藏在-20 ℃冰箱中備用。從冰箱中挑取已固定好的子房，先置于1 mol·L-1鹽酸中，60 ℃水浴加熱后，再用卡寶品紅進行染色壓片，最后顯微鏡下觀察，并記錄其體細胞染色體的數(shù)目。

減數(shù)分裂觀察：先用卡諾固定液對盛花期取下的小花蕾進行固定，方法與子房固定相同。固定后花蕾褪色直至為白色，置于4 ℃冰箱中貯存。從冰箱中挑取已固定好的花藥放至濃度為1 mol·L-1的鹽酸中，進行60 ℃水浴加熱3 min后，取出并放入清水中，接著用卡寶品紅進行染色壓片，將壓片置于顯微鏡下觀察其花粉母細胞染色體行為。

2 結果與分析

2.1 雜交親和性觀察

紅菜薹與黃芽白進行正、反交，采用胚培養(yǎng)與直接收獲種子兩種方式均獲得雜種后代。授粉后每朵花都能形成角果，以紅菜薹為母本的正交組合每個角果形成飽滿種子數(shù)較多，平均每個角果形成6.7粒飽滿種子。僅有少數(shù)種子發(fā)育不完全，形成不飽滿種子。而反交組合每個角果平均形成3.8粒種子，也形成少量不飽滿種子。正交組合不但形成種子數(shù)量較多，而且飽滿種子發(fā)芽率也高于反交組合。而正、反交組合所形成的不飽滿種子均不能發(fā)芽。正交組合更容易獲得雜種后代，其親和指數(shù)顯著高于反交組合(F=45，P<0.05，表1)。

表1 黃芽白與十月紅菜薹雜交親和性

Table 1 Hybridization compatibility ofB.campestrisssp. pekinensis andB.campestrisL. var. purpurea

雜交組合授粉花朵數(shù)不飽滿種子數(shù)飽滿種子數(shù)種子發(fā)芽率/%雜種株數(shù)親和指數(shù)十月紅菜薹×黃芽白301020020.5411.37±0.06黃芽白×十月紅菜薹301011522.6260.87±0.12

注：親和指數(shù)=獲得雜種植株數(shù)/授粉花朵數(shù)。

2.2 胚培養(yǎng)結果

在授粉后20 d后對正交組合進行胚培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d左右幼胚開始產(chǎn)生大量白色根毛，10 d后開始生芽。80%的胚發(fā)育成苗，其余的胚發(fā)育成畸形胚不能成苗，只有極少數(shù)的幼胚死亡。與直接收種子相比，胚培養(yǎng)可提高雜種的成苗率。不論是直接收種子還是胚培養(yǎng)所獲得的植株，經(jīng)形態(tài)學和細胞學鑒定均為真雜種。

2.3 雜種的形態(tài)學及花粉育性特征

正、反交雜種后代形態(tài)極相似，幼苗期且植株葉柄及葉脈顏色與黃芽白相比較深，都偏向于十月紅菜薹的紫紅色(表2，圖1-A，B，C，D)。植株葉色較深，葉緣呈波狀且有不規(guī)則的葉裂(圖1-E)。成熟期植株表現(xiàn)出較強的雜種優(yōu)勢，植株高度均高于雙親。而且植株形成更多分枝，且分枝粗壯，基部著生。植株下部莖稈也呈現(xiàn)十月紅菜薹紫紅色。上部莖稈的紫色雖不是很明顯，但整體上顏色還是較黃芽白深。正反交組合雜種植株花器官都發(fā)育正常，花絲較長，花藥飽滿，伸到柱頭頂部。晴好天氣產(chǎn)生大量花粉，可育花粉均達到99%以上(圖1-F)。正反交雜種植株自交結實性較好，幾乎每朵花授粉后都能形成角果，每個角果都能形成較多種子。反交組合雜種在成熟期生長更加旺盛，植株分枝更多，形成更多角果。

2.4 正反交雜種的細胞學觀察

形態(tài)學鑒定結果顯示所得的雜交植株是白菜型油菜與十月紅菜薹的真雜種。雜種植株體細胞染色體數(shù)目為20，未發(fā)現(xiàn)非整倍體現(xiàn)象。在花粉母細胞減數(shù)分裂前期，所有染色體正常聯(lián)會配對，形成10個二價體，無單價體出現(xiàn)(圖1-G)。在減速第Ⅱ次中期染色體整齊地排列在赤道板上，但有少部分細胞出現(xiàn)滯后染色體(圖1-H，I)，后期Ⅱ可觀察到染色體均正常地平均分配到4個細胞中去。整個減數(shù)分裂過程表現(xiàn)比較正常，因此所形成的花粉育性很好。

表2 黃芽白與十月紅菜薹雜種的形態(tài)學特征

Table 2 Morphology of hybrids betweenB.campestrisssp. pekinensis andB.campestrisL. var. purpurea

品種及組合株高/cm第一分枝位置/cm一級分枝數(shù)每株角果數(shù)每個角果種子數(shù)黃芽白137.023.610.021411.40十月紅菜薹156.015.411.360520.10黃芽白×十月紅菜薹173.72.712.385024.32十月紅菜薹×黃芽白161.91.38.527015.52

