2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的相互作用機(jī)理研究

黃鳴，鄒路易,*，滕躍，杜憲正，房曉燕

1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫214122

2.臨沂市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，臨沂276001

2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的相互作用機(jī)理研究

黃鳴1，鄒路易1,*，滕躍1，杜憲正1，房曉燕2

1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫214122

2.臨沂市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，臨沂276001

2-巰基噻唑啉是一種被廣泛應(yīng)用的抗腐蝕劑和光亮劑，然而它的一些殘留物會對環(huán)境造成損壞，為探究2-巰基噻唑啉的毒性作用，采用光譜學(xué)技術(shù)和分子對接技術(shù)來考察2-巰基噻唑啉和過氧化氫酶的相互作用影響，其中酶活性實(shí)驗(yàn)表明2-巰基噻唑啉會抑制過氧化氫酶的活性，分子對接結(jié)果顯示2-巰基噻唑啉會結(jié)合在過氧化氫酶的活性位點(diǎn)處，并最終導(dǎo)致過氧化氫酶空間結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的變化，根據(jù)熒光測試結(jié)果，表明2-巰基噻唑啉和過氧化氫酶之間的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。通過測量不同溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合常數(shù)以及熱力學(xué)常數(shù)，顯示2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶主要通過氫鍵和范德華力相結(jié)合。該研究從分子水平上考察了2-巰基噻唑啉對蛋白質(zhì)的毒性作用，對于闡明污染物的毒性機(jī)理具有重要意義。

2-巰基噻唑啉；過氧化氫酶；多種光譜技術(shù)；分子對接

黃鳴,鄒路易,滕躍,等.2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的相互作用機(jī)理研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):258-264

Huang M,Zou L Y,Teng Y,et al.Interaction mechanism between 2-mercaptothiazoline and catalase[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3): 258-264(in Chinese)

過氧化氫酶(catalase，CAT)是一種大量存在于肝臟中的氧化還原酶，能催化H2O2分解成H2O和O2，從而清除在細(xì)胞中的H2O2，使其不再進(jìn)一步產(chǎn)生毒性很大的羥基自由基，是一種重要的肝臟保護(hù)酶[1]。近來有研究報(bào)道過氧化氫酶和某些腫瘤、糖尿病、衰老及氧化應(yīng)激有關(guān)，但其機(jī)理尚不明確[2-3]。

2-巰基噻唑啉(2-mercaptothiazoline，2-MT)是一種雜環(huán)有機(jī)化合物，可作為一種抗腐蝕劑，光亮劑，橡膠抗氧化劑廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)生產(chǎn)中[4]，據(jù)報(bào)道，該物質(zhì)存在于江河、城市徑流等環(huán)境中，因此，2-巰基噻唑啉及其殘留物會對環(huán)境造成危害[5]。2-巰基噻唑啉對實(shí)驗(yàn)動物的毒性作用已有較多的報(bào)道,其對哺乳動物的甲狀腺具有顯著毒性[6]。然而從分子水平評價(jià)2-巰基噻唑啉對免疫系統(tǒng)關(guān)鍵酶的毒性影響尚未見報(bào)道，本文采用多種光譜技術(shù)和分子對接法研究了2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的毒性作用機(jī)理，通過探討2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的活性和骨架結(jié)構(gòu)的影響，以及兩者之間的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)和作用力類型，本研究可以將為評價(jià)2-巰基噻唑啉的毒性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

過氧化氫酶(取自牛肝)購于美國Sigma公司，配制成1.0×10-5mol·L-1的儲備液，放置在0～4℃的冰箱中保存。2-巰基噻唑啉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配制成1.0×10-3mol·L-1的儲備液于0～4℃的冰箱中保存。0.2 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)作為緩沖溶液，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 過氧化氫酶活性測定

過氧化氫酶活性可以利用分光光度法測定過氧化氫溶液在240 nm處的吸光度的變化，過氧化氫酶活性抑制率可以通過以下公式計(jì)算得到[7]：

ΔA1和ΔA0是在2-巰基噻唑啉分別存在和不存在時(shí)，過氧化氫溶液在240 nm處2 min內(nèi)吸光度的變化值。

1.2.2 紫外可見吸收光譜

UV-6100雙光路紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，用于紫外可見吸收光譜的測量，狹縫寬度為2 nm，掃描范圍為200～240 nm。

