重金屬污染下龜殼攀鱸組織中ACP和AKP的活力比較

謝麗玲，謝俊，趙斌，謝群慧，查廣才，鄭玉忠,*

1.汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，汕頭515063

2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085

3.韓山師范學(xué)院生物系，潮州521041

重金屬污染下龜殼攀鱸組織中ACP和AKP的活力比較

謝麗玲1，謝俊1，趙斌2，謝群慧2，查廣才3，鄭玉忠3,*

1.汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，汕頭515063

2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085

3.韓山師范學(xué)院生物系，潮州521041

龜殼攀鱸是一種在極端污染水域中具備生存優(yōu)勢的魚類，收集重污染區(qū)和輕污染區(qū)的龜殼攀鱸，并通過比較其體內(nèi)各組織中的酸性磷酸酶(ACP)及堿性磷酸酶(AKP)活性來揭示其耐污能力。貴嶼作為重污染區(qū)有4個采樣點：大隴村、市上村、聯(lián)堤村和北林村；潮州作為輕污染區(qū)有2個采樣點：臥石村和洗馬橋。水質(zhì)結(jié)果表明，貴嶼采樣地水中的Pb、Cd、Cr、As、Hg含量分別是潮州采樣點的27.6倍、3.9倍、5.8倍、3.9倍和3.5倍，說明貴嶼采樣地的污染遠(yuǎn)高于潮州的。酶活結(jié)果表明，在龜殼攀鱸所有組織中，內(nèi)臟組織(胃腸、性腺、肝臟、脾臟、腎臟)中的ACP和AKP活力均高于外周組織(肌肉、鱗片、鰓)；重金屬污染均能提高攀鱸體內(nèi)所有組織的ACP和AKP活力；AKP活性更容易受到重金屬的影響，各組織的AKP活力增幅普遍超過ACP活力增幅；其中，受重金屬影響最大的組織是脾臟，ACP和AKP活力可增長到2.37倍和6.21倍。這些結(jié)果說明了龜殼攀鱸可以通過顯著升高內(nèi)臟組織(如腸胃、肝臟、腎臟等)中ACP和AKP活性，以便更好地應(yīng)對高污染環(huán)境；其中AKP更容易受到重金屬的影響，適合用于作為評估污染的指標(biāo)。

重金屬；龜殼攀鱸；酸性磷酸酶；堿性磷酸酶；活力

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龜殼攀鱸(Anabas testudineus)屬于攀鱸屬(Anabas)魚類，分布于中國東南部、印度、東南亞等地區(qū)[1]。攀鱸屬在全球僅有2個種，中國僅龜殼攀鱸1種，分布于我國東南部各省中的大小江河下游及鄰近濕地、稻田，屬中國原生魚類[2]。龜殼攀鱸具有陸地爬行的能力和頑強的生命力，能適應(yīng)嚴(yán)重污染的水域，在污染區(qū)域會成為絕對優(yōu)勢種群，因此，它的存活密度可以間接反映水體的污染程度，可作指標(biāo)物種。目前，關(guān)于攀鱸的研究主要集中于對馴化、繁育、病害及防治等方面[1-5]，而對于該魚可在污染環(huán)境下存活的機理尚無報道。

魚類在抵抗外界壓力的過程中，主要依靠其非特異性免疫防御系統(tǒng)進行防御[6]。免疫相關(guān)酶是指能通過非特異性防御機制來抵抗異物的侵入，從而提高自身免疫力的一些酶類物質(zhì)，其中磷酸酶是第四道防線中非常重要的非特異性免疫酶，研究免疫相關(guān)酶類的活力水平，對研究不同區(qū)域龜殼攀鱸相關(guān)免疫水平有重要的意義。磷酸酶又稱磷酸單酯水解酶，是可以催化各種含磷化合物水解的酶類，許多研究證明磷酸酶在動物機體的骨化及在某些營養(yǎng)物的消化、吸收和運轉(zhuǎn)過程中起著非常重要的作用，也是動物體內(nèi)重要的解毒體系[6-7]。另一些研究表明磷酸酶活力是細(xì)胞和體液免疫強弱的綜合體現(xiàn)，也是衡量免疫功能和機體狀態(tài)的指標(biāo)，反映了機體對外源物質(zhì)的防御能力[8-10]。根據(jù)磷酸酶催化作用的最適pH特性，可分為酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)，ACP和AKP是2種重要的機體功能調(diào)節(jié)酶。Broeg等[11]就認(rèn)為魚類ACP活性可反應(yīng)肝臟巨噬細(xì)胞吞噬活性的高低。磷酸酶不是通過抗氧化系統(tǒng)來清除由外源物質(zhì)產(chǎn)生的自由基，而是直接溶解或消化外源物質(zhì)已達(dá)到防御的目的(即非氧化防御系統(tǒng))，魚類的非氧化防御系統(tǒng)是抵擋外源物質(zhì)的第一道屏障[12-14]，當(dāng)魚體受到環(huán)境脅迫時，其ACP和AKP的活性會受到不同程度的影響。本文選擇通過非氧化性防御系統(tǒng)來抵御外源物質(zhì)的ACP和AKP作為龜殼攀鱸耐污機制研究的靶酶，以了解攀鱸耐污的原因。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 取樣地概況

