石墨烯量子點熒光探針測定腎上腺色腙

馬紅燕,王艷妮

（延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院陜西省反應(yīng)工程重點實驗室，陜西延安 716000）

石墨烯量子點熒光探針測定腎上腺色腙

馬紅燕*,王艷妮

（延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院陜西省反應(yīng)工程重點實驗室，陜西延安 716000）

通過高溫裂解檸檬酸合成了水溶性石墨烯量子點（GQDs），并應(yīng)用鈍化劑PEG2000進(jìn)行修飾，提高了GQDs的量子產(chǎn)率。應(yīng)用熒光光譜、紫外-可見光譜、紅外光譜對其發(fā)光特性進(jìn)行了研究，測定了熒光壽命。實驗發(fā)現(xiàn)，在PH＝7.40的Tris-HCl緩沖液中，腎上腺色腙（CBZC）對GQDs熒光強(qiáng)度有明顯的猝滅作用。基于此提出了以GQDs為探針測定腎上腺色腙的新方法。實驗考察了緩沖溶液用量、緩沖溶液種類、量子點濃度、反應(yīng)時間以及表面活性劑等多種因素對反應(yīng)體系的影響。當(dāng)量子點濃度為2.3×10-3mol/L時，腎上腺色腙濃度在4.0×10-7～1.2×10-5mol/L（0.995 6）范圍內(nèi)與熒光猝滅值ΔF呈良好的線性關(guān)系，方法檢出限為1.5×10-7mol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%（n＝5，c＝4.0×10-6mol/L）。該方法對于樣品中腎上腺色腙含量測定的回收率為97.46%～101.6%。通過測定溫度對猝滅常數(shù)的影響以及紫外-可見吸收光譜的變化確定了二者的猝滅過程和相互作用力類型。

石墨烯量子點（GQDs）;熒光探針;腎上腺色腙（CBZC）;檸檬酸

1　引 言

近年來，碳納米發(fā)光材料的低毒性和強(qiáng)熒光性質(zhì)受到了越來越密切的關(guān)注[1-2]。石墨烯量子點作為碳量子點的一種，一般尺寸小于10 nm，因此比一維的石墨烯量子帶和二維的石墨烯量子片表現(xiàn)出更強(qiáng)的量子限域效應(yīng)和邊界效應(yīng)[3]，在生物、醫(yī)藥和材料等方面展現(xiàn)出更加誘人的應(yīng)用前景[4-5]。石墨烯量子點的合成方法研究頗多，如電化學(xué)氧化法[6]、機(jī)械剝離法、氧化石墨還原法、化學(xué)氣相沉淀法、電弧法[7]、有機(jī)合成等。目前量子點在金屬離子的識別和檢測領(lǐng)域研究較多，但在藥物分子分析領(lǐng)域的研究還很少。

腎上腺色腙又稱安絡(luò)血或卡巴克絡(luò)（Carbazochrome，CBZC），臨床主要用于腦、肺、腎、腸毛細(xì)管損傷出血及血小板減少癥狀[8]。目前腎上腺色腙的測定方法主要有近紅外光譜法[9]、分光光度法[10]、高效液相色譜法[11]、化學(xué)發(fā)光法[12]及熒光分析方法[13]等。

本文采用自上而下的方法高溫裂解檸檬酸合成了具有優(yōu)良熒光特性的GQDs，并對其進(jìn)行修飾，發(fā)現(xiàn)GQDs發(fā)出很強(qiáng)的藍(lán)色熒光。腎上腺色腙對GQDs熒光強(qiáng)度有明顯的猝滅作用，據(jù)此建立了一種測定腎上腺色腙的新方法，并對其作用機(jī)理進(jìn)行了研究。

2　實 驗

2.1儀器及試劑

2.1.1儀器

F-4500型熒光分光光度計（日本日立公司）; 8453型紫外-可見分光光度計（美國安捷倫公司）;FLSP920瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀（英國愛丁堡公司）;IR Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀（日本Shimaozu公司）。

2.1.2試劑

濃度為1.0×10-3mol/L CBZC標(biāo)準(zhǔn)溶液;濃度為10 mg/mL的NaOH溶液;Tris-HCl緩沖液（PH＝7.40）;檸檬酸。所用試劑均為分析純，水為UP超純水。

CBZC標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取腎上腺色腙標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）0.023 6 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，放置冰箱中待用。

