廣州河涌水體中食蚊魚(yú)肝臟性激素相關(guān)基因的表達(dá)水平研究

張曉嬋，溫茹淑，方展強(qiáng),*

1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510631

2.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，梅州514015

廣州河涌水體中食蚊魚(yú)肝臟性激素相關(guān)基因的表達(dá)水平研究

張曉嬋1，溫茹淑2，方展強(qiáng)1,*

1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510631

2.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，梅州514015

應(yīng)用食蚊魚(yú)細(xì)胞色素P450芳香化酶基因(CYP19α)、卵黃蛋白原基因(VTGα)和雌/雄激素受體基因(ERα/ARα)mRNA轉(zhuǎn)錄水平為指標(biāo)，評(píng)價(jià)廣州海珠涌和黃埔涌食蚊魚(yú)受環(huán)境激素物質(zhì)干擾產(chǎn)生雌/雄性化效應(yīng)的現(xiàn)狀。結(jié)果顯示，海珠涌寶崗大道段(BG)、洪德路段(HD)和黃埔涌赤崗路段(CG)、苗藝路段(MY)采樣點(diǎn)雌魚(yú)性腺CYP19α mRNA表達(dá)水平顯著降低。雌魚(yú)肝臟VTGα mRNA的表達(dá)水平在夏冬兩季CG點(diǎn)都顯著升高，但在BG、HD和MY點(diǎn)的表達(dá)水平在冬季則顯著下降；夏冬兩季雌魚(yú)雄激素受體ARα mRNA表達(dá)水平在各點(diǎn)都顯著升高。雄魚(yú)性腺CYP19α mRNA表達(dá)水平在各點(diǎn)都無(wú)明顯差異，但CG點(diǎn)在夏季顯著升高，而MY點(diǎn)在冬季則顯著下降；雄魚(yú)肝臟VTGα和雌激素受體ERα mRNA表達(dá)水平分別在各點(diǎn)都顯著升高，但夏季MY點(diǎn)和冬季HD、MY各點(diǎn)無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，雌性食蚊魚(yú)的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ERα較對(duì)照REF明顯升高，表現(xiàn)出雄激素效應(yīng)；雄性食蚊魚(yú)VTGα和ERα轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照REF顯著升高，CYP19α基因無(wú)顯著性差異，表現(xiàn)出雌激素效應(yīng)。生活在廣州海珠涌和黃埔涌中的食蚊魚(yú)受雌/雄激素物質(zhì)干擾明顯，表明河涌中環(huán)境激素污染嚴(yán)重。

環(huán)境激素；食蚊魚(yú)；廣州河涌；目標(biāo)基因；mRNA表達(dá)；生物化學(xué)

張曉嬋,溫茹淑,方展強(qiáng).廣州河涌水體中食蚊魚(yú)肝臟性激素相關(guān)基因的表達(dá)水平研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):115-123

Zhang X C,Wen R S,Fang Z Q.Transcription levels of sex hormone genes in liver of mosquitofish in the creek of Guangzhou City[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):115-123(in Chinese)

國(guó)內(nèi)外對(duì)城市污水中存在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)所展開(kāi)的監(jiān)測(cè)與毒性評(píng)價(jià)是目前環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，尤其針對(duì)環(huán)境激素污染的監(jiān)測(cè)及對(duì)生物體的危害效應(yīng)評(píng)價(jià)已經(jīng)做了不少工作，如開(kāi)發(fā)斑馬魚(yú)(Danio rerio)、稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)、唐魚(yú)(Tanichthys albonubes)、劍尾魚(yú)(Xiphophorus helleri)等小型淡水魚(yú)類作為模式動(dòng)物開(kāi)展相關(guān)方面的研究，但多數(shù)研究主要以采集生活污水進(jìn)行室內(nèi)暴露為主，究其原因主要是這些魚(yú)類都不能在城市周邊受污染的溪流或河涌中存活，而不能直接投放到野外受污染的水域中進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)的研究[1-4]。食蚊魚(yú)(Gambusia affinis)是一種原產(chǎn)北美洲的熱帶性卵胎生小魚(yú)[5]，其入侵性非常強(qiáng)，因體形小、食性雜、繁殖周期短、產(chǎn)仔量大，已廣泛分布于國(guó)內(nèi)各地水域，尤其受污染的城市河涌中也可以生存。因此，直接觀察野外河涌中生活的食蚊魚(yú)，研究其受城市污水暴露后的生長(zhǎng)發(fā)育、骨骼形態(tài)學(xué)及器官組織病理學(xué)變化，開(kāi)發(fā)其在器官、組織、細(xì)胞及基因各級(jí)水平作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)城市水環(huán)境中可能存在的環(huán)境激素類物質(zhì)污染的研究具有重要的學(xué)術(shù)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