貴嶼是主要的電子垃圾拆解地，環(huán)境污染非常嚴(yán)重，按主要水域選取4個地方，即大隴村、市上村、聯(lián)堤村和北林村；潮州的選點為臥石村和洗馬橋，屬于輕度污染水域。具體情況見表1。

表1 采樣地情況Table 1 The circumstances of sampling point

2014年7月，在每個采樣點采集龜殼攀鱸及水樣，樣本魚分為2組，分別為重度污染區(qū)組和輕度污染區(qū)組(見表2)。將采集到的活體龜殼攀鱸樣本帶回實驗室后，立即統(tǒng)一解剖并測酶活。

1.2 儀器和試劑

水簇箱，冰箱，直尺，生物解剖器，高速分散器，離心管，離心機，移液槍，特弗隆坩堝，電熱板，Agilent 7700x ORS-ICP-MS，96微孔板，酶標(biāo)儀。

雙蒸水，生理鹽水，Milli-Q水，濃HNO3，H2O2，Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒，酸性磷酸酶測試盒，堿性磷酸酶測試盒。

1.3 實驗方法

1.3.1 采樣地水中重金屬含量的測定

污染環(huán)境水樣中的重金屬含量測定采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[15-16]。

用濕消解法對污染環(huán)境水樣進行前處理，即取一定量的樣品于特弗隆坩堝中，加入5～10 mL的濃HNO3，靜置1夜，第2天加入2 mL的H2O2；將樣品放于電熱板上，180℃下消解4～6 h；完成后，冷卻至室溫，定容至50 mL；最后過濾，取濾液。前處理后上樣于Agilent 7700x ORS-ICP-MS進行測定。

1.3.2 樣品制備

將隨機抓取的龜殼攀鱸活體放入低溫約15 min使之麻痹，取出用雙蒸水清洗，紙巾吸干，測其體重和體長；分別取出肌肉、鰓、胃腸、肝臟、腎臟等組織器官。

準(zhǔn)確稱取待測組織的重量，按重量(g):體積(mL) =1:9的比例，加入9倍體積的預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，然后將勻漿液離心2 500 r·min-1，離心10 min，取上清液放入-20℃冰箱中保存。

1.3.3 蛋白含量的測定

蛋白含量測定購自天根生化科技(北京)有限公司的試劑盒進行測定。采用考馬斯亮蘭法測定所有組織蛋白濃度[17]。取0、1、2、3、4、5 μL牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg·mL-1)分別加入到96微孔板中，加Milli-Q水補足到10 μL；將適當(dāng)體積的樣品加入到96微孔板中，并用Milli-Q水補足到10 μL；向各微孔板中加入200 μL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫放置5～10 min；用酶標(biāo)儀測定595 nm處的吸光值，并記錄讀數(shù)，以不含BSA的樣品的光吸收值作為空白對照；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中的蛋白濃度，如果所得到的蛋白濃度不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，需稀釋樣品后重新測定。

1.3.4 酶活性的測定

酶活性均采用購自南京建成生物有限公司的試劑盒進行測定。采用微量酶標(biāo)法測定磷酸酶的活性[18]。取1.3.2制備的樣本，根據(jù)試劑盒中的操作表加入相應(yīng)的試劑；室溫放置3～5 min，用酶標(biāo)儀測定520 nm處的吸光值，并記錄讀數(shù)；根據(jù)試劑盒中的計算公式求得組織中ACP和AKP的活力。