2.2實驗方法

2.2.1GQDs的合成

在文獻(xiàn)[1]的基礎(chǔ)上，另外引入了PEG進(jìn)行修飾，采用自上而下的方法裂解檸檬酸合成GQDs。具體方法為:準(zhǔn)確稱取1.000 0 g檸檬酸和0.500 0 g PEG2000放入小燒杯中，用電熱套直接加熱，檸檬酸開始裂解。5 min后，檸檬酸熔解為無色液體;繼續(xù)加熱，溶液由無色變?yōu)榱咙S色。將溶液轉(zhuǎn)移到30.00 mL的NaOH溶液中（10 mg/ mL），連續(xù)攪拌，反應(yīng)完全后轉(zhuǎn)移、稀釋至250 mL容量瓶中，放置在冰箱里待用。GQDs的濃度以檸檬酸的量計算。該合成方法具有簡單、快速的優(yōu)點。

2.2.2熒光光譜圖的測定

移取3.00 mL GQDs于25 mL比色管中，加入3.00 mLTris-HCl緩沖溶液，再加入適量腎上腺色腙溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。室溫下反應(yīng)20 min后，于F-4500型熒光分光光度計測定熒光光譜圖，測定體系熒光強(qiáng)度（F）和試劑空白（F0），計算ΔF和CBZC濃度之間的關(guān)系。激發(fā)波長和發(fā)射波長為λex/λem＝367/462 nm，狹縫寬度均為5 nm。

3　結(jié)果與討論

3.1GQDs的特性

3.1.1GQDs的熒光光譜、紫外-可見吸收光譜和熒光壽命

圖1為GQDs的熒光光譜和紫外-可見吸收譜。從圖中可看出修飾前后量子點的最大吸收波長并無變化。在462 nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰，與文獻(xiàn)報道的GQDs的熒光特性也相吻合;但修飾后的量子點熒光強(qiáng)度明顯增大，熒光量子產(chǎn)率增加，且發(fā)射峰的半峰寬較窄，說明該量子點單一、均勻。

圖1　GQDs的熒光光譜和紫外-可見吸收光譜Fig.1　Fluorescence spectra and UV-Vis absorPtion of GQDs

我們于FLSP920瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀上測定了該GQDs的熒光衰減曲線，擬合結(jié)果如圖2所示。根據(jù)加權(quán)平均計算法[14]，得出GQDs的熒光壽命為1.87 ns，熒光壽命較短，據(jù)推測可能是激子（電子與空穴對）的重組合發(fā)光[15]。χ2接近于1，說明實驗數(shù)據(jù)在可信范圍內(nèi)。

圖2　GQDs的熒光衰減曲線Fig.2　Flourescence decaY curves of GQDs

3.1.2GQDs的結(jié)構(gòu)表征

量子點的光致發(fā)光是其非常重要的特性之一。量子點具有寬而連續(xù)的激發(fā)譜，可實現(xiàn)一元激發(fā)和多元激發(fā)，為實現(xiàn)生物分子的多組分同時檢測提供了可能。目前很多實驗發(fā)現(xiàn)，量子點的發(fā)射峰強(qiáng)度和位置與激發(fā)波長有關(guān)。本實驗于F-4500型熒光分光光度計上檢測不同激發(fā)波長下的GQDs熒光強(qiáng)度，所有測試均在298 K下進(jìn)行。改變激發(fā)波長，發(fā)射峰位置和強(qiáng)度也隨之發(fā)生變化，如圖3所示。當(dāng)激發(fā)波長由340 nm增加到400 nm時，發(fā)射波長由444 nm紅移至488 nm，同時熒光強(qiáng)度先增大后減小。當(dāng)激發(fā)波長為367 nm時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。

圖3　GQDs在不同激發(fā)波長下的熒光光譜Fig.3　Fluorescence spectra of GQDs with different excitation wavelengths

圖4為GQDs的紅外光譜圖:1 399 cm-1和1 578 cm-1處檢測到有強(qiáng)的吸收峰，分別為—COO-的對稱伸縮振動和反對稱伸縮振動; 1 725 cm-1為—C＝O的特征吸收峰;2 914 cm-1附近有兩個強(qiáng)度很弱的雙峰，可能為C—H的對稱與反對稱伸縮振動吸收峰;3 433 cm-1為—OH的伸縮振動峰。根據(jù)分析得知該量子點含有羧基和羥基，所以有很好的親水性[16]。