廣州河涌的成分復(fù)雜，有機(jī)及無(wú)機(jī)組分種類繁多，導(dǎo)致水體中具有雌激素及雄激素活性的污染物濃度及組分千差萬(wàn)別。這使得以食蚊魚(yú)為模式生物，對(duì)實(shí)際水體所受到的污染開(kāi)展相關(guān)生態(tài)安全評(píng)價(jià)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)選用分子生物學(xué)標(biāo)志物監(jiān)測(cè)廣州市海珠涌和黃埔涌中存在的EDCs致食蚊魚(yú)的生物學(xué)效應(yīng)。用雌魚(yú)性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ARα基因表達(dá)水平的變化檢測(cè)雄性化效應(yīng)；用雄魚(yú)性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ERα基因表達(dá)水平的變化檢測(cè)雌性化效應(yīng)。本研究以食蚊魚(yú)為指標(biāo)對(duì)廣州市部分河涌的污染狀況進(jìn)行較全面地監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)，其結(jié)果能為環(huán)保有關(guān)部門提供有參考價(jià)值的數(shù)據(jù)，有利于科學(xué)的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用城市河涌的水環(huán)境系統(tǒng)，并且將有助于發(fā)展將食蚊魚(yú)作為內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究的模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 采樣點(diǎn)

根據(jù)食蚊魚(yú)生長(zhǎng)的情況和捕魚(yú)的便利性，本研究選取了對(duì)照點(diǎn)(REF)、寶崗大道段(BG)、洪德路段(HD)、赤崗路段(CG)、苗藝路段(MY)等5個(gè)采樣點(diǎn)，BG、HD分別位于廣州市海珠涌中下游的路段；CG、MY分別位于黃埔涌中下游的路段。REF為不受城市廢水污染的地點(diǎn)，設(shè)在華師內(nèi)的中心湖。在對(duì)照點(diǎn)采集的食蚊魚(yú)先在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，馴養(yǎng)魚(yú)用水為曝氣除氯后的自來(lái)水。采集食蚊魚(yú)的同時(shí)，使用GPS測(cè)定采樣點(diǎn)的位置，并使用水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀(YSI556MPS)測(cè)定各采樣點(diǎn)的水質(zhì)參數(shù)，如pH值、溫度、電導(dǎo)性和溶解氧。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

食蚊魚(yú)采集分別于2013年6月(夏季)和2012年12月(冬季)進(jìn)行，在不同的采樣點(diǎn)用大型魚(yú)網(wǎng)隨機(jī)捕撈，并保證每個(gè)采樣點(diǎn)食蚊魚(yú)的總尾數(shù)在200以上。采集的食蚊魚(yú)放入編號(hào)的大型塑料桶中，每個(gè)塑料桶盛裝10 L原采樣點(diǎn)的河涌水，并在桶中放入適量的水草，以減少食蚊魚(yú)在運(yùn)輸過(guò)程中造成的損傷。食蚊魚(yú)于當(dāng)日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行各組實(shí)驗(yàn)。

正常的雌、雄個(gè)體鑒別及其性成熟的鑒定參照Leusch等[6]的方法：A.未成年雄性，臀鰭的第3鰭條長(zhǎng)度延長(zhǎng)，基部寬度加寬，但生殖足未發(fā)育完全；B.成年雄性，鰭條生殖足端部出現(xiàn)鉤和肘；C.未成年雌性，體長(zhǎng)＜20 mm，第3鰭條長(zhǎng)度未延長(zhǎng)，基部寬度未加寬；D.成年雌性，體長(zhǎng)≥20 mm，第3鰭條長(zhǎng)度未延長(zhǎng)，基部寬度未加寬；E.懷孕雌魚(yú)，腹部下端出現(xiàn)黑色孕斑。但由于本研究中雌性食蚊魚(yú)受到城市廢水的影響出現(xiàn)一定的雄性化現(xiàn)象，第3臀鰭條有所延長(zhǎng)，故為了避免雄性化作用對(duì)性別區(qū)別造成干擾，因此本文參考正常的雌雄鑒別方法外，同時(shí)把第3臀鰭條長(zhǎng)度延長(zhǎng)且交接器具有鉤狀結(jié)構(gòu)的食蚊魚(yú)定義為成熟的雄性食蚊魚(yú)，第3臀鰭條長(zhǎng)度延長(zhǎng)但不帶鉤狀結(jié)構(gòu)的且體長(zhǎng)≥20 mm定義為雄性化的雌性食蚊魚(yú)。

實(shí)驗(yàn)魚(yú)用大型水族網(wǎng)捕撈后放入裝有采樣點(diǎn)水樣的塑料桶中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，分別篩選成年雄性食蚊魚(yú)(B，體全長(zhǎng)18.88～23.74 mm；體重54.12～98.77 mg)和成年雌性食蚊魚(yú)(D，體全長(zhǎng)21.43～25.20 mm；體重99.12～442.78 mg)，設(shè)定各個(gè)試驗(yàn)組，并在當(dāng)天解剖提取食蚊魚(yú)的目標(biāo)器官(肝臟、性腺、臀鰭)50～100 mg裝入有標(biāo)簽的離心管，迅速放入液氮中速凍后統(tǒng)一轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中暫存，直至RNA提取試驗(yàn)。