酸性磷酸酶(ACP)活力單位定義為：每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位。堿性磷酸酶(AKP)活力單位定義為：每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SSPS 13.0軟件(SPSS Inc.)對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。采用ANOVA方法分析各實驗組之間的差異，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果（Results）

2.1 龜殼攀鱸的樣本狀況

對采集的龜殼攀鱸實驗樣本進行體長和重量等方面的檢測，詳見表2。

表2 龜殼攀鱸體長和重量Table 2 The length and weight ofAnabas testudineus

2.2 采樣地水中污染物含量

水樣采集后立即低溫保存，然后利用ICP-MS檢測了水樣中重金屬Pb、Cd、Cr、As、Hg的含量，結(jié)果詳見表3。

從表3的結(jié)果可以看出，貴嶼采樣地水中的重金屬含量高于潮州采樣點，其中貴嶼采樣地水中的Pb、Cd、Cr、As、Hg平均含量分別是潮州采樣點的27.6倍、3.9倍、5.8倍、3.9倍和3.5倍。說明貴嶼地區(qū)水體受到了嚴(yán)重的重金屬污染，相對而言，潮州地區(qū)水體的污染較輕。

2.3 采樣地攀鱸組織中污染物含量

利用ICP-MS分別檢測了貴嶼和潮州2個采樣地龜殼攀鱸肌肉、鰓、胃腸、肝臟和腎臟中重金屬Pb、Cd、Cr、As、Hg的含量，結(jié)果詳見表4和表5。

表3 2個采樣地污水中重金屬含量的比較（單位：ng·L-1）Table 3 Comparision of heavy metals contents in the sewage from two pollution areas(Unit:ng·L-1)

表4 貴嶼龜殼攀鱸組織中重金屬含量（單位：ng·g-1）Table 4 The heavy metals contents inAnabas testudineusfrom Guiyu(Unit:ng·g-1)

表5 潮州龜殼攀鱸組織中重金屬含量（單位：ng·g-1）Table 5 The heavy metals contents inAnabas testudineusfrom Chaozhou(Unit:ng·g-1)

從表4和表5的結(jié)果可以看出，貴嶼和潮州的龜殼攀鱸體內(nèi)重金屬含量均遠(yuǎn)低于國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。貴嶼采樣地攀鱸中的Pb、Cd、Cr、As、Hg平均含量分別是潮州采樣點的3.7倍、2.7倍、0.7倍、0.8倍和1.4倍。魚體污染物的差異遠(yuǎn)低于兩地水環(huán)境中污染物的差異；甚至潮州龜殼攀鱸體內(nèi)Cr和As含量還高于貴嶼。這些現(xiàn)象表明外界污染程度與攀鱸體內(nèi)污染物濃度并不成正比，預(yù)示著攀鱸存在某些機制可以防止污染物的富集。

2.4 攀鱸各組織不同地點的ACP、AKP活力比較

隨機取每個樣點的5尾龜殼攀鱸進行解剖，并測定其體內(nèi)各組織的ACP和AKP活力。ACP、AKP活性結(jié)果被平均分為貴嶼和潮州兩組，具體詳見表6。

圖1 貴嶼攀鱸ACP和AKP的組織分布

圖2 潮州攀鱸ACP和AKP的組織分布

表6 兩區(qū)攀鱸各組織中ACP、AKP活力的差異（n=5)Table 6 Comparision of ACP and AKP inAnabas testudineusfrom two pollution areas(n=5)

結(jié)果表明，在龜殼攀鱸所有組織中，內(nèi)臟組織(胃腸、性腺、肝臟、脾臟、腎臟)中的ACP和AKP活力均高于外周組織(肌肉、鱗片、鰓)。重金屬污染均能提高攀鱸體內(nèi)所有組織的ACP和AKP活力；其中，腸胃是攀鱸體內(nèi)ACP和AKP的主要分布區(qū)，重金屬污染會大幅提高ACP和AKP的活力，分別增長到2.02倍和1.75倍。就2種酶活而言，AKP活性更容易受到重金屬的影響，各組織的AKP活力增幅普遍超過ACP活力增幅；其中，受重金屬影響最大的組織是脾臟，ACP和AKP活力可增長到2.37倍和6.21倍。這些結(jié)果說明了當(dāng)機體受到重金屬脅迫時，內(nèi)臟組織需要分泌更多的ACP和AKP，以便適應(yīng)外界壓力；而且AKP更容易受到重金屬的影響，適合用于作為評估污染的指標(biāo)。