圖4　GQDs的傅里葉變換紅外光譜Fig.4　FTIR spectra of GQDs

3.1.3不同酸度對量子點熒光強(qiáng)度的影響

溶液的酸度對量子點的發(fā)光強(qiáng)度有一定影響，因此，本實驗研究了GQDs在不同酸度下的熒光強(qiáng)度及穩(wěn)定性。在酸性介質(zhì)中，其熒光強(qiáng)度小;在中性和堿性條件下，GQDs的熒光強(qiáng)度明顯增大，且不隨PH的變化而變化，表明GQDs在中性和堿性條件下熒光穩(wěn)定。

3.2腎上腺色腙的測定

3.2.1熒光光譜圖

室溫下，固定激發(fā)和發(fā)射波長，掃描體系的熒光光譜圖，結(jié)果如圖5所示。由圖可知，腎上腺色腙對GQDs有明顯的熒光猝滅作用，且GQDs的熒光強(qiáng)度隨著腎上腺色腙濃度的增加有規(guī)律地下降，說明腎上腺色腙和量子點發(fā)生了相互作用。

3.2.2緩沖溶液PH、種類及用量的選擇

不同PH對體系ΔF值的影響不同。實驗考察了不同PH對體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，PH＝7.40時，體系的ΔF值最大。同時考察了同一PH值下Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-HCl、B-R、檸檬酸-Na2HPO4和NaOH-KH2PO4等緩沖溶液對體系熒光強(qiáng)度的影響。當(dāng)緩沖溶液為Tris-HCl時，腎上腺色腙對GQDs體系的猝滅作用最強(qiáng)，其適宜用量為3.00 mL。所以本實驗選擇3.00 mL的Tris-HCl緩沖溶液來調(diào)節(jié)體系酸度。

圖5　GQDs-CBZC體系的熒光光譜Fig.5　Fluorescence spectra of GQDs-CBZC sYstem

3.2.3GQDs濃度的選擇

量子點的濃度直接影響著體系的靈敏度和線性范圍。我們試驗了不同用量的量子點對體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)量子點用量為3.00 mL時，體系的猝滅程度最大。實驗選擇加入3.00 mL的量子點，其濃度為2.3×10-3mol/L。

3.2.4增敏劑對體系的影響

試驗了一系列的金屬離子和納米粒子對腎上腺色腙猝滅量子點的熒光強(qiáng)度的協(xié)同作用。如Cu2＋、Ba2＋、Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、Zn2＋、AgNP和AuNP，結(jié)果均無明顯影響。表面活性劑對體系有強(qiáng)的增敏、增溶、增穩(wěn)作用，因此實驗研究了十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）、吐溫80（Tween-80）、溴化十六烷基三甲基銨（CTMAB）、β-環(huán)糊精（β-CD）等對體系猝滅程度的影響。結(jié)果表明，上述幾種表面活性劑和β-環(huán)糊精對體系ΔF值均無增敏作用。所以，本實驗選擇不加入任何增敏劑。

3.2.5反應(yīng)時間及試劑加入順序的影響

配制好溶液，每隔10 min測定一次熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，腎上腺色腙對GQDs的猝滅程度在反應(yīng)20 min后最大，且熒光強(qiáng)度在4 h內(nèi)基本穩(wěn)定。試劑加入順序?qū)w系熒光強(qiáng)度幾乎沒有影響。

3.2.6共存物質(zhì)干擾

在選定的實驗條件下，當(dāng)腎上腺色腙濃度為4.0×10-6mol/L時，以相對誤差不超過±5%為限，1 000倍的葡萄糖、果糖、蔗糖，500倍的Ca2＋、K＋、Sr2＋、Ba2＋，100倍的Cu2＋、Al3＋、Zn2＋，5倍的Fe3＋不干擾測定。

3.2.7檢出限和線性范圍

在優(yōu)化的實驗條件下，腎上腺色腙溶液在4.0×10-7～1.2×10-5mol/L濃度范圍內(nèi)與ΔF呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔF＝2.5× 107c（mol/L）＋10.3，相關(guān)系數(shù)為0.995 6。對濃度為4.0×10-6mol/L的腎上腺色腙溶液平行測定5次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%。根據(jù)IUPAC建議計算，方法檢出限為1.5×10-7mol/L。