A： 黃芽白； B： 黃芽白×十月紅菜薹； C： 十月紅菜薹×黃芽白； D： 十月紅菜薹； E： 葉片(從左至右依次是黃芽白，十月紅菜薹×黃芽白，十月紅菜薹)標尺=10 cm； F： 花粉，標尺=100 μm； G： 終變期花粉母細胞； H： 后期Ⅰ花粉母細胞； Ⅰ： 帶有落后染色體(箭頭所示)的中期Ⅱ花粉母細胞。 標尺=30 μm。圖1 黃芽白與十月紅菜薹雜種形態(tài)學及細胞遺傳學Fig.1 Morphology and cytogenetics of hybrids between B.campestris ssp. pekinensis and B.campestris L. var. purpurea

3 結論與討論

利用白菜型油菜十月紅菜薹與黃芽白分別進行正、反交試驗，采用胚培養(yǎng)與直接收獲種子兩種方式均獲相應的雜交種子。從雜交結實的情況來看，以十月紅菜薹為母本的正交組合獲得雜交后代飽滿種子數(shù)較多，相對較容易些；而以黃芽白為母本的反交組合獲得雜交后代飽滿種子數(shù)較少，相對較難些。在蕓薹屬其他雜交中也發(fā)現(xiàn)有類似的現(xiàn)象[20-22]，發(fā)現(xiàn)在遠緣雜交過程中具有單向不親和性的特點，同一雜交組合染色體數(shù)目不同的親本進行正反交，一般選用數(shù)目多的為母本[23]。本試驗選擇黃芽白和十月紅菜薹兩個親本雖然染色體數(shù)相同，但正反交難易程度卻有所不同。

通過對本次試驗正反交獲得的雜交后代群進行花粉可染性、形態(tài)學與細胞學觀察。正反交雜種(AA，2n=20)在形態(tài)上很相似，生長旺盛，表現(xiàn)出極強的雜種優(yōu)勢。當前春油菜區(qū)種植的白菜型油菜多是普通品種，所以利用白菜型油菜的雜種優(yōu)勢來選育出新的油菜品種對改善一些高原地區(qū)現(xiàn)有的油菜種植現(xiàn)狀具有實際意義。Meng等[24]研究顯示，獲得白菜型油菜A基因的新型甘藍型油菜比親本甘藍型油菜更表現(xiàn)出亞基因間雜種優(yōu)勢。本試驗通過對十月紅菜薹與黃芽白進行正、反交獲得的新油菜品種表現(xiàn)出較強的亞基因間雜種優(yōu)勢。這不僅可以改良現(xiàn)有品種的不足，而且對后期油菜的選育工作提供了新的種質資源。

隨著育種實踐工作的深入發(fā)展，現(xiàn)代生物技術的發(fā)展也趨于成熟，可以采用不同方法來克服蕓薹屬遠緣雜交過程中存在的雜交不親和現(xiàn)狀。利用體細胞融合的方法避免了有性雜交的障礙，同時擴大了雜交親本的選取范圍。胚培養(yǎng)、胚搶救、子房培養(yǎng)[25]等組織培養(yǎng)技術不僅克服了蕓薹屬遠緣雜交的不親和，將不同種屬間的優(yōu)良基因進行轉移，從而獲得優(yōu)良品種，而且還可減少雜種后代穩(wěn)定的育種年限。本項研究通過雜交和收獲種子的方法獲得了雜種后代，可見，十月紅菜薹與黃芽白之間雜交親和性較好，可以不借助胚培養(yǎng)方法較容易地獲得雜種后代。

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(責任編輯 張 韻)

Production of intersubspecific hybrids of Brassica campestris

CHEN Ji-peng1， YU En-chang2， LIAO Ting-ting1， ZHU Yi-ming1(1.CollegeofLifeScienceandEnvironmentandResource/JiangxiProvinceKeyLaboratoryofPlantGrowthandRegulation，YichunUniversity，Yichun336000，China; 2.AgriculturalSchoolofZhumadian，Zhumadian463000，China)

By artificial pollination and supplementary pollination in bud stage， hybrids were obtained through reciprocal cross ofBrassicacampestrisL. ssp. Chinenses var. purpurea Bialey andB.campestrisssp. pekinensis in high frequency. Leaf， plant type and flower morphology of hybrids were characterized by intermediate type of their parents. The leaf color of hybrid was darker thanB.campestrisssp. pekinensis， more closer to purple color ofBrassicacampestrisL. ssp. Chinenses var. purpurea Bialey. The hybrids showed high heterosis for higher plant height， more branches and more pods than the parents， and they had a good seed setting via cross by themselves because of mature flowers which could produce more than 99% fertile pollens. It also indicated that the female gemmates were fertile in the hybrids. All of the chromosomes paired to 10 bivalents at diakinesis in 95% pollen mother cells. A few of lagged chromosomes were observed at metaphase Ⅱ. The hybrids with heterosis and good seed setting was useful for breeding new type ofBrassicacampestris.

B.campestrisL. var. purpurea;B.campestrisvar. pekinensis; hybridization; embryo culture

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.02

2015-06-24

國家自然科學基金項目(31460357)；江西省科技支撐項目(20141BBF60010)；江西省自然科學基金(20151BAB204026)

陳紀鵬(1974—)，男，河南西平人，博士，副教授，主要從事油菜遠緣雜交和細胞遺傳學研究。E-mail：chensi20020606@163.com

S565.4

A

1004-1524(2016)01-0009-06

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):9-14

陳紀鵬，于恩廠，廖婷婷，等. 白菜型油菜亞種間雜種的合成[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28(1)：9-14.