金雀異黃素對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

王玲　劉輝國

摘要：目的 觀察金雀異黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，探討其改善肺纖維化的作用機(jī)制。方法 CCK-8法檢測(cè)不同濃度GEN和/或TGF-β1干預(yù)細(xì)胞72 h后的活性；RT-PCR檢測(cè)上皮及間質(zhì)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)變以及在轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子；Western blot檢測(cè)p38及JNK信號(hào)通路的變化。結(jié)果 TGF-β1連續(xù)刺激A549細(xì)胞72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型，表現(xiàn)出更多間質(zhì)標(biāo)記物升高，內(nèi)皮標(biāo)記物降低；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，金雀異黃素可呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，金雀異黃素與TGF-β1協(xié)同刺激A549細(xì)胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平。結(jié)論 金雀異黃素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT而發(fā)揮抗纖維化的作用。

關(guān)鍵詞：金雀異黃素；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；A549；肺纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.015

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）10-0063-04

Abstract： Objective To investigate the effects of genistein on the epithelium-mesenchyme transition of alveolar type II cells； To discuss its mechanism of improving pulmonary fibrosis. Methods The activity of genistein with different concentrations and TGF-β1 intervention cells after 72 h were determined by CCK-8 method； epithelial and mesenchymal markers as well as the key regulatory factors in the transformation process were determined by RT-PCR； changes of p38 and JNK signaling pathways were determined by Western blot. Results The A549 cells were transformed into fibroblast phenotype stimulated by TGF-β1 for 72 h； mesenchymal markers increased and endothelial marker decreased. The results of RT-PCR indicated that genistein inhibited this phenomenon in a concentration-dependent manner. The results of Western blot showed that， genistein possibly inhibited the epithelial-mesenchymal transition through inhibiting the phosphorylation of p38 and JNK signaling pathways and its downstream transcription factors. Conclusion Genistein has anti-fibrosis effects through inhibiting A549 cells undergoing epithelial-mesenchymal transition.

Key words： genistein； epithelial-mesenchymal transition； A549； pulmonary fibrosis； TGF-β1

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種以進(jìn)行性肺纖維化為主要臨床特點(diǎn)的疾病，其主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的大量聚集，破壞肺泡結(jié)構(gòu)導(dǎo)致肺功能下降最終導(dǎo)致死亡。有研究表明，從IPF患者中分離出的成纖維細(xì)胞具有異質(zhì)性，多種細(xì)胞如骨髓和肺泡上皮細(xì)胞在條件刺激下可轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞[1-2]。其中肺泡上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）刺激下發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而形成的成纖維細(xì)胞在IPF中占據(jù)一定比例，對(duì)肺纖維化的進(jìn)展發(fā)揮重要作用，抑制EMT可顯著改善肺纖維化，繼而改善肺功能，但目前臨床尚缺乏特異性的抗纖維化治療藥物。

金雀異黃素（genistein，GEN）是一種存在于豆科植物和齒狀植物中的天然異黃酮化合物，體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[3]。張氏等[4]研究顯示，GEN具有抑制大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的作用；顧氏等[5]研究顯示，GEN對(duì)D-半乳糖損傷的乳鼠皮膚細(xì)胞成纖維細(xì)胞增殖亦具有抑制作用。但GEN是否影響肺纖維化中成纖維細(xì)胞的增殖以及EMT現(xiàn)象尚未見研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察GEN對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在TGF-β1誘導(dǎo)下發(fā)生EMT的影響，探討其改善肺纖維化的作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床治療肺纖維化提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物和細(xì)胞

GEN，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度≥98%，貨號(hào)446-72-0。A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)刺激均在獨(dú)立的細(xì)胞房中進(jìn)行，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長達(dá)次融合狀態(tài)時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要接種于不同的培養(yǎng)皿中。分組誘導(dǎo)前以無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，減少血清對(duì)刺激因素的影響，同時(shí)饑餓處理可使細(xì)胞同步化。

