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    天津地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

    2016-10-28 05:28:51馬騰宇陳麗麗白娜仁吐雅
    中國(guó)乳業(yè) 2016年9期
    關(guān)鍵詞:瓊脂金黃色葡萄球菌

    文/馬騰宇 陳麗麗 汪 志 白娜仁吐雅

    天津地區(qū)奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

    文/馬騰宇1陳麗麗2汪志3白娜仁吐雅3

    (1天津食品集團(tuán)有限公司;2天津市奶牛發(fā)展中心;3天津嘉立荷畜牧有限公司)

    通過血平板培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化鑒定試驗(yàn),對(duì)天津地區(qū)由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎進(jìn)行分離鑒定,并對(duì)其進(jìn)行耐藥性分析。結(jié)果顯示,采集199 份奶樣中共檢出葡萄球菌53 株,其中金黃色葡萄球菌40 株、表皮葡萄球菌13 株;檢出的葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感,可以用以上4 種抗生素對(duì)由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎進(jìn)行治療。

    奶牛;乳房炎;葡萄球菌;藥敏試驗(yàn)

    奶牛乳房炎與子宮炎、肢蹄病被稱為奶牛三大難治愈的疾病,是奶牛的一種常見病與多發(fā)病,只要飼養(yǎng)奶牛的地方,就有乳房炎發(fā)生。乳房炎是奶牛乳腺組織受到病原體的侵襲及物理、化學(xué)因素刺激所發(fā)生的一種炎癥反應(yīng),該病的發(fā)生給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了非常大的損失[1]。奶牛乳房炎可由多種病原微生物引起,包括細(xì)菌、霉形體、真菌和病毒等,一般以細(xì)菌感染為主,其中葡萄球菌是導(dǎo)致奶牛乳房炎的最主要病原菌,鏈球菌和大腸桿菌也比較常見[2~4]。

    據(jù)統(tǒng)計(jì),世界范圍內(nèi),每年因奶?;既榉垦讓?dǎo)致的奶產(chǎn)量下降可達(dá)380 萬噸[5]。因此對(duì)奶牛乳房炎采取適當(dāng)治療、對(duì)癥用藥,減少產(chǎn)奶量損失,對(duì)國(guó)際奶業(yè)的發(fā)展具有重要意義。奶牛乳房炎一般采用抗生素治療,殺滅侵入組織的病原體,并消除炎癥反應(yīng)。常用的抗菌藥物有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、磺胺類及喹諾酮類藥物等[6]。本研究對(duì)天津地區(qū)引起奶牛乳房炎的葡萄球菌進(jìn)行分離、鑒定,并進(jìn)行藥敏試驗(yàn),為指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥,有效降低乳房炎的發(fā)病率,促進(jìn)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    1.1.1奶樣采集

    在天津周邊的大港區(qū)(位于天津的南部)、靜海區(qū)(位于天津的西部)、寶坻區(qū)(位于天津的北部)不同規(guī)模奶牛場(chǎng)選取患乳房炎病牛,其中在大港區(qū)3 個(gè)牛場(chǎng)中選取20 頭、靜海區(qū)2 個(gè)牛場(chǎng)中選取10 頭,寶坻區(qū)地理分布不同的4 個(gè)牛場(chǎng)中選取20 頭。一共采集了9 個(gè)牛場(chǎng)199 份奶樣,其中大港地區(qū)80 份奶樣,靜海地區(qū)38 份奶樣,寶坻地區(qū)81 份奶樣。

    先用溫水清洗乳房,擦干后用浸有消毒藥液,如0.2%新潔爾滅溶液的濕毛巾擦拭乳房,待皮膚干燥后再以75%酒精棉消毒乳頭口及其周圍。清洗消毒后,每個(gè)乳頭擠出三把奶棄掉,以排除一些污染的雜菌,然后以無菌操作的方法,從奶牛的每個(gè)乳室中,現(xiàn)擠5~10 mL乳汁,裝入滅菌試管或無菌小瓶?jī)?nèi),封好蓋,標(biāo)上牛號(hào)、乳室、日期等,保存于放有冰塊的保溫箱中,24 h內(nèi)檢驗(yàn)。