1.3 試劑與儀器

超低溫冰箱(Revco,美國(guó))，Nanodro-1000型分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))，PCR儀(Bio-rad,美國(guó))，超凈臺(tái)(蘇州安泰)，BG-Power600型電泳儀(北京)，烘烤箱(上海森信)，滅菌鍋(蘇州安泰)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信)。

RNAisoPlus(TAKARA，Dalian，China)， FastQuant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN,China)，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGRN, China)。其他生化試劑盒化合物均為符合實(shí)驗(yàn)要求的國(guó)產(chǎn)試劑。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

登錄NCBI網(wǎng)站，找到西部食蚊魚(yú)(Gambusia affinis)的VTGα、ERα、ARα、CYP19α cDNA的序列，利用Primer 3軟件(http://frodo.-wit.Edu/)，由生物工程(上海)公司合成需要的引物。本研究相關(guān)基因擴(kuò)增引物名稱及其序列見(jiàn)表1。

總RNA提?。悍謩e將肝臟和性腺組織勻漿，臀鰭條則研磨成粉末，分別加入1 mL的Isoplus RNA (RNAiso Plus)提取液(TakaRa)進(jìn)行總RNA提取。RNA提取后進(jìn)行基因組DNA的去除，并檢測(cè)RNA濃度及其完整性，保證A260/A280的比值在1.8～2.0 (TakaRa)。

使用TakaRa Code：DRR037 PrimScriptTMRT reagents Kit(Perfect Real Tome)產(chǎn)品。RT反應(yīng)液配制如下：5×PrimeScript Buffer(2 μL)，PrimeScript PT Enzyme Mix I(0.5 μL)，Random 6 mers(100 μmol· L-1,0.5 μL)，Oligo dT Primer(50 μmol·L-1,0.5 μL), Total RNA(1 μL)，Rnase Free dH2O(5.5 μL)，總共10 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃15 min(cDNA合成)，85℃5 s(酶失活)。

表1 相關(guān)基因擴(kuò)增引物名稱及其序列Table 1 Name and sequence of the target gene amplified with primers

使用TakaRa Code：DRR081A SYBR?Premix ExTaqTMII(2×)10.0 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX References Dye(50×)or ROX References Dye(50×)0.4 μL,cDNA模板2.0 μL，H2O (滅菌)6.0 μL，總共20.0 μL。按照兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s、60℃退火32 s共40個(gè)循環(huán)。

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果數(shù)據(jù)的處理采用相對(duì)定量法，內(nèi)參基因選用β-actin。經(jīng)熒光定量PCR分析儀分析，得出精確的Ct值后，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對(duì)值即為相對(duì)表達(dá)量。

校正值=目的基因定量結(jié)果/管家基因定量結(jié)果

相對(duì)值=待測(cè)樣品的校正值/對(duì)照樣品的校正值

即倍數(shù)(Folds)=2-△△Ct=2-((Ct A-Ct A actin)-(Ct B-Ct B actin))

式中，A為對(duì)照點(diǎn)的樣品；B為廣州河涌各采樣點(diǎn)樣品；Ct值為閾值循環(huán)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析(One wey-ANOVA)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。用Excel 2013做柱形圖。設(shè)置P<0.05時(shí)，表示差異顯著；當(dāng)P<0.01時(shí)，表示差異極其顯著。

2 結(jié)果（Results）

2.1 各采樣點(diǎn)的水質(zhì)參數(shù)

對(duì)各采樣點(diǎn)水質(zhì)的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，夏季及冬季各采樣點(diǎn)的pH均處于正常范圍(6～9)內(nèi)，變化不大。各采樣點(diǎn)冬季水溫在17～21℃之間；夏季在28～29℃之間。對(duì)照點(diǎn)的溶解氧為(9.76±0.13)mg· L-1(夏季)、(10.91±0.15)mg·L-1(冬季)，魚(yú)類正常生長(zhǎng)所需溶解氧為5 mg·L-1及以上，可見(jiàn)對(duì)照點(diǎn)中氧氣充足，適于食蚊魚(yú)正常生長(zhǎng)。而采樣點(diǎn)中只有苗藝采樣點(diǎn)(冬季)的溶解氧高于5 mg·L-1，其余采樣點(diǎn)溶解氧處于1～3 mg·L-1波動(dòng)，食蚊魚(yú)供氧不足。對(duì)照點(diǎn)的電導(dǎo)率最低，分別為(204±3.77)μs·cm-1(夏季)、(234±2.17)μs·cm-1(冬季)，金屬離子和酸根離子的含量則相對(duì)比較低，水質(zhì)較為純凈。而采樣點(diǎn)中苗藝采樣點(diǎn)電導(dǎo)率較高，(549±3.83)μs·cm-1(夏季)、(447±2.73)μs·cm-1(冬季)，金屬離子和酸根離子的含量相對(duì)較高，水體的導(dǎo)電率較大。其余采樣點(diǎn)的電導(dǎo)率在300～400 μs·cm-1左右波動(dòng)。