2.5 攀鱸不同組織磷酸酶活力比較

按重度污染區(qū)和輕度污染區(qū)劃分，比較ACP和AKP活力在各個組織中情況，詳見圖1和圖2。

結(jié)果表明，首先，同一組織不同采樣地點的ACP和AKP活力有較大差異，其中貴嶼的要高于潮州的；其次，同一采樣地點不同組織的ACP、AKP活力也具有差異性，ACP的活力在胃腸、肝臟、腎臟、性腺和脾臟中比較高，高低順序為：胃腸＞肝臟＞性腺＞腎臟＞脾臟，而AKP的活力在胃腸和腎臟也比較高。胃腸是與營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運轉(zhuǎn)有密切關(guān)系的器官，而肝臟和腎臟是魚體內(nèi)的解毒器官，所以胃腸、肝臟和腎臟中磷酸酶活力都相對較高。

3 討論（Discussion）

貴嶼由于電子垃圾拆解受到了嚴(yán)重的污染，如重金屬和多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)等。重金屬污染可以從表3看出，王曉春等[19]則證明了貴嶼地區(qū)的地表水受到較嚴(yán)重的PBDEs污染。然而，實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)龜殼攀鱸在貴嶼成為了絕對優(yōu)勢的魚種，說明它具有非凡的抗污能力。一方面，在重度污染區(qū)域會成為絕對優(yōu)勢種群的龜殼攀鱸，檢測到其體內(nèi)的ACP和AKP活力較強，推測龜殼攀鱸能通過長期的進化，自身體內(nèi)的解毒酶活性不斷提高，使得龜殼攀鱸有更高的免疫和防御能力。另一方面，龜殼攀鱸各組織中的磷酸酶活力有明顯差異，而胃腸、肝臟、腎臟較高，表明龜殼攀鱸會通過胃腸的代謝活動和肝臟、腎臟的解毒作用使自身體內(nèi)的污染物減少。

ACP和AKP活力高低是魚類自身免疫的重要指標(biāo)，盧彤巖等研究了不同年齡階段的哲羅魚肝臟、血液、鰓及肌肉等組織ACP和AKP活力，發(fā)現(xiàn)AKP活性水平表現(xiàn)為鰓＞肝臟＞肌肉＞血漿，而ACP在各組織中的活性為鰓＞肝臟＞血漿＞肌肉，且年齡不同的哲羅魚的ACP和AKP活力有明顯差異[18]。趙吉偉等[20]研究了野生及養(yǎng)殖茴魚體內(nèi)腎臟、肝臟和肌肉中的ACP和AKP活力，發(fā)現(xiàn)兩群體三種組織中AKP活力均表現(xiàn)為：腎臟＞肝臟＞肌肉，而ACP活力均表現(xiàn)為：腎臟＞肌肉＞肝臟，且野生群體與養(yǎng)殖群體的ACP和AKP活力有明顯差異。與這些研究比較后說明，ACP和AKP的活力在魚類組織中的分布與魚的種類、年齡、生長環(huán)境等有較大的聯(lián)系。

有研究還表明，ACP和AKP的活力還會受到污染物的影響，詹付鳳等[21]研究了重金屬鎘對鯽魚腸、肝胰臟和鰓中ACP和AKP活性的影響，發(fā)現(xiàn)鎘暴露后，鯽魚腸、鰓組織中ACP和AKP的活性降低，而肝和胰臟的AKP活性沒有明顯變化，其ACP活性則升高。賈秀英等[22]研究了重金屬鎘對鯉魚腎臟、肝胰臟、腸、血液等組織中ACP和AKP活性的影響，發(fā)現(xiàn)鎘能抑制鯉魚腎臟、肝胰臟、血液中的ACP活性，對腸中的的ACP活性卻無影響，鎘也能抑制鯉魚腎臟、腸中的AKP活性?？紫闀萚23]研究了汞暴露對草魚血清、鰓、肝胰臟、脾、腎臟和肌肉等器官組織中堿性磷酸酶活性的影響，研究發(fā)現(xiàn)在暴露周期21 d內(nèi)，血清中AKP活性先不變后下降，鰓中AKP活性先上升后不變，肝胰臟和脾臟中AKP活性一直下降，腎臟中AKP活性先不變后上升，肌肉中AKP活性一直不變。高舉等[24]則研究了重金屬鉛對鯽魚鰓、肝、胰、腎、腦組織的ACP和AKP活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鯽魚鰓、肝、胰、腎、腦組織中ACP和AKP活性隨著鉛濃度的升高和染毒時間的延長均呈下降趨勢。王卓等[25]研究了碳酸鹽堿度對青海湖裸鯉幼魚肝、腎中ACP和AKP活性的影響，發(fā)現(xiàn)了肝、腎中ACP和AKP活性均會顯著升高，以便更好地應(yīng)對高堿環(huán)境。這些研究說明了魚體內(nèi)的ACP和AKP的活力會受到污染物的影響，而且會因為污染物的種類、魚的種類不同而有不同的變化。