1.2.3 熒光光譜

RF-5301PC分子熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)用于所有熒光光譜的測量，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射光狹縫均為5 nm，掃描范圍為280～500 nm。

同步熒光測量的波長差Δλ分別為15 nm(掃描范圍為260～340 nm)和60 nm(掃描范圍為300～400 nm)，激發(fā)和發(fā)射光狹縫均為5 nm。

1.2.4 圓二色譜

MOS-450/AF-CD圓二色譜儀(法國Bio-Logic公司)用來測定CD光譜值，寬帶為4 nm，掃描范圍為200～260 nm，掃描速度為1 nm·2s-1。

1.2.5 分子對接

分子對接利用AutoDock 4.2軟件完成，過氧化氫酶的分子結(jié)構(gòu)(1TGU.pdb)從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫獲得[8]，2-巰基噻唑啉分子的3D結(jié)構(gòu)從網(wǎng)站(http://zink.docking.org/)下載[9]。利用AutoDock軟件探索了2-巰基噻唑啉的中心位置和可旋轉(zhuǎn)鍵，對過氧化氫酶進(jìn)行去水、加氫、加電荷的操作，在過氧化氫酶分子上設(shè)置模擬范圍后，選取LGA的計(jì)算方法進(jìn)行分子對接的模擬計(jì)算，最后選取結(jié)合自由能最低的構(gòu)象用于后續(xù)分析。

2 結(jié)果與討論（Results and discussion）

2.1 2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶活性影響

2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的活性影響見圖1[10]，從圖中可以看出，對于每一組染毒時(shí)間，隨著2-巰基噻唑啉濃度的增加，過氧化氫酶的活性是降低的。另外，當(dāng)2-巰基噻唑啉不存在的時(shí)候，可以發(fā)現(xiàn)，染毒時(shí)間對過氧化氫酶的活性沒有影響，但是，當(dāng)2-巰基噻唑啉存在時(shí)，染毒時(shí)間就會影響過氧化氫酶的活性。對于濃度為3×10-5mol·L-1和1× 10-4mol·L-1的2-巰基噻唑啉，當(dāng)染毒時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶的相對活性分別下降至最初的(0 min)78.6%和84.3%，由此我們可以得出，2-巰基噻唑啉的濃度和染毒時(shí)間都會對過氧化氫酶的活性產(chǎn)生顯著影響。

圖1 2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的活性影響圖

圖2 不同濃度2-巰基噻唑啉下過氧化氫酶的紫外可見吸收光譜圖

圖3 過氧化氫酶的同步熒光光譜圖

2.2 過氧化氫酶空間結(jié)構(gòu)變化的研究

2.2.1 紫外可見吸收光譜

紫外可見吸收光譜是一種可以用來探索蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)變化的方法，我們可以從圖2中看出，在205 nm處過氧化氫酶有很強(qiáng)的一個(gè)吸收峰，隨著2-巰基噻唑啉的濃度不斷增加，過氧化氫酶的最大吸收峰的值不斷降低，并伴有紅移，表明2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的骨架結(jié)構(gòu)有影響，并使過氧化氫酶的骨架變得松散[11]。

2.2.2 同步熒光光譜

同步熒光能夠靈敏地反映生色團(tuán)微環(huán)境的變化[12]。通過固定激發(fā)與發(fā)射的波長差(Δλ)，采用同步掃描激發(fā)和發(fā)射器，就可以得到同步熒光光譜圖，它可以用來判斷蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，當(dāng)固定波長差(Δλ)分別為15 nm和60 nm時(shí)，掃描得到的同步熒光光譜給出的分別是酪氨酸和色氨酸的特征信息[13-14]。圖3a顯示隨著2-巰基噻唑啉濃度的增加，發(fā)射峰的位置幾乎沒有發(fā)生明顯的移動，由此可以看出2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶作用之后對酪氨酸殘基所處的微環(huán)境作用影響不大。圖3b可以看出隨著2-巰基噻唑啉濃度的增加，發(fā)射峰有了明顯的紅移(335.5～343.6 nm)，紅移說明了過氧化氫酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，色氨酸微環(huán)境的親水性增強(qiáng)。