2.2 雌性食蚊魚(yú)雄激素效應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)水平的變化

圖1 不同采樣點(diǎn)和不同季節(jié)雌性食蚊魚(yú)雄激素效應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)水平的比較

夏季生活在受城市廢水污染的廣州河涌中的雌性食蚊魚(yú)性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ARα基因mRNA的表達(dá)水平如圖1A所示。與對(duì)照點(diǎn)相比，海珠涌和黃埔涌的所有采樣點(diǎn)的成年雌性食蚊魚(yú)的性腺CYP19α mRNA的表達(dá)水平顯著降低(寶崗大道段：0.084倍，P<0.01；洪德路段：0.136倍，P <0.01；赤崗路段：0.598倍，P<0.05；苗藝路段：0.258倍，P<0.01)。而肝臟VTGα mRNA的表達(dá)水平除了赤崗路段點(diǎn)(赤崗路段：1.61倍，P<0.05)升高外，其余各點(diǎn)變化不明顯。但不同采樣點(diǎn)變化趨勢(shì)不一致，在寶崗大道段、洪德路段點(diǎn)呈下降趨勢(shì)，而在赤崗路段、苗藝路段點(diǎn)呈上升趨勢(shì)。與對(duì)照點(diǎn)相比，雄激素受體ARα mRNA表達(dá)水平顯著升高(寶崗大道段：5.34倍，P<0.01；洪德路段：4.22倍，P <0.01；赤崗路段：1.52倍，P<0.05)，其中在寶崗大道段、洪德路段點(diǎn)顯著上升(P<0.01)，在苗藝路段點(diǎn)無(wú)明顯差異。

冬季生活在廣州城市廢水中雌性食蚊魚(yú)性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ARα mRNA的基因表達(dá)水平如圖1B所示。與對(duì)照點(diǎn)相比，廣州海珠涌和黃埔涌的除赤崗路段點(diǎn)外，其余各點(diǎn)的成年雌性食蚊魚(yú)性腺CYP19α mRNA表達(dá)水平顯著降低(寶崗大道段：0.285倍，P<0.01；洪德路段：0.112倍，P<0.01；苗藝路段：0.422倍，P<0.01)。而肝臟VTGα mRNA的表達(dá)有2種變化趨勢(shì)，其中在寶崗大道段、洪德路段、苗藝路段點(diǎn)呈下降趨勢(shì)(BG：0.273倍，P<0.01；洪德路段：0.260倍，P<0.01；苗藝路段：0.64倍，P>0.05)，在赤崗路段點(diǎn)呈上升趨勢(shì)(赤崗路段：1.95倍，P<0.01)。與對(duì)照點(diǎn)相比，雄激素受體ARα mRNA表達(dá)水平除了赤崗路段點(diǎn)外，其余各點(diǎn)有明顯升高的趨勢(shì)(寶崗大道段：1.60倍，P <0.01；洪德路段：2.06倍，P<0.01；苗藝路段：4.57倍，P<0.05)，其中在苗藝路段點(diǎn)差異最顯著(P<0.01)。

結(jié)果顯示，夏、冬季生活在受廢水污染的河涌中雌性食蚊魚(yú)的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ERα較之REF明顯升高，雌性食蚊魚(yú)表現(xiàn)出雄激素效應(yīng)。

2.3 雄性食蚊魚(yú)雌激素效應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)水平的變化

夏季生活在廣州城市廢水中的雄性食蚊魚(yú)性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ERα mRNA的表達(dá)水平如圖2A所示。與對(duì)照點(diǎn)相比，除了赤崗路段點(diǎn)有上升的趨勢(shì)(赤崗路段：6.04倍，P<0.05)外，廣州海珠涌和黃埔涌中的成年雄性食蚊魚(yú)性腺CYP19α mRNA基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。而肝臟VTGα mRNA表達(dá)水平都顯著升高(寶崗大道段：6.04倍，P<0.01；洪德路段：5.68倍，P<0.01；赤崗路段：26.65倍，P<0.01；苗藝路段：8.27倍，P< 0.01)，其中在赤崗路段點(diǎn)變化最明顯。而雌激素受體ERα mRNA表達(dá)水平除了苗藝路段點(diǎn)外，其余各點(diǎn)有升高的趨勢(shì)(寶崗大道段：1.98倍，P<0.05；洪德路段：4.64倍，P<0.01；赤崗路段：1.76倍，P<0.05)，但升高幅度不大，其中在洪德路段點(diǎn)變化最明顯。