3.2.8樣品分析

隨機(jī)抽取同一批號的腎上腺色腙片劑20片，準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量，研磨，稱取適量粉末（相當(dāng)于0.023 6 g腎上腺色腙），用蒸餾水溶解并超聲5 min后定容于100 mL容量瓶中，搖勻，靜置10 min，干過濾，棄去初濾液，移取一定量后續(xù)過濾溶液，按照實驗方法測定，同時進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表1。

表1　樣品測定及回收率實驗（n＝5）Tab.1 Determination results of carbazochrome in samPles and recoverY of the method（n＝5）

3.3機(jī)理討論

在熒光發(fā)射過程中，熒光試劑在不同的溶劑中通過和其他物質(zhì)的分子、離子碰撞導(dǎo)致熒光強(qiáng)度會迅速減弱以致完全失去熒光，稱為熒光猝滅。導(dǎo)致熒光猝滅的因素很多，主要包括激發(fā)態(tài)反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、生成配合物和碰撞猝滅等[17]。碰撞猝滅又稱為動態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是由于生成配合物而引起的熒光猝滅。本實驗通過溫度對猝滅常數(shù)的影響和紫外-可見吸收光譜的變化來探討腎上腺色腙和量子點之間的作用機(jī)理。

3.3.1紫外-可見吸收光譜

靜態(tài)猝滅是猝滅劑與基態(tài)熒光分子形成無熒光或弱熒光的配合物，從而改變熒光物質(zhì)的吸收光譜。固定量子點和腎上腺色腙溶液的濃度，以緩沖溶液為參比，分別做GQDs、CBZC、GQDs＋CBZC的紫外-可見吸收光譜，如圖6所示。從圖中得知，腎上腺色腙在353 nm處有最大吸收，GQDs加入后，最大吸收波長未發(fā)生變化，吸光度明顯增大。但通過比較發(fā)現(xiàn)，GQDs＋CBZC體系的吸光度是GQDs和CBZC二者的吸光強(qiáng)度之和，說明腎上腺色腙和量子點沒有生成配合物，由此證明腎上腺色腙對量子點的熒光猝滅機(jī)理可能為動態(tài)猝滅。

圖6　GQDs、CBZC、GQDs＋CBZC的紫外-可見吸收光譜。Fig.6　Ultraviolet-visible absorPtion spectra of GQDs，CBZC and GQDs＋CBZC，resPectivelY.CCBZC＝4.0×10-6mol/L.

3.3.2溫度對猝滅常數(shù)的影響

動態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光試劑的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生相互作用的過程。隨著溫度的升高，分子之間的有效碰撞增加，電子轉(zhuǎn)移過程加劇，這種變化遵守Stern-Volmer方程[18]:F0/F＝1＋Kqτ0[Q]＝ 1＋KSV[Q]。其中，F(xiàn)0和F分別為無猝滅劑和有猝滅劑時的熒光強(qiáng)度，τ0是不存在猝滅劑時的熒光分子的平均熒光壽命，KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，[Q]為猝滅劑的濃度，Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)。

依據(jù)Stern-Volmer方程，對F0/F和[Q]進(jìn)行線性回歸，所得直線的斜率為KSV。如圖7所示，在293 K和313 K條件下，腎上腺色腙的[Q]和F0/F線性關(guān)系良好，說明只存在一種猝滅方式，靜態(tài)猝滅或動態(tài)猝滅。通過比較，隨著溫度的升高KSV逐漸增大，說明腎上腺色腙與GQDs是以動態(tài)猝滅的方式發(fā)生相互作用的。

圖7　腎上腺色腙對GQDs熒光猝滅的Stern-Volmer曲線Fig.7　Stern-Volmer Plot of GQDs quenched by CBZC

3.3.3結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型

以lg[（F0-F）/F]對lg[Q]作圖，直線的斜率為結(jié)合位點數(shù)n，截距為lgKA。由表2數(shù)據(jù)可知，量子點和腎上腺色腙的結(jié)合位點數(shù)n≈1，結(jié)合常數(shù)KA均比較大，說明二者具有較強(qiáng)的結(jié)合作用。KA也隨著溫度的升高而增大，表明腎上腺色腙對量子點的猝滅為動態(tài)猝滅。

表2　腎上腺色腙和GQDs的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Binding constants，number of binding sites and thermodYnamics Parameters of GQDs-CBZC