圖4 2-巰基噻唑啉和過氧化氫酶作用后的CD光譜圖

2.2.3 圓二色譜

圓二色譜可以較準(zhǔn)確地反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。從圖4中可以看出，過氧化氫酶的CD光譜在208 nm和222 nm處有2個(gè)負(fù)峰，它反映的是蛋白質(zhì)α螺旋的特征信息[15]。然后我們利用CDPro軟件可以得出過氧化氫酶分子中α螺旋，β折疊以及無規(guī)則卷曲的含量。從表1可以看出隨著2-巰基噻唑啉濃度的增大，α螺旋降低了0.7%，β折疊增加了0.4%，這就說明2-巰基噻唑啉過氧化氫酶二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，使其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[16]。

2.2.4分子對接

為了確定2-巰基噻唑啉在過氧化氫酶上的具體結(jié)合位置，本實(shí)驗(yàn)采用分子對接的方法來對兩者的結(jié)合位置進(jìn)行模擬。圖5a為2-巰基噻唑啉在過氧化氫酶分子上最可能的結(jié)合位置，從圖中可以看出2-巰基噻唑啉結(jié)合在過氧化氫酶D鏈的活性位點(diǎn)附近，這可能會影響過氧化氫酶的催化活性。圖5b為兩者結(jié)合位點(diǎn)的局部圖，分子對接結(jié)果表明2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的主要作用力為氫鍵和范德華力，在2-巰基噻唑啉分子上的H原子與過氧化氫酶A鏈GLU70氨基酸殘基上的OE1原子間存在氫鍵作用，在二者的結(jié)合的過程中也存在靜電力和疏水力，但氫鍵和范德華力起主要作用。

圖5 2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的結(jié)合位置（a）和兩者結(jié)合的局部（b）圖（虛線表示氫鍵作用）

表1 2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶二級結(jié)構(gòu)含量變化的影響Table 1 Effects of 2-MT on the percentage of secondary structural elements in CAT at 291 K

圖6 2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶熒光強(qiáng)度的影響

圖7 在不同溫度下2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶作用后的Stern-Volmer圖

2.3 過氧化氫酶與2-巰基噻唑啉的結(jié)合特性

2.3.1 熒光猝滅

過氧化氫酶在330 nm處具有較強(qiáng)的熒光峰(見圖6)，隨著2-巰基噻唑啉濃度的增加，過氧化氫酶的熒光峰強(qiáng)度不斷下降，說明2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的熒光具有猝滅作用，二者之間存在相互作用。熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Stern-Volmer方程進(jìn)一步判斷熒光猝滅的類型[17]。

式中F0和F分別為未加入和加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度，KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，kq為猝滅速率常數(shù)，τ0為無猝滅劑存在時(shí)熒光分子的平均壽命(其值為10-8s[18])，[Q]為猝滅劑的濃度。

當(dāng)猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增大，則猝滅類型為動態(tài)猝滅。當(dāng)猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減小，則為靜態(tài)猝滅。從表2可以看出KSV隨著溫度的升高而下降，可以判斷2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。而且，動態(tài)猝滅常數(shù)的最大值為2.0×1010L·mol-1·s-1[19],在本實(shí)驗(yàn)中，不同溫度下的Kq值都遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

2.3.2 結(jié)合常數(shù)

對于靜態(tài)猝滅，小分子和蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以通過以下公式得到[20]：

式中F0，F(xiàn)和[Q]與公式(2)的表示一致，Ka為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

表2 在不同溫度下2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶相互作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 2 Stern-Volmer quenching constants for the interaction of 2-MT with CAT at different temperatures

由表中數(shù)據(jù)可知，在不同溫度下的Ka和n值，n值約為1，表明二者的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1，即二者以約1：1的比例結(jié)合，Ka值反映了二者之間的作用力較強(qiáng)[21]。