圖2 不同采樣點(diǎn)和不同季節(jié)雄性食蚊魚(yú)雌激素效應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)水平的比較

冬季生活在廣州城市廢水中雄性食蚊魚(yú)性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ERα mRNA的表達(dá)水平如圖2B所示。與對(duì)照點(diǎn)相比，廣州海珠涌和黃埔涌中的成年雄性食蚊魚(yú)的性腺CYP19α mRNA表達(dá)水平都沒(méi)有明顯變化，苗藝路段點(diǎn)則有下調(diào)趨勢(shì)(苗藝路段：0.494倍，P<0.05)。而肝臟VTG α mRNA表達(dá)水平顯著升高(寶崗大道段：5.68倍，P <0.01；洪德路段：2.54倍，P<0.01；赤崗路段：20.34倍，P<0.01；苗藝路段：6.74倍，P<0.01)，其中在赤崗路段點(diǎn)變化最明顯，其余各點(diǎn)都在10倍以下。而雌激素受體ERα mRNA的表達(dá)水平在寶崗大道段、赤崗路段點(diǎn)有明顯升高的趨勢(shì)(寶崗大道段：1.68倍，P<0.05；赤崗路段：1.51倍，P<0.05)，其余各點(diǎn)無(wú)明顯變化。

結(jié)果顯示，夏、冬季生活在受廢水污染的河涌中雄性食蚊魚(yú)VTGα和ERα轉(zhuǎn)錄水平較REF顯著升高，CYP19α基因則無(wú)顯著性差異，雄性食蚊魚(yú)表現(xiàn)出雌激素效應(yīng)。

3 討論（Discussion）

3.1 廣州河涌城市廢水暴露致雌性食蚊魚(yú)雄激素效應(yīng)

在生物體中，芳香化酶可以催化雄激素轉(zhuǎn)化成雌激素，促進(jìn)肝臟合成卵黃蛋白原，從而保證卵子的發(fā)育可以正常進(jìn)行。而本研究中雌魚(yú)CYP19α表達(dá)水平顯著降低，推測(cè)體內(nèi)雌激素合成通路受阻，雄激素水平則上升，性腺轉(zhuǎn)向雄性方向發(fā)育，從而出現(xiàn)雄性化征狀。不少研究表明CYP19α表達(dá)下調(diào)是雌性退化的反饋性調(diào)節(jié)結(jié)果，是雌性性腺退化的分子標(biāo)記之一。Kitano等[7]認(rèn)為睪酮(MT)誘導(dǎo)日本鰈的機(jī)制同芳香化酶抑制劑一樣，抑制日本鰈性腺芳香化酶的表達(dá)，導(dǎo)致雌二醇(E2)總量降低，從而誘導(dǎo)雌魚(yú)轉(zhuǎn)變?yōu)樾埕~(yú)。楊雋等[8]研究發(fā)現(xiàn)，壬基酚(NP)誘導(dǎo)比目魚(yú)幼魚(yú)雌性化的同時(shí)伴隨著CYP19α表達(dá)的上調(diào)，而用芳香化酶抑制劑法倔唑(fadrozole)喂食以及用MT染毒都能誘導(dǎo)遺傳學(xué)雌性比目魚(yú)性別轉(zhuǎn)換為雄性，同時(shí)檢測(cè)到對(duì)CYP19α表達(dá)的抑制。李廣麗等[9]發(fā)現(xiàn)埋植MT后性腺芳香化酶活性和血清中E2濃度變化不顯著，但CYP19α表達(dá)卻顯著降低，并誘導(dǎo)赤點(diǎn)石斑魚(yú)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。舒琥等[10]給2齡雌性赤點(diǎn)石斑魚(yú)3次埋植雄烯二酮(AED)后引起了性別逆轉(zhuǎn)，并發(fā)現(xiàn)發(fā)生性別逆轉(zhuǎn)的個(gè)體性腺CYP19表達(dá)水平和活性顯著降低。汪奇[11]研究表明芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑(LE)可導(dǎo)致基因型雌魚(yú)發(fā)生雄性化逆轉(zhuǎn)，形成有功能的精巢；該階段CYP19α表達(dá)下調(diào)和DMRT1表達(dá)上調(diào)是雄性化逆轉(zhuǎn)的標(biāo)志。本研究與上述研究結(jié)果相一致，食蚊魚(yú)雌魚(yú)CYP19α表達(dá)水平顯著降低，從而導(dǎo)致內(nèi)源激素平衡被改變。推測(cè)廣州河涌中城市廢水存在某些化合物抑制卵巢中CYP19α的表達(dá)，從而誘導(dǎo)雌魚(yú)雄性化。本研究發(fā)現(xiàn)，除了赤崗路段點(diǎn)外，其他采樣點(diǎn)雌魚(yú)VTGα mRNA的表達(dá)水平都呈下降趨勢(shì)。有研究表明，雌魚(yú)暴露在雄激素中會(huì)導(dǎo)致VTGα mRNA的表達(dá)水平下降[12]。這與作者發(fā)現(xiàn)的寶崗大道段、洪德路段采樣點(diǎn)中雌魚(yú)的形態(tài)出現(xiàn)了第4臀鰭條長(zhǎng)度延長(zhǎng)、第3臀鰭條分節(jié)數(shù)增多，第14、15、16椎體脈棘向前彎曲等雄性化現(xiàn)象是一致的[13]。因此推測(cè)雌魚(yú)VTGα的表達(dá)水平下降表明廣州河涌城市廢水中可能存在類雄激素相關(guān)的化合物，抑制了食蚊魚(yú)VTG α的表達(dá)，從而出現(xiàn)不同程度的雄激素效應(yīng)。而赤崗路段點(diǎn)雌魚(yú)VTGα的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，一方面可能因?yàn)榇瞬蓸狱c(diǎn)的雌魚(yú)處于卵黃生成期，在此期間生成大量卵黃蛋白原；另一方面也可能因?yàn)辄S埔涌中雌激素/類雌激素效應(yīng)較強(qiáng)，導(dǎo)致VTGα表達(dá)上升，致使性腺發(fā)育提前。具體原因仍需作進(jìn)一步探究。但結(jié)合作者同期的研究發(fā)現(xiàn)海珠涌及黃埔涌的雌魚(yú)出現(xiàn)雄性化征狀，可以推斷廣州城市廢水中存在雄激素或類雄激素化合物，促使雌魚(yú)雄性化[13]。