利用Vant'Hoff方程可以計算出熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔH、熵變ΔS、吉布斯自由能ΔG:根據(jù)公式計算得出各熱力學(xué)參數(shù)，如表2所示。ΔG＜0，表明該反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行;而在腎上腺色腙和量子點結(jié)合的過程中，ΔH＞0，ΔS＞0，表明腎上腺色腙和量子點之間的作用力為疏水作用力，原因可能為腎上腺色腙表面的羥基和量子點表面的羧基發(fā)生脫水而產(chǎn)生的疏水作用力。

4　結(jié) 論

通過高溫裂解檸檬酸的方法并經(jīng)過PEG2000修飾鈍化合成了石墨烯量子點。通過紅外光譜、熒光壽命和紫外-可見吸收光譜等方法對其進(jìn)行了表征。在PH＝7.40的Tris-HCl緩沖液介質(zhì)中，腎上腺色腙對量子點熒光有很強(qiáng)的猝滅作用，據(jù)此建立了以石墨烯量子點為熒光探針定量測定腎上腺色腙的新方法。該方法快速、簡單，可用于樣品中腎上腺色腙的含量測定。通過測定溫度對猝滅常數(shù)的影響和吸收光譜的變化探討了二者的猝滅機(jī)理。結(jié)果表明:腎上腺色腙與石墨烯量子點之間是以動態(tài)猝滅的方式發(fā)生相互作用，二者之間為疏水作用力。該方法為研究量子點和藥物間的相互作用提供了一定的實驗依據(jù)，同時為測定腎上腺色腙提供了新方法。

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[18]劉宇飛，孫小梅，王獻(xiàn)，等.巴氯芬及β-環(huán)糊精的包結(jié)物與牛血清白蛋白的相互作用研究[J].藥物分析雜志，2011，31（4）:685-689.

LIU Y F，SUN X M，WANG X，et ɑl..Interaction of baclofen or its comPlex of β-cYclodextrin with bovine serum albumin [J].Chin.J.Phɑrm.Anɑl.，2011，31（4）:685-689.（in Chinese）

馬紅燕（1966-），女，陜西延安人，教授，碩士生導(dǎo)師，2014年于陜西師范大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事光譜分析方面的研究。

E-mail:MahY6614@163.com

王艷妮（1990-），女，陜西咸陽人，碩士研究生，2013年于延安大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事分子光譜分析方面的研究。

E-mail:396262792@qq.com

Detection of Carbazochrome by Graphene Quantum Dot Fluorescence Probe

MA Hong-Yan*，WANG Yan-ni

（College of Chemistry ɑnd Chemicɑl Engineering，Shɑɑnxi Key Lɑborɑtory of Chemicɑl Reɑction Engineering，Yɑn'ɑn Uniυersity，Yɑn'ɑn 716000，Chinɑ）

，E-mɑil:Mɑhy6614@163.com

Water-soluble graPhene quantum dots（GQDs）were sYnthesized by the PYrolYsis of citric acid.Its fluorescent quantum Yield was remarklY increased by PEG2000 modified.The luminescence characteristics of GQDs were studied by fluorescence sPectroscoPY，ultraviolet-visible sPectroscoPY，infrared sPectroscoPY as well as the fluorescence lifetime.A novel method for quantitative determination of trace carbazochrome（CBZC）was develoPed based on the fluorescence quenching of GQDs in PH 7.40 Tris-HCl buffer solution.A wide range of reaction Parameters，such as concentration of GQDs，reaction time，surfactant，sorts and amount of buffer was examined.The screening results show that the ΔF was linearlY related with the carbazochrome concentration from 4.0×10-7to 1.2×10-5mol/L（0.995 6）with the detection limit of 1.5×10-7mol/L.The relative standard deviation is 0.15%（n＝5，c＝4.0×10-6mol/L），when the concentration of GQDs is 2.3×10-3mol/L.The method has been used for the determination of carbazochrome in samPles with the recoveries of 97.46%-101.6%.The interaction mechanism and main sorts of binding force between GQDs and carbazochrome were investigated by the temperature effect on the quenching constants and UV-visible absorPtion sPectrometrY.

graPhene quantum dots（GQDs）;fluorescence Probe;carbazochrome（CBZC）;citric acid

O657.3

A DOI:10.3788/fgxb20163702.0230

1000-7032（2016）02-0230-07

2015-09-18;

2015-12-08

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃（2014JM2056）;延安大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項目資助