1.2 主要試劑與儀器

高糖DMEM basic（1×）培養(yǎng)基、新生小牛血清（NBS）、胰酶，Gibco；TGF-β1，PEPROTECH公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；RT-PCR試劑盒，Roche；p-p38 MAPK、P38、p-JNK、JNK、GAPDH，Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)Synergy HT，美國BioTek公司；恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；紫外分光光度計(jì)NANODROP 2000c，Thermo scientific；RT反轉(zhuǎn)錄儀器Veriti 96 well Thermal Lycler，Applied Biosystems公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀Light Lycler 480，Roche公司；倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞處理和分組

待A549細(xì)胞貼壁融合達(dá)60%～70%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，加入饑餓液，置于溫箱4 h后置換為含TGF-β1（10 ng/mL）饑餓液（DMEM+0.2%NBS），重新置于溫箱中培養(yǎng)，24 h換液1次，72 h后取出蛋白質(zhì)和RNA樣本。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+GEN 1 μmol/L組、TGF-β1+GEN 5 μmol/L組、TGF-β1+GEN 10 μmol/L組和GEN 10 μmol/L組。

2.2 CCK-8法檢測(cè)

細(xì)胞被接種至96孔板中，每孔100 μL，接種密度大約在2×105個(gè)/mL，置于溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，采用不同處理因素干預(yù)72 h后，將96孔板培養(yǎng)基換為含有10 μL CCK-8的無血清培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)在溫箱中孵育2～2.5 h后于酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行操作。

2.3 Western blot檢測(cè)

冰上裂解細(xì)胞10 min，置于1.5 mL離心管，超聲裂解儀5 kHz裂解10～15 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液移至新的離心管，采用BCA定量法檢測(cè)蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)整一致后置于煮沸儀上將其變性。每組樣本混勻后取10 μL行10% SDS-PAGE凝膠電泳，檢測(cè)內(nèi)參指標(biāo)GAPDH，根據(jù)各個(gè)樣本的光密度（OD）值調(diào)整上樣劑量，使用調(diào)整后的上樣劑量再行凝膠電泳，使其GAPDH的OD值保持一致，后每組以校正后的上樣劑量進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白以100 V、90 min移至PVDF膜，用一抗封閉液（1.5 g牛血清白蛋白溶解于50 mL TBST中）封閉12 h，一抗包括p-p38、p38、p-JNK、JNK，然后用TBST（1 L TBS溶液+1 mL Tween20）洗膜3次，將其放入對(duì)應(yīng)的加有二抗的二抗稀釋液（脫脂奶粉溶解于TBST緩沖液中配成2%～5%的液體）中避光孵育1 h，二抗為Alexa Fluor? 488 goat anti- Rabbit IgG，再用TBST洗滌3次，檢測(cè)目的條帶，應(yīng)用Odyssey圖像分析軟件檢測(cè)各組蛋白的OD值。

2.4 RT-PCR檢測(cè)

細(xì)胞以不同因素處理后，棄去培養(yǎng)基，以Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定其含量與純度。根據(jù)樣本所測(cè)濃度，取適當(dāng)劑量將各個(gè)樣本濃度調(diào)整一致后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃、2 min；1個(gè)循環(huán)，94 ℃、40 ；25～35個(gè)循環(huán)；50 ℃～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，1個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析并進(jìn)行齊性檢驗(yàn)，組間兩兩均數(shù)比較方差齊采用SNK法，方差不齊采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 金雀異黃素對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

GEN干預(yù)72 h后，與對(duì)照組比較，GEN組、GEN和TGF-β1的混合液組A549細(xì)胞不同濃度細(xì)胞的活性均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