食蚊魚(yú)具有兩個(gè)由不同基因編碼的雄激素受體，稱之為ARα和ARβ。Sone等[14]研究表明臀鰭中ARα mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與雄激素物質(zhì)的含量之間具有較好的劑量效應(yīng)曲線，雄魚(yú)受到雄性激素的作用之后，臀鰭中AR的表達(dá)增加，促使臀鰭變成了生殖足。Ogino[15]認(rèn)為雌魚(yú)臀鰭的延長(zhǎng)依賴于臀鰭上基因的表達(dá)，自然條件下這些基因受魚(yú)體內(nèi)源激素的調(diào)控，但也可以受到外界激素的影響，水體中的雄激素物質(zhì)可以直接結(jié)合臀鰭上的受體發(fā)揮作用。Larsson等[16]研究認(rèn)為，造紙廢水中含有大量性腺雄激素受體的配體，能激活雄激素受體，引起魚(yú)類的雄性化。因此，ARα mRNA的表達(dá)水平可以作為生物標(biāo)記物監(jiān)測(cè)水體雄激素污染。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照點(diǎn)相比，雌魚(yú)ARα的表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)，其中海珠涌的采樣點(diǎn)寶崗大道段、洪德路段顯著升高，而黃埔涌的采樣點(diǎn)有升高趨勢(shì)但差別不明顯。結(jié)合實(shí)地觀察分析，海珠涌附近有大量工業(yè)區(qū)、居民區(qū)，日排污量大，水質(zhì)烏黑甚至發(fā)出惡臭，污染程度嚴(yán)重；而黃埔涌的河涌寬大，水質(zhì)較為清澈，除了食蚊魚(yú)外還能見(jiàn)到大量其他品種如鯽魚(yú)、羅非魚(yú)、鯉魚(yú)，污染程度較低。另外在同期的研究中，作者也發(fā)現(xiàn)海珠涌的寶崗大道段、洪德路段點(diǎn)及黃埔涌苗藝路段點(diǎn)中雌魚(yú)的形態(tài)出現(xiàn)了第4臀鰭條長(zhǎng)度延長(zhǎng)、第14、15、16椎體脈棘向前彎曲等雄性化現(xiàn)象，但黃埔涌赤崗路段點(diǎn)無(wú)明顯差異[13]。實(shí)際上水環(huán)境中的雄激素含量并不高，但生活在其中的魚(yú)是世代暴露的，在長(zhǎng)期的不斷暴露下，低劑量的雄激素經(jīng)過(guò)時(shí)間累積可以對(duì)食蚊魚(yú)產(chǎn)生了影響。初步推測(cè)海珠涌存在某些化合物具有雄激素配體的結(jié)構(gòu)，直接與食蚊魚(yú)臀鰭的AR進(jìn)行結(jié)合，誘導(dǎo)其發(fā)生表達(dá)，從而引起了雌魚(yú)臀鰭的延長(zhǎng)、分節(jié)數(shù)增多。而黃埔涌上游赤崗路段及下游苗藝路段具有差異性，則可能因?yàn)樗h(huán)境中除了存在雄激素物質(zhì)外，還存在其他大量的抗雄激素物質(zhì)(雄激素受體抑制劑)及雌激素。化學(xué)物成分復(fù)雜，具體差別仍需要進(jìn)一步檢測(cè)黃埔涌中內(nèi)分泌干擾物的含量[13]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生活在受廢水污染的河涌中雌性食蚊魚(yú)的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ARα較之對(duì)照點(diǎn)明顯升高。根據(jù)目標(biāo)基因表達(dá)的結(jié)果同時(shí)結(jié)合作者同期的研究發(fā)現(xiàn)，海珠涌及黃埔涌的雌魚(yú)出現(xiàn)形態(tài)雄性化征狀，推測(cè)廣州城市廢水中存在雄激素或類雄激素化合物，致使雌性食蚊魚(yú)表現(xiàn)雄激素效應(yīng)。