2.3.3 作用力判斷

小分子與生物大分子之間的作用力包括很多類型，包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，在本試驗(yàn)中模擬的是生物體內(nèi)環(huán)境，因此條件比較溫和溫度變化不大，反應(yīng)的焓變ΔHo可視作常數(shù)，可以根據(jù)熱力學(xué)公式計(jì)算出小分子與生物大分子作用間的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。

其中K等同于公式(3)中的Ka，R為理想氣體常數(shù)。

Ross等[22]根據(jù)大量的試驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)出了小分子與生物大分子作用的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)可以簡單判斷其相互作用類型：若ΔHo>0及ΔSo>0主要表現(xiàn)為疏水作用；ΔHo<0及ΔSo>0要表現(xiàn)為靜電作用；ΔHo<0及ΔSo<0主要表現(xiàn)氫鍵或者范德華作用。

根據(jù)表3所示的結(jié)合常數(shù)Ka，帶入公式(4)(5)計(jì)算，并以lnK對T-1作圖8求得二者結(jié)合過程的熱力學(xué)函數(shù)列于表3。從表3數(shù)據(jù)可以看出ΔGo值為負(fù)值，說明2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的結(jié)合作用是自發(fā)進(jìn)行[23]，ΔHo和ΔSo值均為負(fù)值說明2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶之間主要通過氫鍵和范德華力相互結(jié)合。

本文利用了光譜和分子對接技術(shù)研究了2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的分子毒性作用機(jī)理，結(jié)果表明，2-巰基噻唑啉通過氫鍵和范德華力自發(fā)地與過氧化氫酶按1：1的比例相結(jié)合，結(jié)合在過氧化氫酶的活性位點(diǎn)處附近，從而導(dǎo)致過氧化氫酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并對過氧化氫酶的活性產(chǎn)生抑制作用。該研究為從分子水平上考察2-巰基噻唑啉的毒性作用機(jī)理，也為2-巰基噻唑啉的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供了重要依據(jù)。

圖8 2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶作用的van't Hoff圖

表3 過氧化氫酶和2-巰基噻唑啉體系的結(jié)合常數(shù)與熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Binding constants and relative thermodynamic parameters of the 2-MT-CAT system

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Interaction Mechanism between 2-Mercaptothiazoline and Catalase

Huang Ming1,Zou Luyi1,*,Teng Yue1,Du Xianzheng1,Fang Xiaoyan2

1.Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology,School of Environmental and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China
2.Linyi Agricultural Environmental Protection Monitoring Station,Linyi 276001,China

12 September 2015 accepted 11 November 2015

2-Mercaptothiazoline(2-MT)is a kind of widely used corrosion inhibitor and brightener.The residue of 2-MT in the environment is potentially harmful.To evaluate the toxicity of 2-MT at the protein level,the effects of 2-MT on catalase(CAT)were investigated by multiple spectroscopic techniques and molecular modeling.The enzyme activity experiment indicated that the CAT activity was inhibited by 2-MT.Molecular docking results revealed that 2-MT bound into the CAT active site,which further led to some secondary structure and micro-environmental changes of CAT.According to the fluorescence results,the quenching mechanism of fluorescence of CAT by 2-MT was a static quenching procedure.The number of binding sites n,the binding constant k and the thermodynamic parameters at different temperatures were also measured.The results indicated that 2-MT can interact with CAT to form a complex mainly by van der Waals'interactions and hydrogen bonds.In this paper,we studied the toxic mechanism between 2-mercaptothiazoline and protein at the molecular level,which will consequently be significantto learn the toxic effect of pollutants.

2-mercaptothiazoline;catalase;multi-spectroscopic techniques;molecular docking

2015-09-12 錄用日期：2015-11-11

1673-5897（2016）3-258-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150912001

簡介：鄒路易(1964-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境污染防治。

國家自然科學(xué)基金(21307043)

黃鳴(1991-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，E-mail:1074982512@qq.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:lyzou@jiangnan.edu.cn