4.2 金雀異黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

與TGF-β1組比較，GEN組與TGF-β1協(xié)同刺激A549細(xì)胞72 h可抑制間質(zhì)標(biāo)記物CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin的基因表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的基因表達(dá)，呈濃度依賴性，見表3。對(duì)照組鏡下細(xì)胞連接緊密，相互黏附性較強(qiáng)，表現(xiàn)為鋪路石樣；TGF-β1刺激72 h后細(xì)胞間緊密連接消失，間隙變大，形態(tài)轉(zhuǎn)化為狹長形、紡錘形；TGF-β1與GEN（10 μmol/L）共同刺激72 h后，細(xì)胞形態(tài)又重新保持上皮細(xì)胞特有的形狀；單用GEN（10 μmol/L）刺激72 h細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組形態(tài)相似。見圖1。

4.3 金雀異黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞p38、JNK信號(hào)通路磷酸化水平的影響

GEN與TGF-β1協(xié)同刺激A549細(xì)胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平。

4.4 金雀異黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子snail1、snail2、twist1、twist2基因表達(dá)的影響

TGF-β1干預(yù)A549細(xì)胞24 h，snail1、snail2、twist1、twist2基因表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P<0.01）；GEN與TGF-β1協(xié)同作用則可顯著下調(diào)上述4種轉(zhuǎn)錄因子（P<0.01）；GEN組對(duì)以上信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子則無明顯影響（P>0.05）。

5 討論

肺泡上皮細(xì)胞通過EMT機(jī)制轉(zhuǎn)化而來的成纖維細(xì)胞在肺纖維化中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1連續(xù)刺激A549細(xì)胞72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型，表現(xiàn)出更多的間質(zhì)標(biāo)記物升高，而上皮標(biāo)記物降低。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，GEN可呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，GEN與TGF-β1協(xié)同刺激A549細(xì)胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平。以上結(jié)果均提示GEN可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生EMT而發(fā)揮抗纖維化的作用。

近年來，隨著對(duì)人體器官纖維化研究的逐步深入，上皮細(xì)胞在某些病理情況發(fā)生的EMT現(xiàn)象也逐漸得到研究者的關(guān)注。上皮細(xì)胞在病理因素如TGF-β1的長期慢性刺激下可以失去其原有的極性，細(xì)胞間的緊密連接逐漸消失，最終獲得一定的遷移和游走能力，具有間質(zhì)細(xì)胞的表型，對(duì)肺纖維化起到一定的促進(jìn)作用，抑制EMT則可顯著改善肺功能[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1（10 ng/mL）連續(xù)刺激A549細(xì)胞72 h后，細(xì)胞形態(tài)由連接緊湊的鋪路石樣轉(zhuǎn)化為松散狹長的成纖維細(xì)胞形狀。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，間質(zhì)標(biāo)記物CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin表達(dá)均上調(diào)，而上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)則下調(diào)，由此可以判斷TGF-β1可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT，而TGF-β1與GEN同時(shí)干預(yù)A549細(xì)胞72 h則可呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)EMT，上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)記物，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物。

無論是永生化的大鼠肺泡型上皮細(xì)胞；還是從大鼠分離、培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，以及人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞均可通過TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EMT，出現(xiàn)成肌纖維細(xì)胞的表型[7]。TGF-β1在肺纖維化EMT過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本研究檢測(cè)了p38及JNK信號(hào)通路以及其下游的靶分子的表達(dá)，包括snail1、snail2、twist1、twist2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激A549細(xì)胞24 h可顯著升高p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平，其下游靶分子snail1、snail2、twist1、twist2表達(dá)均上調(diào)，而TGF-β1與GEN聯(lián)合作用時(shí)，則可顯著降低p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此，我們認(rèn)為GEN可能通過抑制p38及JNK信號(hào)通路以及其下游的靶分子的表達(dá)抑制A549細(xì)胞發(fā)生EMT。

本研究結(jié)果表明，GEN可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生EMT，為GEN的大體研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但本研究未能闡明其具體的作用機(jī)制，這有待于進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

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（收稿日期：2016-02-23；編輯：華強(qiáng)）