3.2 廣州河涌城市廢水暴露致雄性食蚊魚(yú)雌激素效應(yīng)

本研究中，廣州海珠涌和黃埔涌中除苗藝路段點(diǎn)外，其余各點(diǎn)的成年雄性食蚊魚(yú)性腺中的CYP19α表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化。Carreau等[17]對(duì)10多種魚(yú)類芳香化酶的分布進(jìn)行比較總結(jié)，發(fā)現(xiàn)P450aromA主要在這些魚(yú)的卵巢中表達(dá)，在睪丸和腦中僅微量存在。同時(shí)Tong[18]也發(fā)現(xiàn)CYP19α主要在卵巢表達(dá)，雄魚(yú)在精巢間質(zhì)細(xì)胞中僅有少量表達(dá)，合成的雌激素參與維持精原細(xì)胞增殖。故因其微量存在表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。芳香化酶的調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜，目前的研究結(jié)果不相一致，還沒(méi)有形成統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。本研究中雄性食蚊魚(yú)性腺中的CYP19α表達(dá)水平?jīng)]有出現(xiàn)明顯變化的原因則還有待作進(jìn)一步研究。

目前已經(jīng)有許多研究采用不同魚(yú)種的卵黃蛋白原(VTG)作為生物標(biāo)志物對(duì)環(huán)境雌激素效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。Orlando等[19]發(fā)現(xiàn)造紙廢水中存在的雄激素物質(zhì)在水環(huán)境中很容易被轉(zhuǎn)化為雌激素物質(zhì)，從而引起了魚(yú)類產(chǎn)生雌激素效應(yīng)，誘發(fā)雄魚(yú)VTG基因的表達(dá)。Matthiessen等[20]對(duì)污染較重的河流中鯰魚(yú)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，89%以上的雄魚(yú)出現(xiàn)卵黃蛋白原基因表達(dá)，近17%的雄魚(yú)出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象。加拿大學(xué)者對(duì)11家造紙廠排放的廢水進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雄性黑頭呆魚(yú)暴露于20%和40%濃度后，其VTG的表達(dá)顯著升高[21]。近年探索應(yīng)用食蚊魚(yú)的卵黃蛋白原(VTG α)基因轉(zhuǎn)錄水平為指標(biāo)，評(píng)價(jià)廣東東莞寒溪河受雌/雄激素物質(zhì)污染現(xiàn)狀的研究已有報(bào)道，其研究結(jié)果顯示，生活在東莞寒溪河中的雄性食蚊魚(yú)受雌激素物質(zhì)干擾明顯，普遍出現(xiàn)顯著的雌激素效應(yīng)，表明寒溪河水體受雌激素物質(zhì)污染更嚴(yán)重[22]；同時(shí)進(jìn)行了室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)，研究了該地(樟村)污水處理廠出水原液不同濃度暴露對(duì)食蚊魚(yú)的形態(tài)雌性化生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果顯示，雄魚(yú)肝臟VTGα mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，并且其升高趨勢(shì)與暴露濃度相一致，表明雄性食蚊魚(yú)雌性化明顯，這表明，東莞城市廢水中存在能致食蚊魚(yú)發(fā)生雌激素效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)[23]；該作者進(jìn)一步對(duì)東莞寒溪河水體雌激素物質(zhì)含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)，東莞寒溪河水域中雌激素類物質(zhì)雌酮(E1)和雙酚A(BPA)分別為1.34～18.32 ng· L-1和33.84～45 766.41 ng·L-1，因此推測(cè)廢水中E1和BPA在引起當(dāng)?shù)厮蚴澄敏~(yú)雌激素效應(yīng)中起到重要作用[24]。本研究結(jié)果與上述的研究相一致，廣州海珠涌和黃埔涌夏季和冬季所有采樣點(diǎn)的雄魚(yú)VTGα表達(dá)水平顯著升高，其中黃埔涌比海珠涌變化更為顯著，有的采樣點(diǎn)高達(dá)20多倍。因此推測(cè)廣州河涌城市廢水中可能存在類雌激素相關(guān)的化合物，誘導(dǎo)VTGα mRNA的表達(dá)，從而出現(xiàn)不同程度的雌激素效應(yīng)。但是本文作者的同期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管生活在廣州海珠涌和黃埔涌中4個(gè)采樣點(diǎn)成年雄性食蚊魚(yú)第4臀鰭條的長(zhǎng)度值顯著小于對(duì)照點(diǎn)，但是所有采樣點(diǎn)的成年雄性食蚊魚(yú)第4：6臀鰭條長(zhǎng)度比值則無(wú)明顯差異。此外，各采樣點(diǎn)成年雄性食蚊魚(yú)第14、15、16椎體脈棘的P值、P:D和P:L比值沒(méi)有明顯變化[13]。這些結(jié)果表明，分子效應(yīng)與形態(tài)變化的效應(yīng)存在差異，食蚊魚(yú)VTGα mRNA的表達(dá)量雖然提高而表現(xiàn)雄性食蚊魚(yú)產(chǎn)生雌激素效應(yīng)，但效應(yīng)的強(qiáng)弱將可能決定雄性食蚊魚(yú)骨骼形態(tài)雌性化的效果。