Wong等[26]研究了貴嶼大氣、土壤和沉積物中的持久性有機污染物(PBDEs、PCDD/Fs、PAHs、PCBs)和重金屬(Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn、Mn、As)含量，發(fā)現(xiàn)其含量要比其他城市地區(qū)高好幾倍，甚至十幾倍；Song等[27]發(fā)現(xiàn)中國3個傳統(tǒng)的電子垃圾拆解地(貴嶼、臺州、清遠(yuǎn))中的持久性有機污染物(PBBs、PBDEs、PCDD/Fs、PCBs)和重金屬(Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn、Mn、As、Fe、Hg)含量比其他非電子垃圾拆解地要高很多，而且有逐年上升的趨勢。這說明電子垃圾拆解過程中同時產(chǎn)生了大量的有機污染物和有害重金屬，兩類物質(zhì)有一定的相關(guān)性，而且它們非常難于分解，容易在土壤和水中積累。因此，生活在貴嶼等地的生物會受到有機污染物和重金屬的雙重毒害，可以推測龜殼攀鱸體內(nèi)ACP、AKP活性不僅與重金屬污染有關(guān)，還與其他有機污染源相關(guān)，這有待于進一步探討和研究。

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Activity Comparision of ACP and AKP in the Tissues of Anabas testudineus from Heavy Metal-polluted Areas

Xie Liling1,Xie Jun1,Zhao Bin2,Xie Qunhui2,Zha Guangcai3,Zheng Yuzhong3,*

1.Department of Biology,College of Science,Shantou University,Shantou 515063,China
2.Research Center for Eco-environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China
3.Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China

8 September 2015 accepted 27 November 2015

Anabas testudineus,a species of fish,can become dominant species in the extremely polluted waters.In order to reveal the pollution resistance ofAnabas testudineus,fish samples were collected from different polluted areas(Guiyu and Chaozhou),and the activities of acid phosphatase(ACP)and alkaline phosphatase(AKP)were analysed in different tissues.Four sampling points were chosen in Guiyu for polluted area,including Dalong village, Shishang village,Liandi village and BeiLin village.Control sampling points were chosen in Chaozhou,includingWoshi village and Ximaqiao.Water was collected from all sampling points to determine heavy metal content.The levels of Pb,Cd,Cr,As,Hg of water sample in Guiyu were 27.6 times,3.9 times,5.8 times,3.9 times and 3.5 times of those in Chaozhou.The results showed that,firstly,the activities of ACP and AKP in gastrointestinal organs,gonad, liver,spleen and kidney were higher than the peripheral tissues(such as muscle,squama and gill).Secondly,heavy metal pollution could induce the activities of ACP and AKP in almost all tissues ofAnabas testudineus.Thirdly,the activities of AKP in all tissues were more susceptible than that of ACP to heavy metals.Finally,the activities of ACP and AKP in spleen were most susceptible to heavy metals,which could be increased to 2.37 times and 6.21 times,respectively.These results indicated thatAnabas testudineuscould significantly increase the activities of ACP and AKP in visceral tissues(such as gastrointestinal,liver,kidney,etc.)to well adapt to the heavy polluted environment,and the activity of AKP were more vulnerable to heavy metal and suitable to be a evaluation index of pollution.

heavy metal;Anabas testudineus;acid phosphatase;alkaline phosphatase;activity

2015-09-08 錄用日期：2015-11-27

1673-5897（2016）3-323-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150908002

簡介：鄭玉忠(1977—)，男，生物學(xué)博士，副研究員，主要研究方向為中藥藥理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文80余篇。

國家自然科學(xué)基金重點項目(81202907)；廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室開放基金項目(GPKLMB201201)

謝麗玲(1964-)，女，副教授，研究方向為生物活性物質(zhì)，E-mail:llxie@stu.edu.cn

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:zhengyuzhong@gmail.com