    1.1.2試驗(yàn)用品

    (1)血瓊脂平板

    血瓊脂平板用于分離培養(yǎng)葡萄球菌。由天津嘉立荷畜牧有限公司提供的綿羊,頸部靜脈采血,用無菌方法分離血液中的纖維蛋白,再以5%的比例溶于50~60 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中,冷卻后置4 ℃冰箱備用。

    (2)卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基

    卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)含7.5%NaCl,以抑制葡萄球菌以外的其它細(xì)菌生長(zhǎng),用于選擇分離葡萄球菌。

    (3)營(yíng)養(yǎng)肉湯

    營(yíng)養(yǎng)肉湯用于增菌培養(yǎng)。

    (4)藥敏試紙片

    丁胺卡那霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素、氟哌酸、鏈霉素、恩諾沙星、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢噻肟、克林霉素、復(fù)方新諾明12 種新藥敏紙片,均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

    1.2試驗(yàn)方法

    1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)

    將采取的乳樣置于無菌離心管中,2 000~3 000 r/min離心10 min,棄去管中上層液體,無菌吸取底部沉淀物1 mL,加入含5 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯的玻璃管中,置于搖床上,增菌培養(yǎng)24 h;挑菌在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線,于37 ℃下培養(yǎng)12~24 h后,挑取典型單個(gè)菌落接種到綿羊鮮血瓊脂平板上再次培養(yǎng)12~24 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況,并進(jìn)行革蘭氏染色,配合顯微鏡檢查,觀察細(xì)菌形態(tài)、革蘭氏染色特點(diǎn),挑選出單個(gè)菌落接種到卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。

    1.2.2細(xì)菌生化鑒定

    純化培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)、麥芽糖發(fā)酵、甘露醇以及七葉苷水解試驗(yàn),參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]進(jìn)行鑒定。

    1.2.3藥敏試驗(yàn)

    (1)在良好的光線下,以有黑字的白紙為背景,將培養(yǎng)液(菌懸液)與硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行比濁,調(diào)整渾濁度至硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管相同濃度。如細(xì)菌濃度過高,用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)液。

    (2)將溶化好的M-H瓊脂傾注直徑90 mm的平皿,制成厚3~4 mm的M-H瓊脂平板。

    (3)用滅菌棉拭子蘸取上述濃度的菌懸液,在管內(nèi)壁將多余菌液擠去,在瓊脂平板表面涂布接種3 次,每次旋轉(zhuǎn)60°,最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周,使菌液均勻涂滿整個(gè)瓊脂平板表面,蓋好平皿,在室溫下干燥5 min,待平板表面稍干即可放置藥敏片。

    (4)用滅菌鑷子以無菌操作,夾住藥敏片邊緣取出,緊貼在涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面。貼藥敏片時(shí)要輕輕按壓,以保證與培養(yǎng)基密切接觸。將平皿置于35~37 ℃溫箱中培養(yǎng)12~24 h,觀察結(jié)果。

    圖1 葡萄球菌在血瓊脂平板上的菌落特征

    圖2 葡萄球菌在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征

    圖3 葡萄球菌純培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色陽性

    2 結(jié)果

    2.1葡萄球菌的分離與鑒定

    葡萄球菌在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中迅速生長(zhǎng),渾濁率高,管底部有沉淀;在血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好,呈圓形或橢圓形,多成簇,也有成對(duì)和單個(gè)者,菌落直徑1.5~2.0 mm,有的菌落呈米黃或金黃色,有的菌落呈乳白或灰白色,均不透明,表面光滑,邊緣整齊(圖1);在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上,生長(zhǎng)初期基本和在血瓊脂平板上的狀態(tài)一樣,3 天后,葡萄球菌呈圓形、黃玉米色、邊緣整齊的小菌落(圖2)。純化后的細(xì)菌革蘭氏染色后鏡檢顯陽性,呈圓形,以單個(gè)或短鏈狀、葡萄串狀排列(圖3)。