雌激素的生物學(xué)效應(yīng)主要通過(guò)其特異性受體雌激素受體的介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。不少研究發(fā)現(xiàn)暴露城市廢水的雄性食蚊魚(yú)ERα表達(dá)水平升高，引起雄魚(yú)雌性化效應(yīng)[25]。同時(shí)雌激素基因受體、芳香化酶基因敲除后的雄性小鼠會(huì)出現(xiàn)不育[26]。本研究中，雄魚(yú)ERα表達(dá)水平在寶崗大道段、赤崗路段點(diǎn)有明顯升高的趨勢(shì)(P<0.05)，其余各點(diǎn)無(wú)明顯變化。可見(jiàn)海珠涌和黃埔涌中的食蚊魚(yú)存在雌激素效應(yīng)，但效應(yīng)強(qiáng)弱在不同各采樣點(diǎn)具有差異。其中無(wú)論夏季還是冬季，赤崗路段點(diǎn)雄魚(yú)ERα的表達(dá)水平顯著上升(P< 0.05)，同時(shí)VTGα的表達(dá)中，赤崗路段點(diǎn)高達(dá)20多倍，故可以初步推測(cè)黃埔涌的赤崗路段段存在顯著的雌激素效應(yīng)。

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Transcription Levels of Sex Hormone Genes in Liver of Mosquitofish in the Creek of Guangzhou City

Zhang Xiaochan1,Wen Rushu2,Fang Zhanqiang1,*

1.Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education,College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou 510631,China
2.College of Life Science,Jiaying University,Meizhou 514015,China

31 July 2015 accepted 8 October 2015

The cytochrome P450 aromatase(CYP19α),vitellogenin(VTGα)and estrogen/androgen receptor(ER α/ARα)genes mRNA transcriptional levels in mosquitofish(Gambusia affinis)were detected in order to monitor the pollution status of environmental estrogen/androgen substances in the creek of Haizhu and Huangpu,Guang-zhou city.The results showed that,theCYP19α mRNA transcription levels in gonad of female mosquitofish from sampling sites of Haizhu Baogang Avenue(BG),Hongde Road(HD)and Huangpu Chigang Road(CG),Miaoyi Road(MY)significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)when compared with the control point of Huashi(REF); theVTGα mRNA transcription levels in liver of male mosquitofish from sampling sites of BG,HD and MY significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)except CG when compared with the control point of REF;theARα mRNA transcription levels in anal fin of female mosquitofish from all sampling sites significantly increased(P< 0.05 orP<0.001)in summer and winter.Except CG in summer and MY in winter theCYP19α mRNA transcription levels in gonad of male mosquitofish were not significantly different in other sampling sites;theVTGα mRNA andERα mRNA transcription levels in male mosquitofish from all sampling sites significantly increased(P< 0.05 orP<0.001)except HD and MY when compared with the control point of REF.The results indicated that, VTGα genes in liver andCYP19α genes in gonad of female mosquitofish were subject to different degrees of inhibition,andARα mRNA transcription level was significantly higher than that in the REF,showing the effects of androgens.TheVTGα mRNA andERα mRNA transcription level in male mosquitofish were significantly higher than that in the REF,andCYP19α gene expression in male mosquitofish was not significantly different,showing the effects of estrogens.Mosquitofish in the creek of Haizhu and Huangpu were significantly influenced by estrogen/androgen material interference,and the environmental hormone pollution in the creek of Guangzhou city was very serious.

environmental hormones;Gambusia affinis;the creek of Guangzhou city;target gene;mRNA expression;biochemistry

2015-07-31 錄用日期：2015-10-08

1673-5897（2016）3-115-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150731002

簡(jiǎn)介：方展強(qiáng)(1953—)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物生態(tài)毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文170余篇。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B030800006)；廣東高校城市水環(huán)境生態(tài)治理與修復(fù)工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目(2012gezxA004)

張曉嬋(1988-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物生態(tài)毒理學(xué)，E-mail:390267054@qq.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:fangzhq@scnu.edu.cn