    2.2葡萄球菌的生化鑒定

    表1列出了2 種葡萄球菌的生化鑒定結(jié)果,觸酶試驗(yàn)呈陽性,β溶血,凝固酶陽性,麥芽糖陽性,甘露醇陽性,七葉苷水解試驗(yàn)陰性,判斷為金黃色葡萄球菌;觸酶試驗(yàn)呈陽性,γ溶血,凝固酶陰性,麥芽糖陰性,甘露醇陰性,七葉苷水解試驗(yàn)陰性,判斷為表皮葡萄球菌。

    2.3天津地區(qū)葡萄球菌檢出率

    天津市3 個(gè)區(qū)縣9 個(gè)奶牛場(chǎng)199份奶樣中共檢出葡萄球菌53 株,其中金黃色葡萄球菌40 株,表皮葡萄球菌13 株,具體檢出結(jié)果及檢出率見表2。

    2.4藥敏試驗(yàn)

    對(duì)分離鑒定出的2 種葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果如表3所示。從表3可以看出,頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素、氟哌酸、四環(huán)素對(duì)葡萄球菌均有高抑制性;氨卞西林、慶大霉素、克林霉素和復(fù)方新諾明對(duì)葡萄球菌有抑制作用;葡萄球菌對(duì)青霉素、鏈霉素以及紅霉素基本耐藥。

    表1 葡萄球菌生化鑒定結(jié)果

    表2 葡萄球菌檢出數(shù)量及檢出率

    表3 葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果             單位:mm

    3 討論

    3.1葡萄球菌的分離鑒定

    本試驗(yàn)中,采集的199 份奶樣中,共檢出葡萄球菌53 株,這與馬保臣報(bào)道的泌乳期臨床型乳腺炎病原菌以凝固酶陰性葡萄球菌為主[8],周慶國(guó)報(bào)道的佛山地區(qū)4 個(gè)奶牛場(chǎng)中的奶牛臨床型乳房炎主要由鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌感染而引起[9]基本相符。

    從引起奶牛乳房炎病原菌的檢出率分析,本試驗(yàn)中金黃色葡萄球菌檢出率為20.10%,表皮葡萄球菌檢出率為6.53%,這與張中文報(bào)道的臨床型乳房炎北京部分地區(qū)葡萄球菌占23.81%[10],殷波報(bào)道的四川某奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎的病原菌檢出率金黃色葡萄球菌23.3%、表皮葡萄球菌3.3%[11],袁永隆報(bào)道的臨床型乳房炎中葡萄球菌占17.14%[12]基本一致,但不同地區(qū)學(xué)者們檢測(cè)出引起奶牛乳房炎的葡萄球菌的檢出率存在細(xì)微差別。

    3.2葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)

    從上述試驗(yàn)結(jié)果可知,引起天津地區(qū)奶牛乳房炎的葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感,為了有效控制此種病原菌引起的奶牛乳房炎,以上4 種抗生素為首選藥物。本試驗(yàn)研究結(jié)果與王登輝報(bào)道的乳樣中分離出的金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢和環(huán)丙沙星敏感[13]相一致,與馬曉艷等研究金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星高度敏感結(jié)果[14]也相吻合,但與李飛等研究表明金黃色葡萄球菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率在80%以上的結(jié)果[15]稍有差異。

    4 結(jié)論

    天津地區(qū)采集的199 份奶牛乳房炎樣品中共檢出葡萄球菌53株,其中金黃色葡萄球菌40 株、表皮葡萄球菌13 株;藥敏試驗(yàn)表明葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。C

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    馬騰宇(1984-),男,碩士研究生,獸醫(yī)師,研究方向?yàn)榛A(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。

    2016-05-16)

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